粮食检验 粮食中玉米赤霉烯酮测定 胶体金快速定量法（编制说明）

《粮食检验粮食中玉米赤霉烯酮测定胶体金快速定量法》编制说明 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 起草组2014年8月《粮食检验粮食中玉米赤霉烯酮测定胶体金快速定量法》编制说明玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，主要由禾谷镰刀菌产生。它首先从有赤霉病的玉米中分离得到，是一种酚的二羟基苯酸的内酯结构，分子式为C18H22O5。玉米赤霉烯酮常污染玉米小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。玉米赤霉烯酮具有雌激素的作用，其强度为雌激素的十分之一，可造成家禽和家畜的雌激素水平提高。目前发现，猪对此毒素较为敏感。玉米赤霉烯酮作用的靶器官主要是雌性动物的生殖系统，同时对雄性动物也有一定的影响，可使家畜，家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症。妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产、死胎和畸胎。由于玉米赤霉烯酮具有以上危害，已经被联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）确定为最危险的自然发生的食品污染物之一。我国国家标准GB2761-2011（食品中真菌毒素限量）中对谷物及其制品中的ZEN最高限量 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 为60ug/kg。目前，对于小麦、大麦、玉米等谷类作物中玉米赤霉烯酮的测定方法有酶联免疫吸附法（ELISA）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、和高效液相色谱法-质谱法（HPLC-MS）。ELISA法测定结果受试剂盒差异、实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大。GC、GC-MS、HPLC和HPLC-MS法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度易受样品的净化、浓缩等步骤的影响，耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 周期。这些检测方法无一例外要求在检测过程使用毒素标准溶液，给环境和检测人员造成安全风险；且只适合在实验室条件下进行。受上述诸多方面的局限，这些标准都不能适应基层现场检验的应用。近年来，根据我国食品安全的形势，粮食行业积极开展粮食质量检验和卫生安全监测工作。检验、监测和及时处置对检测有较高的时效性要求。快速简便、准确可靠、成本低廉且适合基层应用的真菌毒素检测方法成为当前形势下粮食行业的迫切需求。本标准项目是通过化学合成法制备玉米赤霉烯酮人工抗原，利用此抗原免疫实验动物制备ZEN单克隆抗体，基于此原料基础上开发ZEN胶体金免疫层析快速检测试纸条，再通过光学扫描读数仪进行玉米、小麦等样品中ZEN的定量分析。本标准有助于高效开展粮食安全监测检验，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。1工作简况1.1任务来源及起草单位本行业标准是在2012年12月国家粮食局标准质量中心组织对美国Charm公司开发的ROSA真菌毒素快速定量测试系统进行测试验证，并对验证结果进行专家评审通过的基础上提出并立项。根据2014年粮油行业标准制定 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的要求，安排由山西粮食质量监测中心牵头负责《粮油检测粮食中玉米赤霉烯酮测定胶体金快速定量法》起草工作。起草单位成立的标准起草组负责进行本标准的各项工作。1.2标准研制主要工作过程（1）2014年6月，根据本标准项目任务所需，查询了国内外相关资料，梳理归纳了近年来对该类快检产品的初步应用情况，在湖北省武汉市进行了第一次专家研讨会。与会专家结合应用需求对前期验证结果进行了讨论，针对标准文本草案和编制说明等提出了编制意见和建议。（2）2014年7月初，起草组对胶体金快速检测设备的研发、生产和应用情况进行考察调研，就本标准涉及的有关技术 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 作了交流和探讨，征询收集了多方意见建议。在此基础上，起草形成了《粮油检测粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定胶体金快速定量法》草案及编制说明。（3）2014年7月下旬，项目组在山西太原召开了第二次起草小组讨论会。标准起草单位对所拟标准草案和编制说明作编写介绍，并对其说明进行了详细审校和充分讨论。（4）2014年8月至9月，结合上次研讨会议的专家审校意见，作了标准编制和方法应用等方面的完善工作。（5）2014年9月，形成本标准的送审讨论稿。2标准的编制原则和标准的主要内容2.1标准编制原则本标准的编制遵循标准化法规，根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构与编写规则》、GB/T20001.4-2009《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的规定进行编制的。2.2标准主要内容标准的主要内容有：适用范围、规范性引用文件、原理、试剂和材料、仪器设备、测定步骤、结果表示和精密度8项。3.标准主要技术内容的确立及依据3.1技术依托和验证评价鉴于目前能够形成商业化的胶体金快速定量技术，且经过国家粮食局标准质量中心组织通过验证测试的公司只有北京博欧实德生物技术有限公司，因此本标准的具体操作方法参照该公司的CharmROSA真菌毒素快速检测仪的具体操作方法作为模版，按照国际标准的惯例，标注“美国Charm公司生产的ROSA胶体金快速定量检测卡是通过粮食行业验证的产品，提供此信息仅为了方便本标准的使用者，而并不是对ROSA真菌毒素快速定量检测系统的认可。任何可以得到与其方法结果相同的产品均可使用”的说明，确保对其它厂家胶体金快速定量产品也能同样适用于此标准。本方法有关技术性能的验证与评价，是依据GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》，并参考了SN/T2775-2011《商品化食品检测试剂盒评价方法》的有关技术要求。3.2测定原理利用免疫层析原理，试样提取液中玉米赤霉烯酮与测试卡中胶体金微粒发生呈色反应，颜色深浅与试样中玉米赤霉烯酮含量相关。反应完成后，用读数仪测定颜色深浅，根据颜色深浅计算出试样中玉米赤霉烯酮含量。3.3适用范围本标准在验证中，对玉米、小麦、大米等不同基质的样品进行了测试。另有相关文献和应用表明，胶体金方法可对以上各品种之外的其他谷物如燕麦、大麦、等谷物及其制品进行玉米赤霉烯酮定量检测（见表3和表4）。因此本标准规定了胶体金法可用于测定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮。3.4测定条件和步骤胶体金方法的测定步骤大体分为样品处理、检测卡孵育和读数仪测读结果三部分。鉴于目前胶体金快速检测同类产品规格性能的差别，在测定条件、步骤和具体操作上也有所不同。充分考虑到这一情况，本标准既给以明确详细的测定步骤和条件，同时又以“注”的形式，对所给定步骤和条件作了必要说明，以方便标准使用者。3.5关于样品制备的要求样品的数量、均匀性决定样品的代表性。试验样品的粒度大小影响毒素的提取效果，从而影响测定结果。本行业标准直接采用国家标准方法GB5491《粮食、油料检验扦样、分样法》中对样品的一般要求，试样的质量为500g，试样粉碎粒度的要求为可全部通过20目筛。与现行毒素检测国标方法要求一致。4.方法主要指标的验证分析本标准的方法学指标的设置，是依据国家粮食局标准质量中心组织的对该胶体金快速定量检测系统的验证测试结果，以及有关使用方的应用数据而确定。4.1检测限和定量限验证测试中取24个无污染（阴性）样品的测定结果进行计算，检测限（LOD）为测定平均值加3倍标准偏差，定量限(LOQ)为测定平均值加10倍标准偏差。测试结果得出，玉米赤霉烯酮的LOD为5ug/kg，LOQ为14ug/kg（见2012验证测试报告附件表六）。本标准据此设定检测限为15ug/kg。4.2线性范围以高效液相色谱法检测结果为横坐标，ROSA快速检测法的检测结果为纵坐标，计算线性范围：30～1000ppb（7点）；回归方程:y=0.84x+35.1；相关系数r为0.998（见2012年验证测试报告附件图四）。图四：玉米赤霉烯酮HPLC和ROSA两种方法检测值线性关系4.3准确性（1）与标准方法比较ROSA测试条与高效液相色谱标准方法分别对14组阳性样品进行检测，采用配对t检验法比较两种方法的检测结果是否存在显著性差异。经计算，tD=0.3，查t分布表，t0.05,13=2.16，tD=0.3<t0.05,13=2.16，说明液相参考值与ROSA测定值之间无显著差异（见附件表八）。表八：玉米赤霉烯酮:配对t-检验浓度单位：ppb 序号 参考浓度 ROSE均值 Di D均值 sD tD t0.05,13 1 99 107.8 8.8 -4.8 53.79609 0.3 2.16 2 254 274.0 20.0 3 1004 866.9 -137.1 4 1004 886.4 -117.6 5 30 35.6 5.6 6 60 71.6 11.6 7 100 150.4 50.4 8 30 30.8 0.8 9 60 66.5 6.5 10 30 46.2 16.2 11 60 89.7 29.7 12 100 129.8 29.8 13 30 30.1 0.1 14 60 68.3 8.3 （2）正确度将高效液相色谱法的测定结果作为认定值，ROSA快速测试条的测定结果与之比较，按正确度（%）=检测值/认定值×100计算。仅用CHARM提供的有证参考物质进行统计，则正确度范围在86.3%～113.9%之间，平均为102%（见附件3表七）；若将剔除异常值之后的中国样品参与统计，则正确度范围在86.3%～153.9%之间，平均为117%（见附件表六）。另有应用测试对阳性样品用不同方法测定的正确度进行了验证和比较：以Charm公司提供的浓度为99μg/kg和1004μg/kg的阳性小麦样品为检测对象，按照本方法的测定步骤，用不同批次试剂条以及分不同时间进行胶体金定量检测，每次做平行检测。用液相色谱-质谱检测方法（LC-MS）测定同一阳性样品的玉米赤霉烯酮含量，比较两种方法的结果的正确度。结果见表1。表1玉米赤霉烯酮阳性样品测试结果及正确度比较单位：μg/kg，% 阳性样品定值 LC-MS测试 胶体金试纸卡测试 测定值 正确度 测定值 正确度 测定值 正确度 测定值 正确度 99 98.5 99.5 105 106.1 102 103.0 95 96.0 1004 1050 104.6 990 98.6 1025 102.1 986 98.2 试纸卡批次 —— B004001A-10 J008006B-15 测试日期 —— 2014.03.17 2014.03.17 2014.05.07结果显示，液相色谱测试结果的正确度范围在99.5%~104.6%之间，胶体金定量检测试纸卡批次内和批次间的定量检测结果的正确度范围在98.2%~106.1%之间。两种方法检测结果的正确度具有较高一致性。表明玉米赤霉烯酮免疫胶体金定量检测方法的分析结果具有较高的准确性。4.4重复性6个参与测试人员在相同实验室，按照同一方法，采用不同设备，检测相同样品，进行重复性验证。仅用CHARM提供的有证参考物质进行统计，则变异系数范围在8.4%～32.6%之间，平均为15%（见附件表七）；若将剔除异常值之后的中国样品参与统计，则变异系数范围在8.4%～32.6%，平均变异系数为17.3%（见附件表六）。4.5特异性选取阴性玉米样品，加入玉米赤霉烯酮标准溶液及其它标准物质如表2，按本方法予以测定。结果如下：表2：特异性实验浓度单位：μg/kg 试验毒素 添加浓度 测试结果 展青毒素 250 —（阴性） 伏马毒素 500 —（阴性） 呕吐毒素 500 —（阴性） 桔青毒素 250 —（阴性） 赭曲霉毒素 500 —（阴性） 黄曲霉毒素B1 50 —（阴性） 玉米赤霉烯酮 100 118结果表明，玉米赤霉烯酮胶体金试纸条对上述其他毒素并无交叉反应，其方法特异性可以能满足检测要求。4.6其它种类样品验证测试表3：小米粉加标回收率验证 次数 小米粉阴性样品 加标100μg/kg 回收率％ 加标250μg/kg 回收率％ 加标1000μg/kg 回收率％ 1 25 130 105.00 245 88.00 985 96.00 2 26 140 114.00 278 100.80 1025 99.90 3 24 132 108.00 267 97.20 1156 113.20 4 25 135 110.00 285 104.00 1208 118.30 5 24 128 104.00 283 103.60 1230 120.60 平均 108.20 98.72 109.60 RSD% 3.72 6.67 10.08表4大米粉加标回收率验证 次数 大米粉阴性样品 加标100μg/kg 回收率％ 加标250μg/kg 回收率％ 加标1000μg/kg 回收率％ 1 0 98 98.00 285 114.00 985 98.50 2 0 98 98.00 235 94.00 1025 102.50 3 0 115 115.00 253 101.20 1156 115.60 4 0 109 109.00 307 122.80 1208 120.80 5 0 106 106.00 267 106.80 1230 123.00 平均 105.20 107.76 112.08 RSD% 6.97 10.36 9.814.7同类产品应用验证据应用方（某检测机构）采用国内某公司的胶体金快速定量产品及相应测定方法，对四份不同毒素含量的玉米样品进行了准确性和重复性应用验证，结果见表a和表b。表a试纸条测定ZEA的准确性 序号 样品号 粮种 HPLC测定值(μg/kg) 胶体金测定值(μg/kg) 偏差% 测定值1 测定值2 平均值 1 735 玉米 55.43 50.87 57.31 54.09 -2.42 2 778 54.90 53.83 54.48 54.16 -1.35 3 876 44.45 39.04 39.24 39.14 -11.95 4 1257 161.10 151.07 167.23 159.15 -1.21表b试纸条测定ZEA的重复性 样品 玉米 样品号 778# 测定次数 胶体金法测定值 1 55.22 2 59.41 3 55.47 4 58.93 5 53.83 6 54.48 平均值μg/kg 56.22 标准偏差% 2.36 变异系数% 4.20由表a和表b可知，胶体金法与国家标准方法（HPLC）比较，偏差在-1.21%～-11.95%之间；重复性测定的变异数数为4.20%，满足本标准设定的重复性要求。表六：玉米赤霉烯酮检测数据分析表（含中国样品）浓度单位：ppb 序号 样品名称 样品来源 参考浓度 ROSA检测结果 平均值 标准偏差 变异系数（%） 正确度（%） 北京 山西 河南 安徽 湖北 陕西 1 玉米 CHARM ND 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0.54 1.32 /　　 　/ 2 ND 0 0 6 2 0 2 0 1 0 0 0 0 3 99 129 105 118 102 118 133 85 90 116 116 93 88 107.8 16.3 15.1 108.8 4 254 249 245 249 332 288 258 262 240 320 255 299 291 274.0 31.0 11.3 107.9 5 1004 860 834 792 818 1012 1112 930 878 786 771 751 859 866.9 106.0 11.0 86.3 6 1004 868 752 852 828 944 913 700 904 1080 919 890 987 886.4 100.3 88.3 7 北京 30 43 30 28 44 34 42 29 36 29 33 42 37 35.6 6.0 16.8 118.6 8 60 74 78 48 63 83 85 85 74 63 52 88 66 71.6 13.2 18.5 119.3 9 100 155 121 191 189 181 214 112 123 147 159 93 120 150.4 37.6 25.0 150.4 10 小麦 CHARM 30 28 37 50 50 29 23 24 22 20 29 27 30 30.8 10.0 32.6 102.5 11 60 64 81 69 66 64 62 69 58 65 83 61 56 66.5 8.2 12.4 110.8 12 北京 30 44 58 68 66 41 33 44 39 44 43 40 34 46.2 11.6 25.1 153.9 13 60 86 84 100 130 104 89 53 52 104 97 88 89 89.7 21.3 23.8 149.4 14 100 132 109 169 158 130 156 121 116 154 138 138 134 132.8 15.1 11.3 132.8 15 大米 CHARM 30 31 27 40 25 34 30 32 29 26 31 30 26 30.1 4.1 13.8 100.3 16 60 62 78 66 73 73 75 66 71 61 70 63 62 68.3 5.8 8.4 113.9 平均值 17.3 117.4 备注：1采用玉米的阴性样品24个测定值计算LOD为5ppb，LOQ为14ppb；2、经Grubb检验，斜体数据为异常值,剔除。表七：玉米赤霉烯酮检测数据分析表（仅CHARM参考物质）浓度单位：ppb 序号 样品名称 样品来源 参考浓度 ROSA检测结果 平均值 标准偏差 变异系数（%） 正确度（%） 北京 山西 河南 安徽 湖北 陕西 1 玉米 CHARM ND 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0.54 1.32 /　　 　/　 2 ND 0 0 6 2 0 2 0 1 0 0 0 0 3 99 129 105 118 102 118 133 85 90 116 116 93 88 107.8 16.3 15.1 108.8 4 254 249 245 249 332 288 258 262 240 320 255 299 291 274.0 31.0 11.3 107.9 5 1004 860 834 792 818 1012 1112 930 878 786 771 751 859 866.9 106.0 11.0 86.3 6 1004 868 752 852 828 944 913 700 904 1080 919 890 987 886.4 100.3 88.3 7 小麦 CHARM 30 28 37 50 50 29 23 24 22 20 29 27 30 30.8 10.0 32.6 102.5 8 60 64 81 69 66 64 62 69 58 65 83 61 56 66.5 8.2 12.4 110.8 9 大米 CHARM 30 31 27 40 25 34 30 32 29 26 31 30 26 30.1 4.1 13.8 100.3 10 60 62 78 66 73 73 75 66 71 61 70 63 62 68.3 5.8 8.4 113.9 平均值 14.9 102.4 备注：1采用玉米的阴性样品24个测定值计算LOD为5ppb，LOQ为14ppb；2、经Grubb检验，斜体数据为异常值,剔除。5.关于本标准的附录鉴于目前胶体金试纸卡快速检测产品较多，但其质量性能存在差异，在使用方法上也有所不同，为了保证同类产品检测性能适用于本方法，方便使用者选用同类胶体金快速检测产品，本标准提供了规范性附录A“胶体金快速定量检测产品的性能评价要求”。其中对胶体金快速定量检测产品设立了相关指标，这些指标值的设置是参照GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F“检测方法确认的技术要求”，用于对胶体金快速定量检测类产品的技术性能进行验证，以确认其适用于本方法。6.采用国际标准和国外先进标准的情况，以及与国际、国内同类标准或样品测试的对比情况目前，本方法标准未采用国际标准和国外先进标准。7.与有关的现行法律、法规和强制性国家标准、行业标准的关系本标准与粮食卫生、质量有关法律法规、强制性国家标准及现行行业标准在目的上保持一致。8.重大分歧意见的处理经过和依据目前无重大分歧意见。9.按照标准化法的有关规定，提出强制性标准或推荐性标准的建议本标准属于方法类标准，建议将本标准作为推荐性粮食行业标准颁布实施。10.结论本标准建立了一种简单、快速、灵敏的玉米赤霉烯酮免疫胶体金定量检测技术，该方法技术指标满足了粮食行业内对玉米赤霉烯酮检测的有关要求。可作为粮食中玉米赤霉烯酮的定量筛选方法，适合在各类实验室尤其是现场查验中推广使用。同时，对涉及本标准的法规、规则等诸多方面作了较全面的分析论述，本编制说明对本标准的制定和发布施行，提供应有的参考作用。参考文献：[1]倪梅林，殷居易，曹苏仙.2种检测粮食中玉米赤霉烯酮的免疫技术比较.安徽农业科学,2006,34(14):3416,3449.[2]张鹏,张艺兵,鲍蕾等.出入境粮谷中玉米赤霉烯酮检测方法的研究.检验检疫科学,2003,13(2):8-10.[3]金标试纸法和酶联免疫法检测玉米赤霉烯酮的对比研究.安徽农业科学,2007,35(18):5341-5360.[4]孙秀兰,邵景东,王俊双.粮油食品中玉米赤霉烯酮危害及风险分析.粮食与油脂,2006,3：41-43.[5]袁克，邵景东，王俊双等.食品中玉米赤霉烯酮的分布及其检测方法.杭州食品科技,2009,1:1-4.[6]王俊双,许定花,孙秀兰.食品中玉米赤霉烯酮三种检测方法的比较研究,2008,29(2):287-290.[7]何敏,王一凡,邓衔柏.玉米赤霉烯酮（DON）检测方法研究进展.中国动物检疫,2008,25(4):40-43.[8]樊平声,沙国栋,沈培根等.玉米赤霉烯酮毒性和检测方法研究进展.检验检疫学刊,2010,20(1):39-41.[9]游淑珠,许杨.玉米赤霉烯酮分析方法的现状.卫生研究,2005,34(1):122-125.[10]梁颖,张春晖,刘邻渭.液相色谱-质谱测定小麦B类单端孢霉烯族毒素.中华预防医学杂志,2006,40(4):293-295.余增丽，张立实，吴德生，玉米赤霉烯酮对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响[J]。中国预防医学杂志，2005，39（5）:328-331本标准起草组2014.09