一清颗粒微生物限度检查法验证记录文件编号：XXX-XX-XX制定人:年月日审批会签：批准人：年月日生效日期：年月日XXXX制药有限责任公司XX年XX月XX日一清颗粒微生物限度检查法
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一清颗粒由XXXXXXXX药材制成，有XXXXX作用。根据其用药途径和处方，应进行需氧菌总数、霉菌数和酵母菌总数的测定及控制菌大肠埃希菌检查。本品参照2015版药典进行过方法适用性验证没有发现抑菌性，所以确定需氧菌总数、霉菌数和酵菌总数及大肠埃希菌采用常规法测定。经对所采用的方法适用性进行试验，符合《中国药典》2020版四部1105非无菌产品微生物限度检查的微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度控制菌检查法与1107非无菌药品微生物限度标准，方法可行。一清颗粒微生物限度检查法标准正文微生物限度：按微生物限度检查法（《中国药典》2020版四部1105非无菌产品微生物限度检查的微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度控制菌检查法与1107非无菌药品微生物限度标准。取样品10克，加PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制备成溶解均匀的1：10供试液。 需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数取本品1：10供试液1ml，注皿，平行制备平皿(2个平皿需氧菌总数和2个平皿霉菌与酵母菌总数)，按平皿法测定。大肠埃希菌取本品1：10供试液10ml直接接至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。《中国药典》非无菌制剂项下标准规定：需氧菌总数103cfu/g;霉菌和酵母菌总数102cfu/g;不得检出大肠埃希菌(1g)。一清颗粒生物限度检查方法适用性试验1、样品名称：一清颗粒批号 XXX、XXX、XXX 2、验证用菌种：铜绿假单胞菌CMCC﹙B﹚10104、、枯草杆菌CMCC﹙B﹚63501、金黄色葡萄球菌CMCC﹙B﹚26003、白色念珠菌CMCC﹙F﹚98001、黑曲霉CMCC﹙F﹚98003大肠埃希菌CMCC﹙B﹚44102.3．实验方法：《中国药典》2015版四部微生物限度方法适用性检查验证实验。4．操作方法4.1菌液制备4.1.1取30～35℃培养18～24小时的铜绿假单胞菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的胰酪大豆胨培养物，以0.1ml+9.9ml的ph7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，稀释至使菌数不大于100cfu/ml，做活菌计数备用。4.1.2取20～25℃培养18～24小时白色念珠菌液体培养物以0.1ml+9.9ml的ph7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，稀释至使菌数不大于100cfu/ml，做活菌计数备用。4.1.3取20～25℃培养7天的黑曲霉斜面培养物,加入适量含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液洗脱霉菌孢子，吸取出孢子悬液后以0.1ml+9.9ml的ph7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，稀释至使菌数不大于100cfu/ml，做活菌计数备用。4.2供试液制备取供试品10克,加入PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100ml，制成1：10供试液，分别人工污染上述五种代表试验菌株。4.3测定法:常规法测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数：取1:10供试1ml加入平皿中,立即加入15～20ml胰酪大豆胨琼脂培养基,平行制备2个皿，混匀，待凝固后置30～35℃培养箱培养3天，按平皿法测定需氧菌总数。取供试液1ml加入平皿中,立即加入15～20ml沙氏葡萄糖琼脂培养基,平行制备2个皿，混匀，待凝固后置20～25℃培养箱培养5天，按平皿法测定霉菌与酵母菌总数。4.4回收率4.4.1试验组：取供试液1:10供试液9.9ml共5份，每份加入0.1ml的要求试验菌悬液摇匀，分别从试验菌试管中吸取1ml至平皿中，立即加入胰酪大豆胨琼脂培养基,每种试验菌平行制备2个皿，待凝固后置30～35℃培养箱培养3天观察结果，另从真菌试管中分别吸取1ml至平皿中立即加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个皿，待凝固后置20～25℃培养箱培养5天观察结果。4.4.2活菌组测定每一菌株的试验菌数4.4.3供试液组测定供试品本底菌数4.4.4稀释剂对5.试验结果表1一清颗粒微生物限度检查（需氧菌总数）方法适用性验证﹙常规法﹚实验次数人工染菌回收率%铜绿假单胞菌﹙%﹚枯草杆菌﹙%﹚金黄色葡萄球菌﹙%﹚白色念珠菌﹙%﹚黑曲霉﹙%﹚19797.0101.195.498.7292.296.396.694.294.83103.910096.697.794.8试验结果表2一清颗粒微生物限度检查（霉菌和酵母菌总数）方法适用性验证﹙常规法﹚实验次数人工染菌回收率%铜绿假单胞菌﹙%﹚枯草杆菌﹙%﹚金黄色葡萄球菌﹙%﹚白色念珠菌﹙%﹚黑曲霉﹙%﹚1∕∕∕98.8952∕∕∕10098.83∕∕∕95.995从表1-2可看出，采用常规法测定一清颗粒供试品，人工污染5种代表菌株，该供试品对金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌、枯草杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率试验均在50～200%之间，所有采用常规法检验。6、结论：根据验证结果，确定一清颗粒微生物检查法为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数可采用常规法测定。7、控制菌大肠埃希菌7.1试验菌株：大肠埃希菌阴性对照菌：金黄色葡萄球菌样品批号：20XX1001培养基：100ml胰酪大豆胨液体培养基试验方法：常规法取本品1：10供试液10ml，接种至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，依法检查。试验组阴性对照组加菌组﹙cfu/ml﹚结果+ˉXXcfu/ml+﹙注：+：表示阳性生长；—：表示不生长）结果：一清颗粒大肠埃希菌检查按常规法进行检验。
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