从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究

从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究 　　紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇 在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 　　关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时， 选择了固相萃取作为HPLC 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的 红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫 杉醇。 　　1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 方法 　　1.1 材料 　　红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目）， 青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 　　DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 液-液萃取 称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压 蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 　　1.2.2 固相萃取 固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的 洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维 持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中 ，抽空。依次用0.01mol/L的乙酸铵溶液10ml、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗，抽空。紫杉醇的 洗脱：在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸铵溶液10ml，收集洗脱液，减压蒸发。从洗脱液 蒸发所得的固体物中取样，溶解于甲醇，作HPLC定性定量分析。 　　1.2.3 硅胶柱层析 硅胶用CHCl2浸泡，超声波脱气5min，重力沉降法装柱（15mm-×260 mm），用CHCl2充分洗出硅胶中的杂质至柱床透明。样品溶解于CHCl3后上柱，再用CHCl3充分 洗去未被吸附的杂质，然后用3：97（v/v）的CH3OH：CHCl3进一步洗脱，收集洗脱峰，HPLC 测定紫杉醇的浓度和纯度。柱层析过程在常温常压下操作。 　　1.2.4 氧化铝柱层析 CH3OH、CHCl3用分子筛脱水，层析用氧化铝190℃真空干燥6h后， 用脱水CHCl3浸泡，超声波脱气5min，装成15mm×260mm的层析柱。清洗柱后上样，用CHCl3洗 去未被吸附的杂质，再用1%的CH3OH、CHCl3（v/v）淋洗，最后用5%的CH3OH溶液洗脱出紫杉 醇。HPLC测定其纯度，柱层析过程在常温常压下操作。 　　1.2.5 制备薄层层析 用GF254硅胶自制100mm×200mm层析薄板，105℃活化0.5h，样品用 CH3OH溶解，配成10mg/ml的溶液。毛细管点样，成线状，每板点样量在2mg左右。在对照板中 点标准品和样品，用氯仿-甲醇（95：5）展开，254nm紫外光下确定紫杉醇的Rf值。切割并收 集制备板上的紫杉醇带，用CH3OH洗脱下硅胶上吸附的紫杉醇，HPLC测定其纯度。 　　1.2.6 紫杉醇的定量定性分析 采用HPLC对紫杉醇作定性定量分析：4.6mm×250mm的C18 柱，检测波长为227nm，等梯度洗脱，流动相为甲醇-乙腈-水（20：32：48），流速1.0ml/m in。以紫杉醇标准品为对照，外标法作定量分析。 　　2 结果及分析 　　2.1 液-液萃取 　　以1：1的二氯甲烷-水对粗品液-液萃取，紫杉醇富集到有机相。实验中发现，有机相与 水相的分层速度慢，并有乳化现象。液-液萃取的紫杉醇回收率为94.6%，紫杉醇含量从0.65 %提高到1.23%。液-液萃取的缺点在于产生的废水较多。 　　2.2 固相萃取 　　用50%的CH3OH洗涤，紫杉醇不会被洗下，而浓度加大到80%，即可将紫杉醇从萃取柱洗脱 。样品经一步固相萃取，紫杉醇浓度可提高8.9倍，回收率为100%。与液-液萃取相比较，固 相萃取的优点体现在快速、简单、便于自动化。同时，固相萃取的分离效率明显高于液-液萃 取。 　　2.3 硅胶柱层析 　　紫杉醇在硅胶柱上的保留较强，用CHCl3淋洗时，紫杉醇不被洗出。而用3%的CH3-OH：C HCl3（v/v）洗脱，可分离出两个峰。HPLC分析表明，其中的第二个峰，即图1中峰1为紫杉醇 。实验中还发现，在层析流动相中添加0.05%4 水时，分离出的紫杉醇纯度有所提高，分离速 度也能显著加快。经硅胶柱层析，能获得纯化20倍以上、纯度大于14%、回收率大于98%的紫 杉醇。 　　2.4 氧化铝柱层析 　　紫杉醇在氧化铝柱上的保留和分离大致相同。用最佳流动相和高活性（即含水量低）的 吸附剂分离芳烃异构体，氧化铝柱往往要比硅胶效果好得多。用5%的甲醇洗脱，可将大部分 紫杉醇洗出。Carver等认为，氧化铝能使糖基化的紫杉醇转化为紫杉醇，从而增加了紫杉醇 的总量，使紫杉醇的回收率可能大于100%。我们的实验也发现了这一现象，这一现象的确切 原因还有待于深入探索。 　　2.5 制备薄层层析 　　硅胶薄层层析（TLC）原理与硅胶柱层析原理一致。TLC可将样品分离出11条以上的色带 ，紫杉醇带在薄板的中部（Rf≈0.5），呈现紫红色。应用TLC纯化紫杉醇，一步可将紫杉醇 含量从0 .65%提高到13.9%，回收率为99.7%。 　　2.6 预处理的比较 　　各处理步骤比较如表1。表1中数据可知，以氧化铝柱层析纯化紫杉醇的效率最高。氧化 铝介质便宜，能充分利用有限的红豆杉原料，是一可行的纯化紫杉醇方法。其次是硅胶柱层 析，浸泡好的硅胶半透明，在玻璃层析柱上能观察到层析进展情况，操作很直观。TLC的优点 是设备简单、有机溶剂消耗很少。但TLC处理量较小，工业放大困难。固相萃取的优点体现在 简单、便于自动化、能显著减少溶剂的用量。 　　 表1 预处理步骤对紫杉醇纯化效果的比较 ------------------------------------------------------------------------- 步骤 样品量(mg) 紫杉醇(mg) 纯度(%) 回收率(%) 纯化倍数 粗品 22.50 0.146 0.65 100 1 液-液萃取 11.79 0.145 1.23 99.3 1.9 固相萃取 2.27 0.146 6.44 100 9.9 硅胶柱层析 0.98 0.144 14.63 98.9 22.5 氧化铝柱层析 0.79 0.205 26.3 140.5 40.5 薄层层析 1.05 0.146 13.91 99.7 21.4 ------------------------------------------------------------------------- 　　2.7 初分离工艺的提出 　　HPLC分析表明，粗品经过氧化铝柱层析处理后，极性比紫杉醇弱的物质基本被除 去，而极性比紫杉醇稍强的杂质用正相柱已很难分离。仅经一步正相柱层析，样品中 的成分还较复杂，若直接上HPLC制备，必将影响HPLC柱的使用寿命、进料量等。因此， 有必要对样品作进一步的处理。较理想的工艺集成是氧化铝正相柱层析处理后采用一 步反相层析，即采用一步C18固相萃取，以除去极性比紫杉醇稍强的杂质。实验结果如 表2，预处理工艺纯化紫杉醇的纯化倍数达60以上，紫杉醇回收率为135.5%，纯度为42.2%。 表2 预处理工艺纯化紫杉醇结果 -------------------------------------------------------------------------- 步骤 样品量(mg) 紫杉醇(mg) 纯度(%) 回收率(%) 纯化倍数 粗品 85.50 0.555 0.65 100 1 氧化铝柱层析 2.99 0.775 25.9 139.7 39.8 固相萃取 1.78 0.752 42.2 135.5 64.9 -------------------------------------------------------------------------- 　　3 结 论 　　本工艺主要目的是简便除去紫杉醇类似物及其它生物碱，获得初步纯化的紫杉醇。过程 采用价格低谦的氧化铝为层析介质，省略了液-液萃取步骤，简化了分离工艺，提高了分离效 率，有利于工业放大。 　　氧化铝柱层析处理云南红豆杉针叶浸膏，紫杉醇的回收率大于140%，这使有限的红豆杉 资源能得以充分的利用。 　　采用优化的初分离工艺，从浸膏中有效地分离出了紫杉醇。样品经此初分离工艺处理后 ，可直接上HPLC制备柱。初分离工艺提取紫杉醇的纯化倍数为64.9，纯度为42.2%。