2021-专利说明-一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料、其制备方法及在神经修复领域的应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112957373A(43)申请公布日2021.06.15(21)申请号202110307781.9A61P25/28(2006.01)(22)申请日2021.03.23B82Y5/00(2011.01)B82Y30/00(2011.01)(71)申请人山东大学B82Y40/00(2011.01)地址250012山东省济南市历下区文化西路44号(72)发明人王晓静　李洪光　任海源　李金芮　彭爱　陈孟军　骆兴伟　(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人李筝(51)Int.Cl.A61K33/44(2006.01)A61K47/54(2017.01)C01B32/156(2017.01)A61P25/00(2006.01)权利要求书2页 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 8页附图3页(54)发明名称一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料、其制备方法及在神经修复领域的应用(57)摘要本发明具体涉及一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料、其制备方法及在神经修复领域的应用。本发明提供了一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料，将丙氨酸的碱性醇溶液加入富勒烯的邻二甲苯溶液中，在四丁基氢氧化铵存在的条件下进行反应得到所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。经验证，修饰后的富勒烯水溶性提升，并且具有促进神经干细胞增殖及诱导干细胞分化成为神经元细胞。上述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料有望应用于脑神经损伤及退行性疾病的相关药物的开发。CN112957373ACN112957373A权　利　要　求　书1/2页1.一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料，其特征在于，所述纳米材料的平均分子式如下：‑C60(NH2‑CH2‑CH2‑COO)2.1O9.05‑H8.33Na2.43TBA0.382·8.64H2O；具体的，所述纳米材料的一种结构如下式所示：2.权利要求1所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：将丙氨酸的碱性醇溶液加入富勒烯溶液中，在四丁基氢氧化铵存在的条件下反应得到所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。3.如权利要求2所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，其特征在于，所述丙氨酸的碱性醇溶液配置方式如下：将丙氨酸溶于氢氧化钠中再加入乙醇获得所述丙氨酸的碱性醇溶液。4.如权利要求2所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，其特征在于，所述丙氨酸的碱性醇溶液中，所述丙氨酸的浓度为0.15～0.25g/mL；优选的，所述乙醇与氢氧化钠溶液的体积比为2.8～3.2：1；优选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为1g/mL。5.如权利要求2所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，其特征在于，所述富勒烯为C60。或，所述富勒烯溶液的溶剂为邻二甲苯；或，所述富勒烯溶液的浓度为4～6g/mL；或，所述四丁基氢氧化铵的浓度为35～45％；或，所述四丁基氢氧化铵采用逐滴加入的方式，加入量为8～12滴。6.如权利要求2所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体步骤如下：配置所述丙氨酸的碱性醇溶液，在搅拌状态下将所述丙氨酸的碱性醇溶液逐滴加入富勒烯溶液中，再加入四丁基氢氧化铵得到反应体系；将所述反应体系至于20～30℃、黑暗处至反应完全；优选的，所述反应完全的判断方式包括，反应体系上层的紫色转变为棕黄色，下层呈黑褐色；优选的，所述制备方法还包括分离提纯步骤：获取上层有机层，调节pH至中性后，将其放入截留分子量为90～110道尔顿的透析袋中，对水进行渗析。渗析结束后过滤，除去可能的不溶物，保留滤液，将其冻干或鼓风干燥箱中干燥后得到所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。2CN112957373A权　利　要　求　书2/2页8.如权利要求7所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，还包括其他活性成分或药学上所必须的辅料；优选的，所述其他活性成分为包括但不限于神经修复活性成分、促血液循环成分、脑靶向成分或血脑屏障透过成分中的一种或几种；如神经节苷脂、胞磷胆碱、神经生长因子、维生素或胆碱酯酶抑制剂；优选的，所述药学上所必须的辅料包括但不限于药物载体、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、悬浮剂、张力剂、缓冲剂、舒缓剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和其他制剂添加剂中的一种或几种的组合。9.权利要求1所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料和/或权利要求7或9所述药物组合物在神经修复领域的应用。10.如权利要求9所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料和/或所述药物组合物在神经修复领域的应用，其特征在于，所述应用方式包括以下任意一种：(1)应用于神经修复疾病的治疗；(2)应用于制备神经干细胞诱导分化制剂；(3)应用于制备神经修复药物；所述神经修复疾病的治疗，包括通过注射或手术等方式将上述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料递送至神经损伤病灶部位；所述应用于制备神经干细胞诱导分化制剂，包括应用于将神经干细胞诱导为神经元细胞的培养基；所述应用于制备神经修复药物，所述神经修复药物为包括但不限于应用于治疗脑神经损伤或神经退行性疾病的治疗药物；优选的，所述脑神经损伤包括但不限于由脑外伤、脑血管硬化后遗症、脑炎与脑膜炎后遗症、脱髓鞘疾病、脑卒中等引发的脑神经损伤；所述神经退行性疾病包括脑缺血、癫痫、阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化或不同类型的脊髓小脑共济失调。3CN112957373A说　明　书1/8页一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料、其制备方法及在神经修复领域的应用技术领域[0001]本发明属于技术领域，具体涉及一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料、所述纳米材料的制备方法、包含上述纳米材料的药物组合物及其在神经修复治疗领域的应用。背景技术[0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。[0003]脑卒中是目前最为常见的心脑血管疾病之一，主要分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，临床上缺血性脑卒中占80％以上。随着我国人口老龄化的加剧，脑卒中的患病人数逐年增加，已经成为中国头号健康杀手，它具有高发病率、高死亡率、高致残率的特点。脑缺血等引起的疾病会导致神经元受损甚至凋亡，因此，如何有效的保护神经元以及促进神经再生和神经干细胞的分化对于治疗脑卒中这类疾病有非常重要的意义。但目前，没有有效的药物可以对脑缺血再灌注后引发的神经损伤进行修复，所以临床上迫切地需要寻找新的药物。[0004]富勒烯是一种新型纳米颗粒，是碳原子的第三种同素异形体，它的发现获得了1996年的诺贝尔化学奖。相关研究表明，富勒烯衍生物由于其特殊的结构，有非常大的电负中心，是一种超氧阴离子和羟基自由基的有效清除剂。但在医学药物领域，由于它本身不溶于水，难以单独作为药物进行治疗，所以需要用官能团对其进行修饰。[0005]目前，大量研究证明了富勒烯衍生物对脑缺血再灌注模型的神经保护作用。多羟基化的富勒烯纳米颗粒还可以作为有效的自由基清除剂。这些研究都证明了修饰后的富勒烯在神经保护以及脑损伤性疾病的治疗中都具有良好应用前景。发明内容[0006]针对目前的研究现状，发明人发现，目前已发表的多数文献中使用的富勒烯衍生物多是使用羟基或羧基进行修饰，对富勒烯的水溶性进行改善。本发明联想到采用活性基团对富勒烯进行修饰，丙氨酸是一种水溶性氨基酸，具有增强记忆和学习能力、治疗认知或精神障碍的作用。本发明提供了一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料，经验证，修饰后的新型纳米材料能够促进神经干细胞增殖，并诱导神经干细胞分化成为神经元细胞，在神经修复领域有望获得广泛的应用。[0007]基于上述阐述，本发明提供以下技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 [0008]本发明第一方面，提供一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料，所述纳米材料为富勒烯C60与丙氨酸在强碱环境下，通过自由基加成所获得的多加成衍生物，依据热重分析、元素分析和X‑射线光电子能谱等数据，证实了本发明制备的纳米材料中，丙氨酸基团与富勒烯通过C‑N连接，其平均分子式如下：4CN112957373A说　明　书2/8页[0009]‑C60(NH2‑CH2‑CH2‑COO)2.1O9.05‑H8.33Na2.43TBA0.382·8.64H2O。[0010]一种具体的实施方式中，所述纳米材料具有如下式所示的结构：[0011][0012]由于富勒烯纳米粒子在生物环境中不溶，因此必须对其进行修饰，使其成为水溶性物质才可以应用于生物医药领域。根据现有技术的报道，富勒烯衍生物对于缺血性脑损伤表现出修复效果，由于丙氨酸本身具有良好的水溶性和特殊的生理活性，本发明联想到采用丙氨酸修饰富勒烯，有望实现水溶性和生理活性的共同提升。通过体外测量神经干细胞数量和cck‑8实验，本发明证实了，低浓度下丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料不影响细胞活性而且还可以促进神经干细胞球数量增加。体外实验显示，通过BrdU/nestin免疫荧光染色发现丙氨酸修饰的富勒烯可以促进神经干细胞增殖，并随着富勒烯浓度的升高，BrdU阳性细胞所占比例也会增加。[0013]本发明第二方面，提供第一方面所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，所述制备方法如下：将丙氨酸的碱性醇溶液加入富勒烯溶液中，在四丁基氢氧化铵存在的条件下反应得到所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。[0014]本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。[0015]本发明第四方面，提供第一方面所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料和/或第四方面所述药物组合物在神经修复领域的应用。[0016]本领域公知，神经干细胞原本具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能。其中，星形胶质细胞伸展充填在神经细胞的胞体及其突起之间，起支持和分隔神经细胞的作用，并参与血脑屏障的形成。外源性化学物质或外伤损伤中枢神经系统后，损伤区域星形胶质细胞通过增生可形成胶质“瘢痕”。依据本发明的研究，丙氨酸修饰的富勒烯会影响神经干细胞分化的方向，诱导神经干细胞向神经元方向分化，并减少星形胶质细胞的生成。这一发现意味着，丙氨酸修饰的富勒烯一方面可以通过增加神经元细胞的数量，帮助补充神经损伤及神经退行性疾病中缺失的神经元细胞，另一方面，还能够减少病灶部位星形胶质细胞的数量，减少脑损伤带来的瘢痕组织的效果。基于该效果，本领域技术人员不难想象将其应用于治疗神经细胞受损引发的疾病。[0017]以上一个或多个技术方案的有益效果是：[0018]1、本发明首次使用丙氨酸作为修饰基团，改变了过往实验中只能用羟基或羧基等小分子基团修饰的方法，给富勒烯携带新的小分子药物或基团提供了新思路。[0019]2、羟基化的富勒烯衍生物已被证实具有较强的抗氧化作用，但是关于富勒烯衍生物是否可以引发神经再生和神经干细胞的分化等问题，目前还没有相关研究报道。而本发5CN112957373A说　明　书3/8页明结论证明了上述问题，对有效的保护神经元以及促进神经再生和神经干细胞的分化有非常重要的意义。[0020]3、本发明为中枢神经系统疾病的治疗提供新思路：本发明通过体外实验明确了丙氨酸修饰的富勒烯可以促进神经干细胞增殖，并且诱导神经干细胞向神经元方向分化。基于此，可以设计富勒烯药物，促进脑内神经干细胞增殖且向神经元方向分化并迁移到损伤区域，从而达到治疗脑卒中等中枢神经系统疾病的目的。附图说明[0021]构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。[0022]图1为实施例1中所述丙氨酸修饰的富勒烯样品照片。[0023]图2为实施例1中所述丙氨酸修饰的富勒烯红外光谱图。[0024]图3为实施例1中所述丙氨酸修饰的富勒烯热重分析图。[0025]图4为实施例1中所述丙氨酸修饰的富勒烯X射线光电子能谱图。[0026]图5为实施例2中所述丙氨酸修饰的富勒烯影响神经干细胞活性及存活结果图；[0027]其中，图5A为cck‑8统计结果；[0028]图5B为不同浓度下神经球的数量统计结果。[0029]图6为实施例2中丙氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞增殖的作用结果图；[0030]其中，图6A为神经干细胞的BrdU/nestin免疫荧光染色图；[0031]图6B为BrdU阳性细胞数量统计结果。[0032]图7为实施例2中所述丙氨酸修饰的富勒烯对神经干细胞分化的作用结果图；[0033]其中，图7A为神经干细胞分化为星形胶质细胞和成熟神经元的免疫荧光染色图；[0034]图7B为星形胶质细胞和神经元所占比例的统计图。具体实施方式[0035]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0036]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。[0037]正如背景技术所介绍的，富勒烯具有良好的神经保护作用，但是其本身水溶性较差，现有技术主要采用羟基或羧基修饰改善富勒烯的水溶性，本发明联想到采用具有生理活性的基团修饰富勒烯，改善水溶性的同时，进一步提高生理活性。[0038]本发明第一方面，提供一种丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料，所述纳米材料的平均‑分子式如下：C60(NH2‑CH2‑CH2‑COO)2.1O9.05‑H8.33Na2.43TBA0.382·8.64H2O。[0039]一种具体的实施方式中，本发明所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料结构如下式所示：6CN112957373A说　明　书4/8页[0040][0041]本发明第二方面，提供第一方面所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料的制备方法，所述制备方法如下：将丙氨酸的碱性醇溶液加入富勒烯溶液中，在四丁基氢氧化铵存在的条件下反应得到所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。[0042]优选的，所述丙氨酸的碱性醇溶液配置方式如下：将丙氨酸溶于氢氧化钠中再加入乙醇获得所述丙氨酸的碱性醇溶液。[0043]优选的，所述丙氨酸的碱性醇溶液中，所述丙氨酸的浓度为0.15～0.25g/mL。[0044]进一步的，所述乙醇与氢氧化钠溶液的体积比为2.8～3.2：1。[0045]进一步的，所述氢氧化钠溶液的浓度为1g/mL。[0046]优选的，所述富勒烯为C60。[0047]优选的，所述富勒烯溶液的溶剂为邻二甲苯。[0048]优选的，所述富勒烯溶液的浓度为4～6g/mL。[0049]优选的，所述四丁基氢氧化铵的浓度为35～45％(质量分数)。[0050]优选的，所述四丁基氢氧化铵采用逐滴加入的方式，加入量为8～12滴。[0051]优选的，所述制备方法具体步骤如下：配置所述丙氨酸的碱性醇溶液，在搅拌状态下将所述丙氨酸的碱性醇溶液逐滴加入富勒烯溶液中，再加入四丁基氢氧化铵得到反应体系；将所述反应体系至于20～30℃、黑暗处至反应完全。[0052]进一步的，所述反应完全的判断方式包括，反应体系上层的紫色转变为棕黄色，下层呈黑褐色。[0053]进一步的，所述制备方法还包括分离提纯步骤：获取上层有机层，调节pH至中性后，将其放入截留分子量为90～110道尔顿的透析袋中，对水进行渗析。渗析结束后过滤，除去可能的不溶物，保留滤液，将其冻干或鼓风干燥箱中干燥后得到所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。[0054]本发明第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料。[0055]优选的，所述药物组合物中，还包括其他活性成分或药学上所必须的辅料。[0056]进一步的，所述其他活性成分为包括但不限于神经修复活性成分、促血液循环成分、脑靶向成分或血脑屏障透过成分中的一种或几种；如神经节苷脂、胞磷胆碱、神经生长因子、维生素或胆碱酯酶抑制剂等。[0057]进一步的，所述药学上所必须的辅料包括但不限于药物载体、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、悬浮剂、张力剂、缓冲剂、舒缓剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂和其他制剂添加剂中的一种或几种的组合。7CN112957373A说　明　书5/8页[0058]本发明第四方面，提供第一方面所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料和/或第四方面所述药物组合物在神经修复领域的应用。[0059]优选的，所述应用方式包括以下任意一种：[0060](1)应用于神经修复疾病的治疗；[0061](2)应用于制备神经干细胞诱导分化制剂；[0062](3)应用于制备神经修复药物；[0063]所述神经修复疾病的治疗，包括通过注射或手术等方式将上述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料递送至神经损伤病灶部位；[0064]所述应用于制备神经干细胞诱导分化制剂，包括应用于将神经干细胞诱导为神经元细胞的培养基等；[0065]所述应用于制备神经修复药物，所述神经修复药物为包括但不限于应用于治疗脑神经损伤或神经退行性疾病的治疗药物；[0066]进一步的，所述脑神经损伤包括但不限于由脑外伤、脑血管硬化(脑溢血、脑血栓)后遗症、脑炎与脑膜炎后遗症、脱髓鞘疾病、脑卒中等引发的脑神经损伤；所述神经退行性疾病包括脑缺血、癫痫、阿尔茨海默症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化或不同类型的脊髓小脑共济失调等。[0067]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。[0068]实施例1丙氨酸修饰的富勒烯的制备与提纯[0069]制备：配置成C60的邻二甲苯溶液备用(5mg/ml)，取一100ml的烧杯，称取0.884克丙氨酸加入到10ml的NaOH中，配制成1g/ml的溶液，再加入30ml乙醇，得到溶液A。量取60ml的C60邻二甲苯溶液置于圆底烧瓶，边搅拌边将溶液A逐滴加入到C60溶液中，再加入10滴质量分数为40％的四丁基氢氧化铵(TBAH)，得到溶液B。将溶液B置于25℃黑暗处进行反应，直到反应完全(上层紫色基本消失，呈棕黄色，下层呈黑褐色。)[0070]分离提纯：分液移去上层有机层，调节pH至7.0，进行渗析。渗析结束后，抽滤去除沉淀，置于烘箱干燥，得到目的产物。[0071]上述丙氨酸修饰的富勒烯实物如附图1所示，红外光谱分析结果如附图2所示，各峰归属如下：3440cm‑1：O‑H；3225cm‑1：N‑H；1574,1448cm‑1：COO‑；1060cm‑1：C‑N(C60‑N)；2920,2849cm‑1:C‑H；527cm‑1：C60 core。此外，本实施例还对所述丙氨酸修饰的富勒烯纳米材料进行了热重分析，附图3结果显示分子的重量损失分为三段：45‑145℃，145‑238℃，＞238℃。第一段：分子内脱去结晶水，失重率11.43％；第二段，脱去氨基，羧基失重率10.94％；第三段的重量损失对应的是富勒烯碳笼的分解。丙氨酸富勒烯分子在1000℃时仅有约60％的重量损失，分子并没有发生完全的分解。X射线光电子能谱测试结果如附图4显示存在C1s，O1s，Na1s，N1s四种元素，原子百分比分别为73.3％，22.15％，2.46％，2.09％。[0072]实施例2神经干细胞促进活性[0073]1、提取原代神经干细胞[0074]将孕13.5天Wistar大鼠脱颈处死，放入盛有酒精的托盘中消毒，确保无菌环境。用剪刀剪开大鼠腹部，找到串珠样胚胎，放入盛有DMEM洗液的6cm皿中。剥离胎盘，分离出胎鼠，全程冰上操作。将胎鼠转移至新的6cm皿中，在显微镜下，用显微镊小心分离胎鼠全脑。8CN112957373A说　明　书6/8页然后剥离脑膜和红色血管，用镊子尽可能夹碎脑组织，再用吸管吸取DMEM淋于组织上，立即返吸，置于15mL离心管内。待取完全部胎鼠脑组织后，800rpm转速，离心3min，小心弃去上清液。加入提前预热好的0.2M木瓜酶2mL，吹打重悬，放入37℃细胞培养箱中。待组织充分消化后，将离心管以800rpm转速离心3min，小心弃去上清木瓜酶，加入神经干细胞培养基，缓慢吹打混匀。吸取适量的细胞液和培养基放入6cm皿中，吹打混匀。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。使用细胞计数板计数后种板。[0075]2、细胞毒性实验[0076]在贴壁处理的96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在37℃，5％CO2的培养箱内培养48h。第3天向每孔中分别加入不同浓度的丙氨酸修饰的富勒烯溶液，使之终浓度分别为0、10、20、40、80、160、320μM，继续孵育24h，将上清弃去，重新加入100μL培养基，然后每孔加入10μL cck‑8溶液，将培养板在培养箱内孵育2.5h，用酶标仪测定450nm处的吸光值。[0077]图5(A)为cck‑8统计结果，可以观察到随着富勒烯浓度的逐渐增加，细胞活力缓慢下降，当浓度为80μM时，细胞活力仍在80％以上，因此在接下来的实验中本实施例将选择20、40、80μM作为低中高三种浓度。[0078]3、测量神经干细胞增殖分化情况[0079](1)统计细胞球数量[0080]培养第3天，向24孔板中分别加入不同浓度的丙氨酸修饰的富勒烯。[0081]在培养第5天，倒置显微镜下对每个孔中的细胞球进行拍照。统计直径在50～200nm之间的神经球数量。[0082]图5(B)为不同浓度下神经球的数量统计结果。结果显示，丙氨酸修饰的富勒烯浓度增加后，神经球数量显著增多。[0083](2)细胞增殖及免疫荧光染色[0084]24孔板中放置14mm的无菌圆形盖玻片，加入0.1mg/mL多聚赖氨酸包被飞片2h。[0085]培养第3天，向贴壁处理的24孔板中分别加入不同浓度的丙氨酸修饰的富勒烯，第五天每孔加入5μL BrdU，4h后进行免疫荧光染色：[0086]吸弃孔中培养基，加入500μL 1×PBS溶液。清洗飞片2次，每次5min。[0087]加入4％PFA500μL用于固定细胞，室温作用10min。[0088]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0089]2M盐酸200μL室温酸化30min。[0090]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0091]加入10％DS溶液，封闭30min。[0092]加入一抗(BrdU，1:400；nestin，1:400)溶液，4℃冰箱中过夜。[0093]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0094]选择与一抗相同属性的二抗(1:500)，室温避光作用1h。[0095]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0096]在载玻片上滴加含有DAPI(1:1000)的防荧光淬灭剂，将飞片倒扣于载玻片上，滤纸吸干多余的防荧光淬灭剂。[0097]统计不同视野下的阳性细胞数和DAPI细胞数。9CN112957373A说　明　书7/8页[0098]图6(A)是0、20、40、80μM浓度下神经干细胞的BrdU/nestin免疫荧光染色。实验结果中，红色代表BrdU阳性细胞，绿色代表Nestin阳性细胞，蓝色DAPI显示细胞核，Merge代表新生的神经元。图6(B)是BrdU阳性细胞数量统计结果。结果显示，随着丙氨酸修饰的富勒烯浓度的升高，BrdU阳性细胞所占比例越来越高，证明丙氨酸修饰的富勒烯可以显著促进神经干细胞增殖，并有浓度依赖性。[0099](3)细胞分化及免疫荧光染色[0100]诱导分化后第2天，向贴壁处理后的24孔板内分别加入不同浓度的丙氨酸修饰的富勒烯，在分化培养后第7天进行免疫荧光染色：[0101]吸弃孔中培养基，加入500μL 1×PBS溶液。清洗飞片2次，每次5min。[0102]加入4％PFA500μL用于固定细胞，室温作用10min。[0103]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0104]0.4％Triton X‑100室温通透8min。[0105]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0106]加入10％DS溶液，封闭30min。[0107]加入一抗(MAP2，1:200；GFAP，1:300)溶液，4℃冰箱中过夜。[0108]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0109]选择与一抗相同属性的二抗(1:500)，室温避光作用1h。[0110]500μL 1×PBS溶液，清洗飞片3次，每次5min。[0111]在载玻片上滴加含有DAPI(1:1000)的防荧光淬灭剂，将飞片倒扣于载玻片上，滤纸吸干多余的防荧光淬灭剂。[0112]统计不同视野下的阳性细胞数和DAPI细胞数。[0113]图7(A)是0、20、40、80μM浓度下神经干细胞分化为星形胶质细胞和成熟神经元。绿色代表GFAP阳性细胞，红色代表的是MAP2阳性细胞，蓝色DAPI显示细胞核。图7(B)是星形胶质细胞和神经元所占比例的统计图。结果显示，随着丙氨酸修饰的富勒烯浓度的升高，GFAP阳性细胞所占比例逐渐降低，而MAP2阳性细胞所占比例逐渐升高，证明丙氨酸修饰的富勒烯可以显著促进神经干细胞向神经元方向分化。[0114]本实施例通过BrdU/nestin和MAP2/GFAP两个免疫荧光实验分别比较了不同浓度下丙氨酸修饰的富勒烯对于神经干细胞增殖和分化的影响，结果证明，丙氨酸修饰的富勒烯可以促进神经干细胞增殖，并随着富勒烯浓度的升高，BrdU阳性细胞所占比例也会明显增加。此外，丙氨酸修饰的富勒烯会影响神经干细胞分化的方向，诱导神经干细胞向神经元方向分化，并减少星形胶质细胞的生成。[0115]本领域中技术人员知晓BrdU，即5‑溴脱氧尿嘧啶核苷，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子，通过检测BrdU免疫荧光标记便能准确地反映细胞的增殖情况。[0116]本领域中技术人员知晓nestin，即巢蛋白，是一种中间丝类型的蛋白，仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止，为神经干细胞的特征性标志物。[0117]本领域中技术人员知晓MAP2，即微管相关蛋白2，是组成神经元细胞骨架的重要组成成分，是成熟神经元特异性标志物。[0118]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技10CN112957373A说　明　书8/8页术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。11CN112957373A说　明　书　附　图1/3页图1图2图312CN112957373A说　明　书　附　图2/3页图4图513CN112957373A说　明　书　附　图3/3页图6图714