小鼠睾丸附睾和输精管精子采集运动能力检测和结构观察认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等生殖器官结构及位置特点;掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集方法;掌握血细胞计数板法精子计数和运动能力检验方法;经过睾丸、附睾及输精管精子运动能力检测,认识精子在睾丸产生后,在附睾内成熟过程;实验目的5.掌握精子抹片方法;6.掌握染色法进行精子结构观察和顶体结构观察方法,认识精子正常结构;7.使学生得到小鼠精子操作基础训练。实验目的哺乳动物精子在睾丸内形成,并必需经过在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面改变而最终达成成熟,才能取得向前运动能力,这种向前运动能力取得是精子受精能力关键指标。哺乳动物精子包含头部和尾部两个关键部分,颈部介于头部和尾部之间,形成头部和尾部连接。精子头部关键由核组成,实验原理头部顶端是顶体,顶体包围核前端形成帽状。精子颈部变细并形成头部和尾部连接。尾部是精子运动器官,能够分为中段、主段和末端。实验原理1.设备与器材:实体显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、注射器、注射针头、吸管、试管架、血细胞计数板、剪刀、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片等。实验用品2.药品、试剂:精子操作液（CZB液或KSOM液）、0.5%龙胆紫酒精液、36%甲醛溶液、磷酸缓冲液（PH6.8）、精子固定液（福尔马林磷酸盐缓冲液）、吉姆萨工作液。实验用品3.试验动物:选择60日龄以上,体重达成32-35g昆明种公鼠。1.精子采集:左手捏小鼠尾部,右手持镊子,或以图3-1所表示方法,以颈部脱臼法处死小鼠。使处死小鼠仰卧,用75%酒精棉球消毒腹部开口部位被毛及皮肤。剪开腹壁,暴露生殖系统。无菌分离睾丸、附睾及输精管。在含培养液表面皿中,用眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围系膜及脂肪,并冲洗洁净,以免血液或脂肪球混入液体妨碍精子观察。实验方法将分离并清洗洁净睾丸、附睾及输精管,用眼科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带小段输精管、其它部分输精管3部分,弃去附睾头。采集睾丸精子时,将睾丸横切为如干段或组织块,放在表面皿中,加1ml培养液,用眼科剪轻轻挤压睾丸组织块,把精子挤入培养液中,去掉组织块。置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育20min,使精子自行散开。实验方法实验方法采集附睾尾精子时,将其剪成几段。采集输精管精子时,因为小鼠输精管非常细,不能直接冲洗管腔,将输精管放入含有1ml培养液表面皿内,在实体显微镜下,用一只眼科异物针固定输精管,用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管,精子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开,用吸管连同精子吸出液体部分,装于2ml具塞试管中暂存。2.精子运动能力检验:用滴管吸收精液,放于血细胞计数板计数室与盖玻片接触处,使精液自然流入计数室中。计数中间5个中方格（对角5个或四角及中间）内80个小方格精子数,计数值为X0计算时,先计数死精子X1值,然后计数板置于50℃水浴锅中搪瓷盘中,在50℃条件下5～10min杀死精子,计数总精子数X2值,（X2－X1）/X2为表示精子运动能力精子活力值。计数时每份精子用3个计数板反复计数3次,取平均值。实验方法3.精子整体结构观察:取1小滴保留精液在载玻片上,将样品滴以拉形式制成抹片。用0.5%龙胆紫酒精液染色3min,自然干燥,水洗后镜检。镜下可观察到大多数为结构正常精子,部分为畸形精子,如头部畸形（如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不显著、皱缩、缺损、双头等）、颈部畸形实验方法3.精子整体结构观察:（颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等）、尾部中段畸形（膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、双体等）、尾部主段畸形,然后分类计数。有精子尾部发育未完成,为未成熟精子,可计为畸形精子。实验方法4.精子顶体结构观察:精液抹片自然干燥10～20min,以1～2ml福尔马林磷酸缓冲液固定15min,水洗后自然干燥。用姬姆萨工作液染色90min,水洗,风干。置于1000倍显微镜下用油镜观察,计数顶体异常精子。镜下可观察到大多数精子顶体结构正常,部分精子顶体异常,精子顶体异常关键表现为肿胀、缺损、部分或完全脱落。实验方法剖开小鼠腹腔时,剪刀头要向上,以避免剪破腹腔血管和内脏,影响试验结果观察。实验注意事项实验结果及分析1.雄性小鼠生殖器官关键由哪多个部分组成？2.绘制小鼠精子结构图？3.从外观上看小鼠精子由哪几部分组成？你都观察到了哪多个畸形结构？将经典畸形结构进行图示。顶体缺损顶体脱落顶体空泡正常精子顶体结构
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