实验三 细菌的分离培养及移植

实验三细菌的分离培养及移植两个概念：在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。分离：从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法；纯培养：一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。实验目的：1掌握细菌分离培养的基本要领和方法2掌握挑菌、纯培养及移植技术3了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ：球1菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的混合培养肉汤等；2培养基：普通肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平板3器械：剪刀、记号笔、酒精灯、接种环一需氧型细菌分离培养法1.平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，以求得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 划线培养时注意问题：左手持皿，用左手拇指、食指及中指将平皿揭开约呈20°的角度(图1)；右手持接种环，灼烧冷却后从混合培养肉汤中取少量涂布于培养基边缘，开始划线(图2)；划线前先将接种环稍稍弯曲，使之易与琼脂面平行，不致划破培养基；划线中不易过多的重复旧线，以免形成菌苔；接种完毕，在皿底作好标记（菌名、日期、接种者等），平皿倒扣，置于37℃培养。图2连续划线法区划线法图1划线分离示意图2.纯培养的获得与移植法---琼脂斜面分离法将37℃下培养24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，镜检不含杂菌，即用接种环挑取单个菌落移植于琼脂斜面培养，所得的培养物即为纯培养物。图3斜面接种时试管的拿法图4斜面接种时无菌操作的程序左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口相互并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管塞子，以便接种时易拔出（图3）。右手持接种棒，火焰灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。将接种环深入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即放入另一斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，塞好棉塞，灭菌接种环，作好标记，置于37℃温箱培养。（图4）2.1两试管间的斜面移植4.穿刺培养法半固体移植多用穿刺法接种。方法基本与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基内。从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。5.倾注培养法取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，加热融化，冷至约50℃用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。6.芽胞需氧菌分离培养法如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。7.利用化学药品的分离培养法(1)抑菌作用:有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离。(2)杀菌作用:将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核杆菌因具有抗酸性而存活。(3)鉴别作用:利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。8.通过实验动物分离法被检病料中疑有某种病原菌存在，将病料无菌取出，无菌研磨后加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。二厌氧型细菌分离培养法细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。(1)动物组织及其他物质加入法：在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂。(2)共栖培养法：将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。1.生物学法2.化学方法利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。焦性没食子酸法:平板培养法、Buchner氏试管法、史氏厌氧培养法、平皿厌氧培养法、玻罐或干燥器法李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法硫乙醇酸钠法：液体培养基法、固体培养基法3.物理学方法厌氧罐法、真空干燥器法、加热密封法、高层琼脂柱三细菌培养性状的检查（一）细菌在固体培养基上的生长表现琼脂平皿上的生长表现：细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。(见图5-6)图5菌落的形态从左到右，从上到下分别是：1.圆形、边缘整齐、表面光滑；2．圆形、边缘整齐、表面有同心圆；3．圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；4．圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑；5．不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹；6．圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7．毛状；8根状图6菌落的隆起度左到右，上到下：1．扁平状；2．低隆起；3．隆起；4．台状；5．脐状；6．纽扣状；7．乳头状；8．褶皱凸面2.琼脂斜面上生长表现将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上（自底部向上划一直线），培养后观察其生长表现。(见图7)3．琼脂柱穿刺培养中的生长表现将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其生长表现。(见图8)图7琼脂斜面培养的菌落表现图8琼脂柱穿刺培养的菌落表现1.线状；2．棘状；3．珠状；4．绒毛状；5．根状（二）细菌在明胶柱穿刺培养中的生长表现取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22℃温箱中培养后观察其液化情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同(见图9)。（三）细菌在液体培养基中的生长表现将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况(见图10)。图9细菌明胶柱穿刺培养生长表现1.不液化；2．火山口状；3.芜箐状；4.漏斗状；5.囊状；6.层状图10细菌在肉汤中生长表现1．絮状；2．环状；3．厚膜状；4．均匀状思考题1、细菌分离培养的目的，什么是纯培养？2、常用细菌分离培养的方法有哪些？3、划线分离培养以及普通琼脂培养应注意的问题是什么？实验报告要求1、目的（前言）2、材料与方法（实验方法）3、结果观察