泰山医学院硕士学位论文开题报告书-夏鹏程(最终版)

学科名称临床检验诊断学学科代码100208类型：学术型泰山医学院硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 开题报告书学号：0002014043研究生：夏鹏程导师：赵书平研究方向：临床微生物学论文题目：耐碳青霉烯大肠杆菌耐药机制及流行病学研究学科：临床检验诊断学入学时间：2014年9月开题时间：2015年12月18日2015年12月18日填报说明一、开题报告中的一至七项必须采用计算机输入和打印。二、开题报告为A4大小，于左侧装订成册。各栏空格不够时，请自行加页。三、开题报告通过后，分别由研究生、导师、研究生培养单位和研究生部各存档一份。学位论文题目耐碳青霉烯大肠杆菌耐药机制及流行病学研究一、课题意义及国内外研究现状1、选题意义（1）问题提出（2）立项意义2国内外研究现状1.大肠杆菌是临床常见的条件致病菌，该菌可携带超广谱β-内酰胺酶（ESBLs)、质粒介导的Ampc酶以及同时产ESBLs和Ampc酶，对多种抗菌药物耐药。碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南等是临床治疗肠杆菌科细菌尤其是产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)等多重耐药菌株引起感染的最有效的抗菌药物。然而，随着碳青霉烯类抗生素在临床上的广泛应用，耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem．ResistantEnterobacteriaceae，CRE)正在医院内悄悄出现。如在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的耐药率也已经由早年的零上升到l％；在肠杆菌科的其他一些菌属已经有7.0％的耐药率。在非发酵菌的某些菌属的耐药率也已经上升为20％-30％。由于大多数对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌同时也对许多临床常用的抗生素耐药，成为泛耐药菌株，对病人的生命构成极大的威胁。导致该类药物在临床的应用受到严峻的挑战。尽管CRE菌株已逐年增加且呈暴发流行的趋势，但目前国内的的研究大多集中于耐药机制的研究，对该类菌株如何在不同种属细菌间广泛播散的传播机制尚缺乏深入的研究，对该类菌株引起的医院感染的危害性亦未得到足够的重视。但有关此方面的研究国内尚未见报道。由于CRE菌株引起的感染大多为重症感染且目前临床并无有效的治疗药物可供选择，尤其是对于CRE菌株引起的中枢神经系统感染更是如此。随着抗生素的使用，细菌耐药问题一直困扰着人类,致病菌中多重耐药的出现已成为一个很严重的全球公共卫生威胁，尤其肠杆菌科对碳青霉烯类药物耐药已经成为临床抗感染治疗中的重要问题。我们推测CRE菌株在医院范围内广泛播散的机制主要有以下两种：①水平传播：携带碳青霉烯酶如KPC-2型酶的质粒在不同细菌间进行直接转移；使敏感株成为耐药株：②克隆传播：CRE菌株通过各种方式在不同患者间克隆传播而导致医院感染暴发流行的发生。由于不同国家、不同地区肠杆菌科细菌流行菌株存在差异，其表型和基因型也各不相同，细菌的耐药也不尽相同。因此研究本国家本地区耐碳青霉烯大肠杆菌的耐药基因传递方式、传递频率以及影响因素，以制定相应措施，预防及控制耐碳青霉烯大肠杆菌引起的医院感染，对于提高肠杆菌科细菌引起严重感染的治愈率，制定因泛耐药肠杆菌科细菌引起感染的诊治及防控措施具有重要的意义。2.国内外研究现状：中国报道的首例耐碳青霉烯大肠杆菌携带者出现在香港，感染者为印度裔男子，其尿液样本检出携带blaNDM-1的大肠杆菌[1]。而且现在已有抗生素中只有粘菌素及替加环素对产NDM-1细菌相对有效。虽然大肠埃希菌是人类肠道的正常群菌，但是常因寄居部位的改变而引起条件致病，现已成为医院感染最主要的致病菌[2]。近年来随着三代头孢菌素等高效广谱抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物的广泛应用，大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶阳性率越来越高，甚至出现了碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌[3]。虽然碳青霉烯类抗生素是治疗严重院内感染的强效药物，尤其是对产ESBLs酶、AmpC酶的耐药致病菌，但是随着该类药物的广泛使用，耐碳青霉烯类抗生素的菌株出现也越来越多[4]。随着广谱抗菌药的广泛使用，在不同地方的大肠埃希菌其耐药性的特点有所不同[5]。携带kpc-2型碳青霉烯酶的细菌基本到达无药可用的地步，应引起高度重视。因此，建立本地区耐碳青霉烯酶检测体系，及时发现和定期报告本地区耐药菌的流行趋势，合理规范化使用碳青霉烯类抗菌药物，能够有效减少产碳青霉烯酶菌株的发生和传播[6]。国外目前报道KPC在多种肠杆菌科细菌和非发酵菌中均有检出，其中以肺炎克雷伯菌最为常见，在大肠埃希菌中较为少见，以色列[7]、美国［8-10］、法国［11］和巴西［12］等国均有分离到产KPC大肠埃希菌。美国临床实验事 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化委员会(ClinicalLaboratoryStandardInstitute．CLSI)．2009年推荐了改良Hodge试验，用于肠杆菌科细菌耐碳青霉烯酶的检测[13]。目前已发现的KPC型酶已有11种，分别从KPC-1型至KPC-11型酶[14].意大利采用RAPD（随机扩增多态性DNA标记技术）从2011年5月2014年4月留存的164株耐碳青霉烯菌株中分离分析了来自146个不同患者的表型和遗传型的耐药基因。得出耐碳青霉烯菌株的出现几率出现逐年上升趋势的结论[15]。而意大利博尔扎诺区发现肺克仍以产KPC-3为主，而大肠杆菌发现产oxa-48基因[16]。参考文献：[1]ChuYW,TungVW,CheungTK,etal.CarbapenemasesinEnterobacteriaHongKong,China,2009[J].EmergInfectDis,2011,17.[2]陈晓，张伟丽，杨青，等．Mohnarin2011年报告：西南地区细菌耐药监测[J].中华医院感染学杂志，2012,22(22):4983-4988.[3]李光辉，朱德妹，汪复，等．2011年中国CHINET血培养临床分离菌的分布及耐药性[J]．中国感染与化疗杂志，2013，13(4)：241-247．[4]楼丹萍,产NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌的研究[J]硕士,2014[5]蔡茵萍．2007至2011年大肠埃希菌医院感染分布及耐药性分析[J].中华医药指南，2013,11（12）：40-41．[6]安军，蔡挺，张顺.耐碳青霉烯类大肠埃希菌和肺炎克雷伯杆菌多重耐药研究进展[J].现代实用医学，2011，23（3）：359-360．[7]SNavon-Venezia,IChmelnitsky,ALeavitt,etal.Plasmid-MediatedImipenem-HydrolyzingEnzymeKPC-2amongMultipleCarbapenem-ResistantEscherichiacoliClonesinIsrael[J]．AntimicrobialAgents&Chemotherapy, 2006, 50(9):3098-3101[8]SBratu，JGupta，SBrooks，etal．DetectionandspreadofEscherichiacolipossessingtheplasmid-bornecarbapenemaseKPC[J]ClinicalInfectiousDiseases, 2007, 44(7):972-975[9]LDavid，UCarl，BMartin，etal．SusceptibilityProfiles,MolecularEpidemiology,andDetectionofKPC-ProducingEscherichiacoliIsolatesfromtheNewYorkCityVicinity[J]JournalofClinicalMicrobiology, 2010, 48(12):4604–4607[10]CUrban，PABradford，MTuckman，etal．Carbapenem-resistantEscherichiacoliharboringKlebsiellapneumoniaecarbapenemasebeta-lactamasesassociatedwithlong-termcarefacilities.[J]ClinicalInfectiousDiseasesAnOfficialPublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica, 2008, 46(11):e127-e130[11]Petrella,S.,Ziental-Gelus,N.,Mayer,C.,etal．Geneticandstructuralinsightsintothedisseminationpotentialoftheextremely-broad-spectrumclassA{beta}-lactamase(EBSBL)KPC-2identifiedintwostrainsofEscherichiacoliandEnterobactercloacaeisolatedfromthesamepatientinFrance[J]AntimicrobAgentsChemother, 2008[12]APDCarvalho-Assef，RSLeão，RVDSilva,etal．EscherichiacoliproducingKPC-2carbapenemase:firstreportinBrazil.[J]DiagnosticMicrobiology&InfectiousDisease, 2010, 68(3):337–338[13]CIiniealandLaboratoryStandardsInstitute．2009．Performancestandardsforantimicrobialsusceptibilitytesting；19thinformationalsupplement．CLSI／NCCLSM100-S19．ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，Wayne，Pennsylvania[14]RappRP,UrbanC.KlebsiellapneumuniaecarhapenemasesinEnterobacteriaceae：history．evolution．andmicrobiologyconcerns[J]Pharmacntherapy．2012,32:99-107．[15]D.Barbarinia,G.Russellob,F.Brovaroneb,etal.Evaluationofcarbapenem-resistantEnterobacteriaceaeinanItaliansetting:Reportfromthetrench,[J]InfectionGenetics&Evolution, 2014, 30:8-14[16]RAschbacher，TGiani，DCorda，etal.Carbapenemase-producingEnterobacteriaceaeduring2011-2012intheBolzanoarea(NorthernItaly):increasingdiversityinalow-endemicitysetting[J]DiagnosticMicrobiology&InfectiousDisease, 2013, 77(4):354–356二、课题研究目标、研究 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 和拟解决的关键性问题1、课题研究目标2、研究内容3、拟解决的关键性问题1.研究目标（1）明确耐碳青霉烯的大肠杆菌中各种含耐药基因基因的菌株，菌株之间耐药基因的传递方式，探讨各种含耐药基因的菌株耐药基因在质粒上还是在整合子上。（2）明确耐碳青霉烯大肠杆菌菌株之间耐药基因传递的频率。（3）探讨影响耐药性传递的因素，为今后防止耐药菌株的产生，制定因泛耐药肠杆菌科细菌引起感染的诊治及防控措施提供实验室理论依据。（4）明确肠杆菌科细菌中耐药基因可引起何种抗生素耐药性改变，各抗生素MIC值改变情况。2.研究内容：（1）耐碳青霉烯相关基因在大肠杆菌中相互间传递方式、传递的频率以及温度和pH的影响。分析探讨各种含耐碳青霉烯相关基因菌株耐药基因在质粒上还是在整合子上。观察20、25、30、35、37、38、39、45°C，pH分别6.5、6.7、6.9、7.1、7.2、7.4、7.5、7.6时接合传递情况。（2）大肠杆菌中耐碳青霉烯基因与细菌耐药性的关系分析。扩增出耐碳青霉烯基因（如NDM-1和IPM-4和KPC）基因序列，然后分别构建新的含耐药基因的质粒，分别转化到大肠埃希菌标准菌株中，观察耐药基因的表达情况。探讨含耐碳青霉烯基因的大肠杆菌对肠杆菌科细菌的耐药性影响。（3）耐碳青霉烯大肠杆菌的耐药基因产生与细菌外膜蛋白缺失引起细菌对各种抗生素耐药性关系分析。探讨耐碳青霉烯大肠杆菌的耐药基因产生与细菌外膜蛋白缺失引起细菌耐药性的关系以及与其他耐药基因的协同关系。3.拟解决的关键科学问题：分析耐碳青霉烯相关基因与其他耐药基因导致细菌耐药性区别，分析耐药基因的表达与耐药性的关系。三、拟采取的研究方法、技术路线、实验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 及其可行性分析1、研究方法2、技术路线3、试验方案4、可行性分析1.研究方法：（1）耐药基因定位采用PFGE胶内杂交和Southern杂交定位方法。（2）耐药基因在不同菌属间相互传播频率以及温度和pH对接合试验的影响采用接合试验。（3）各种细菌外膜孔蛋白存在情况采用SDS-PAGE、IEF电泳分析法。2.技术路线：（1）耐药基因的传递方式、传递频率以及影响因素试验对象：含有耐药基因、同源性不一致的大肠杆菌菌株①耐药基因定位PFGE和随机引物胶内杂交试验定位耐药基因在质粒上还是在整合子上Southern杂交试验定位耐药基因是否在染色体基因组DNA上②细菌接合试验供体菌为含耐药基因的大肠杆菌受体菌为大肠埃希菌J53不同温度和pH值（观察影响因素）挑取接合子计算肠杆菌科菌株间的传递频率测定接合子中耐药基因定位确定耐药基因的传递方式（2）耐药基因与肠杆菌科菌耐药性关系扩增耐药基因序列加入空白质粒，连接酶含耐药基因的质粒的构建转化大肠埃希菌J53标准菌株PCR扩增及序列分析耐药基因改良Hodge试验和EDTA协同实验检测含有耐药基因的大肠埃希菌测定多种抗生素的MIC值比比较该耐药基因与其他基因对细菌耐药性的差异，寻找引起含有耐碳青霉烯菌株泛耐药或全耐药的原因（3）耐药菌株的同源性及流行病学分析不同来源的耐药菌株脉冲场电泳分析耐药菌株同源性，探讨耐药基因流行病学意义3.试验方案（1）药物敏感性试验：除环丙沙星和阿米卡星采用E-TEST法外，其余抗生素采用琼脂稀释法测定对细菌的最低抑菌浓度（MIC），具体方法参照CLSI推荐方法。（2）接合试验：大肠埃希菌J53（E.coliJ53AZR）为受体株，E.coli1为供体菌。供体菌和受体菌分别接种于5mlM-H肉汤培养基，37℃摇床过夜；吸取200µl供体菌、受体菌和600µl新鲜M-H肉汤培养基，混合后置35℃孵箱过夜培养；分别取100µl接合前和接合后菌液接种筛选平板（100µg/ml叠氮钠+0.5µg/ml亚胺培南和8µg/ml头孢噻肟+100µg/ml叠氮钠），35℃过夜培养。挑取单个菌落再次转化筛选平板35℃过夜。用ATB细菌鉴定仪对接合子进行生化鉴定。同时采用E-test法测定供体菌、受体菌和接合子对左氧氟沙星、阿米卡星、庆大霉素、头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦和氨曲南的耐药性。更改温度及PH值，重复试验，检测结合的结果与结合频率。（3）转化试验：使用凝胶回收法回收耐药基因；于40μl的PCR产物加入3倍体积的PCR-ABuffer，涡漩振荡以混匀。将样品混合液转移到一个制备管中，然后将此管装进一个2ml离心管里；10,000rpm离心1min，弃去滤液。将制备管置回2ml离心管中，加入700μlBufferW2，室温10,000rpm离心1min，弃滤液。将制备管置回2ml离心管中，加入400μlBufferW2，室温10,000rpm离心1min，弃滤液。再次室温10,000rpm离心1min。将制备管置于一个新的洁净1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入60°C预热的ddH2O30μl，放置1分钟后，室温10,000rpm离心1min，弃制备管，离心管中的液体即为回收的DNA片段。回收的基因做转化试验（T载体法）。T载体与PCR产物连接：取6mL连接产物加入至200mLTG1感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀（勿吹打）。冰浴30min42°C热激90sec，然后快速置入冰水中3~5min加入1mLLB液体培养基，于37°C摇床振荡培养45min-1h取出，5000rpm离心10min，弃1ml上清取出全部细菌细胞悬液涂布于含Amp/X-gal/IPTG的LB固体培养基平板上。置于生化培养箱中，先37°C正置培养30~60min至培养基表面的液体挥发干为止然后37°C倒置培养12~16hr取出平板，观察平板上菌落（菌斑）；拍照；最后4°C保存（用封口膜封好）。（4）改良Hodge试验1.使用无菌生理盐水将大肠埃希菌ATCC25922菌悬液调至0.5麦氏浊度，并用生理盐水进行1:10稀释。2.用棉签将稀释后菌液均匀涂布于MH琼脂平板上，干燥10分钟。3.将美罗培南或亚胺培南或厄他培南纸片置于MH琼脂平板上。4.使用1µl接种环挑取3-5个过夜生长待测菌落垂直于药敏纸片从纸片边缘开始划线，长度为20-25mm。5.35±2°C孵育16-20h。（5）EDTA协同试验采用亚胺培南（美洛培南）/EDTA复合纸片，进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值≥5mm；亚胺培南（美洛培南）/EDTA复合E试条协同实验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值≥8时，即可判定产金属酶。（6）脉冲场电泳染色体DNA同源性分析：用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对大肠埃希菌进行染色体DNA同源性分析，Braenderup沙门菌H9812作为相对分子质量标准。具体操作步骤参见美国疾病控制和预防中心网站。（http://www.cdc.gov/pulsenet/pathogens/ecoli.html）。细菌的染色体DNA经Xba-I限制性内切酶消化后进行PFGE。电泳完成后溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。PFGE图像用UVIBAND软件进行分析。根据Tenover等的标准判读结果。（7）多位点序列分型（MLST）及系统发育分型（phylogenetictyping）：提取细菌基因组DNA，PCR扩增大肠埃希菌的7个管家基因，引物序列和PCR扩增条件参照文献。PCR产物经测序后的核苷酸序列与科克大学（UniversityCollegeCork）MLST网站（Http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli）的数据库比对，确定序列类型（Sequencetype,ST）。系统发育分型参照文献进行，将大肠埃希菌分为A群、B1群、B2群和D群等4个系统发育群。（8）碳青霉烯酶基因扩增和测序：采用PCR法扩增碳青霉烯酶基因，包括常见碳青霉烯酶基因blaKPC和blaIMP，广谱或超广谱β内酰胺酶基因blaTEM.blaSHV和blaCTX-M以及质粒介导AmpC酶基因等引物进行PCR扩增。增产物送上海桑尼有限公司测序，测序结果在GenBank网上查询。（9）外膜蛋白(OMP)分析：以ATCC25922作为对照株，以冰浴超声粉碎法提取细菌外膜蛋白，简要步骤如下：收集40ml过夜增菌的MH肉汤，3000r／min离心10min收集菌体，50mmoL／LPBS洗涤1次，10mmol／LpH7．0Tris-HCI冰浴超声破碎，5000r／min4℃离心10min去除未破碎菌，上清20000r／min4℃离心30min留沉淀，加入含2％十二烷基肌氨酸钠的pH7．4PBS5ml，室温置30min后18000r／min4℃离心40min留沉淀，然后加入0．3ml10mmol／LpH7.0PBS悬浮沉淀，-70℃备用。提取的外膜蛋白与上样缓冲液按比例混合，煮沸10min，Bio·Rad垂直电泳系统进行SDS-PAGE。电泳凝胶为5％浓缩胶和15％分离胶，80V恒压电泳2.5h。电泳后用考马斯亮蓝染色后分析耐药株。4.可行性分析：（1）课题指导老师具有非常好的科研基础；导师曾先后承担全军“九五”和“十五”课题，国家863课题子课题和泰安市科技局立项课题，对科研流程非常熟悉，能够很好的指导本人按照计划来实施和完成课题。（2）课题指导老师具有针对本课题的良好的工作基础；先前针对细菌的耐药机制做了大量的工作，取得了较好的实验结果。例如：对多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因进行了系列研究。通过PFGE同源性分析、PCR扩增和序列分析、SDS-PAGE以CCCP抑制试验等对泰安地区引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物敏感性降低的原因进行了研究。（3）完成该课题所需的仪器设备均具有，实验方法课题组成员均熟悉并掌握。实验所需试剂多数已购齐。四、课题的创新性耐碳青霉烯大肠杆菌的耐药基因是目前国内乃至国际研究的热点，然而针对耐碳青霉烯大肠杆菌中耐药基因相互间传递方式、传递的频率、影响因素以及其与耐药性的关系是目前为止研究较少的一个方面，我们如果能借此契机将此机制探究清楚，就能非常好的指导临床，提高肠杆菌科细菌引起严重感染的治愈率，并能合理有效的控制“超级细菌”的传播。五、计划进度、预期进展和预期成果1、计划进度：2015.09-2016.01留菌（通过泰安市中心医院微生物室留取耐碳青霉烯大肠杆菌菌株，并通过自动药敏鉴定仪microscan96plus鉴定、药敏)2016.01-2016.03通过接合试验研究耐药基因在不同温度和PH条件下，在不同菌属间耐药基因相互传播的情况；2016.04-2016.06耐碳青霉烯基因的定位及耐碳青霉烯大肠杆菌同源性；2016.07-2016.11筛选耐药菌株质粒并将其转染到大肠埃希菌标准菌株中，观察耐药基因的表达情况；2016.12-2016.02整理数据、分析、撰写论文、毕业答辩。2、预期进展：（1）实验初期，严格按照操作规程、准确控制试验条件进行细菌结合试验，检测出耐碳青霉烯基因的结合频率及相关的影响因素。（2）实验中期，采用相关仪器设备对肠杆菌科细菌内的耐药基因进行准确的基因定位。（3）实验末期，将含耐碳青霉烯基因的质粒转染到大肠埃希菌标准菌株中，该操作稍有难度，脉冲场电泳检测同源性，操作较复杂，可能独立操作很难取得好的结果，期间需要专业指导老师的引导。3、预期成果：发表2篇文章；六、与本课题有关的工作积累、已有的研究工作成绩本人阅读了肠杆菌科细菌耐药与耐药基因之间相关性的大量文献，了解了本领域的国内外研究现状，积累了一定的研究资料，掌握了基本的细菌培养技术，表型鉴定技术及PCR技术等多项试验技术，具备了一定的实验基本技能，为下一步实验的开展奠定了基础。七、研究经费预算计划和经费落实情况1.药敏纸片、鉴定板、培养基、抗生素药物等常规物品的购买2.引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 、PCR试剂盒的购买，PCR产物的基因测序的费用3.基因定位所需试剂、同源性分析、电泳分析所用试剂的费用4.质粒、感受态细胞的购买以及转化试验所需其它试剂的费用课程学习情况已修课程学分待修课程学分导师意见 签名： 日期：年月日专家论证意见开题报告专家组意见 开题报告时间： 参加人数：专家人 审查结果：同意人；不同意人 专家组组长签名： 日期：年月日备注