人类基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳分析第一节实验目的掌握人类基因组DNA提取的基本原理和方法掌握琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA方法第二节实验原理相关知识核酸提取思路：破膜：细胞膜、核膜分离：通过酶，有机溶剂，调节pH值，离心等纯化：去除杂质DNA提取原则：保证DNA一级结构的完整性排除其他分子的污染，使其纯度尽可能高排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染相关知识样品来源：培养细胞组织标本血液样本相关知识实验原理用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE中即得到高分子量的DNA。本次实验使用的试剂盒系直接加入裂解液裂解细胞后，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，再利用特殊硅基质膜吸附DNA的特性，可快速、高效地纯化回收基因组DNA。离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低pH值状态下选择性地结合溶液中的DNA，再通过漂洗液将杂质去除，最后低盐，高pH值的洗脱缓冲液或去离子水将DNA从硅基质膜上洗脱。高盐，低pH值：选择性结合DNA漂洗低盐，高pH值：DNA从硅基质膜上洗脱第三节主要试剂主要试剂培养细胞RNaseA（100mg/ml）ProteaseBufferGRBufferGL无水乙醇BufferGW1BufferGW2BufferGE第四节主要仪器微量移液器台式微量离心机电泳仪凝胶成像系统主要仪器第五节操作步骤1.样品处理：取1管细胞，做好标记，5000rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞。3.向以上溶液中加入20μlProteaseK，混匀。4.加入200μlBufferGL，颠倒混匀15次，剧烈震荡至少1分钟。注意：不要直接将Protease直接加入到BufferGL。5.56℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次6.加入200μl无水乙醇，颠倒混匀10次，剧烈震荡。短暂离心，使管壁和壁盖上的液体集中到管底。第五节操作步骤7.将步骤5所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，吸附柱重新放回收集管中。2.加入200μlGR，用移液器反复吸打几次，使细胞悬浮。*10.吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入60μlBufferGE，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。7.向吸附柱中加入500μlBufferGW1，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8.向吸附柱中加入500μlBufferGW2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。9.10,000rpm离心2分钟，倒收集管中的废液。吸附柱置室温2分钟，以彻底晾干。第五节操作步骤11.取5-10μl基因组DNA，并加入2μl上样缓冲液，混匀，加样到1％琼脂糖凝胶点样孔中，电泳检测分析。*第六节注意事项（1）试剂配制及保存规范，离心管及Tip头需经高压灭菌处理。（2）基因组DNA长而弯曲，易断裂。操作过程中尽量轻缓，避免过度的溶液吹打转移，以及过高的温度。第六节注意事项*第七节结果分析第七节结果分析量：越多越好。量越多电泳区带越明亮。质量：a.纯度越纯越好。A260/A280越接近1.8越好b.分子量越大越好。DNA分子量大于30KB，可满足一般实验要求。1.0％的琼脂糖凝胶电泳，理想电泳结果:靠近点样孔，落后于Marker最后一条区带(约21KB)的位置可见一条明亮的区带。区带前方，不应有拖尾（降解），或较弥散的小分子量区带（RNA）。*M:λDNA/HindIII+EcoRIDNAMarker；1-5:基因组DNA基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果图第七节结果分析21226bpM12345*课程相关资源课程简介课程简介《医学分子生物学》----国家精品资源共享课，2013（http://202.197.64.71:4505/）《医学分子生物学》----国家精品课程(本科），2008（http://netclass.csu.edu.cn/jpkc2008）生命科学学院资源共享平台（http://life.csu.edu.cn）谢谢！xiongdehui@csu.edu.cn0731-84805449
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