《科研仪器学》总复习

一、名解1、流式细胞术：利用流式细胞仪，对处于快速直线流动的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 、分选的技术。2、生物芯片（DNA芯片或基因芯片）：DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合。将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。3、RCF（相对离心力）：在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是“g”。4、冷冻干燥冷冻干燥（以下简称冻干）就是将含水物质，先冻结成固态，而后使其中的水分从固态升华成气态，以除去水分而保存物质的方法。5、冻干曲线将搁板温度与制品温度随时间的变化记录下来，即可得到冻干曲线。比较典型的冻干曲线系将搁板升温分为两个阶段，在大量升华时搁板温度保持较低，根据实际情况，一般可控制在-10℃至+10℃之间。第二阶段则根据制品性质将搁板温度适当调高，此法适用于其熔点较低的制品。6．PCR技术PCR技术又称为聚合酶链式反应，其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理，体外合成目的DNA片段的方法。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。7．RT-PCRRT-PCR指逆转录PCR,是指从RNA或mRNA直接扩增获得目的DNA片段的过程.8．荧光定量PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 量。9．分子筛层析技术凝胶颗粒内部呈网孔状结构，分子质量大的蛋白质难以进入凝胶颗粒内部，主要从凝胶颗粒的间隙里通过，所受阻滞作用小，所以大分子蛋白质迁移速度快，先流出凝胶。分子质量小的蛋白质则容易进入凝胶颗粒内部，所受阻滞作用大，所以小分子蛋白质迁移速度慢，后流出凝胶，从而将分子质量大小不同的蛋白质分开。10．离子交换层析技术：蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质所带有电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。这样，当蛋白质混合物流经带电凝胶时，电荷吸引作用小的蛋白质先流过，而电荷吸引作用大的蛋白质后流过凝胶，从而把不同的蛋白质分开。11．吸附层析技术由于不同的蛋白质所含有的氨基酸的种类和数目不同，分子 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的极性氨基酸和非极性氨基酸的数目、分布区域不同，因此它与分子比表面积大的吸附剂间的相互作用力大小不同。根据此原理对蛋白质进行分离纯化。12．蛋白质组学蛋白质组(proteome)是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。13．双向电泳技术第一向:等电聚焦（IEF）：等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。第二向:SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE电泳是根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的pH缓冲系统中的分离。经过双向电泳能将蛋白质在一个二维平面分开。14．生物质谱技术质谱技术是蛋白质组学研究中最为广泛使用的蛋白质鉴定技术。其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（M/Z）的差异来分离并确定分子质量。质谱技术能从复杂的样本中定性、定量分析蛋白质，其灵敏度高，可达到fmol(10-15)乃至amol(10-18)，速度快，现已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。15．肽质量指纹图谱MALDI-TOF-MS常用于蛋白质的肽质量指纹图谱(peptidemassfingerprinting，PMF)鉴定。PMF是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹图谱(fingerprinting)。16．基质辅助离子化技术试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。17．超声空化超声波清洗的基本原理是基于超声在液体中的空化作用，当声压或声强达到一定值时，清洗液中的气泡迅速增长，然后突然闭合。在气泡闭合时，产生冲击波，在气泡周围产生1012～1013Pa的压力及局部高温，这种物理现象称为超声空化18、基因枪法又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速度的金属颗粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术。19、Westernblot(蛋白质印迹技术)将蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到尼龙膜或其他膜上，用抗体作为探针与之杂交，反应之后用放射自显影或底物显色来检测是否与抗体特异性结合的抗原。与DNA和RNA不同的是，蛋白质的转移只有靠电转移方可完成，反应时用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记第二抗体，二、填空1、使用流式细胞仪检测细胞周期、细胞DNA、RNA含量、总蛋白质含量用（线性）放大器，检测细胞表面表面抗原、膜受体分布（对数）放大器。2、影响DNA测序的因素：模板的影响、循环测序反应条件、电泳的影响。3、染色细胞核的染料：Hoechst33258（蓝）、DAPI（蓝）、FITC（绿）、PropodiumIodide（红）、CY3（红）。4、细胞融合的方法（电融合、聚乙二醇融合、病毒融合）。5、激光共聚焦显微镜的原理是利用（一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光）的成像。6、细胞穿孔的方法（电穿孔、磷酸钙沉淀法、激光钻孔法、微射弹法）。7、酶标仪中的光学检测方法（光度测定、荧光、时间分辨荧光、荧光偏振、化学发光）。8、DNA测序的主要方法（新生链的荧光标记、双脱氧末端终止法）。9、用于提取纯化生物大分子理化性质的离心机（分析性离心机），用于实验的（制备型离心机）。10、流式细胞术前向散射（FSC，小角散射），大小与细胞直径成正比，细胞越大，FSC越大；侧向散射（SSC，90°散射），与细胞内颗粒结构成正比，胞内颗粒结构越复杂质量越大，SSC越大。11、Ca2+荧光指示剂包括：Fura-2、indo-1、Quin-2。12、全自动DNA测序仪主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统；大致可分为自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区。13、全自动DNA测序仪根据电泳方式的不同分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型14、DNA测序过程包括：分离纯化模板DNA、DNA模板定量分析、测序反应、测序反应后纯化、on-line变性、毛细管电泳和检测和数据分析。15、DNA测序过程中，用荧光标记新生链时，分为多色标记法和单色标记法；根据标记部位不同，又分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法。16、激光共聚焦显微镜由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成。17．常规PCR技术包括变性、退火、延伸三个基本反应步骤。18．常规PCR反应体系由缓冲液、模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶和Mg2+组成。19．蛋白质的分离纯化方法中，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的。20．蛋白质的分离纯化方法中，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是依据不同蛋白质带电性质不同来分离纯化蛋白质；21．蛋白质细分级方法有分子筛层析、离子交换层析、亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、毛细胞电泳、等电聚焦电泳等22．蛋白质粗分级方法有硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超滤等。23．蛋白质组研究核心技术包括蛋白质分离技术(如双向电泳和多维液相层析)、蛋白质鉴定方法(如氨基酸序列分析和质谱技术）和生物信息学技术。24．质谱仪关键部件是离子源和质量分析器是两个关键的部件。其中质量分析器决定着质谱的准确度、灵敏度和分辨率等。25．核酸分子杂交探针标记有同位素和非同位素标记两种，其中，非同位素标记物主要有生物素、地高辛配体、荧光素等。26.电磁力平衡式电子天平最有代表性，其基本结构由托盘、磁铁、线圈、横梁、防护罩等组成。27．国家对分析实验室的用水规格进行了技术规定，将其分为三个级别。其中一级水用于要求严格的分析实验，如液相色谱分析用水等；二级水用于无机痕量分析，如原子吸收光谱分析用水等；三级水用于一般化学分析实验。28.超声波破碎仪由超声波发生器和换能器两部分组成。29.CO2培养箱使用时影响实验结果的因素有：二氧化碳浓度、湿度、温度。30.冻干机按系统可分为制冷系统、真空系统、加热系统和控制系统四个主要部分。31.高效液相色谱仪总体可分为4个部分，即进样系统、高压输液系统、分离系统和检测系统。32.超净工作台按其工作性能分为两大类：一类为正压型超净工作台，另一类生物安全超净工作台，又称为生物安全柜。34.影响电子天平称量精度的因素有预热时间、预压、读数时间、样品本身自然物理特性和变化造成的影响。35.水的纯化技术：蒸馏、离子交换、反渗透、电渗析、电析去离子技术、微孔过滤、消毒灭菌。36.影响移液器准确性的因素：操作错误、移液器损坏、操作条件的影响。三、简答1PCR的原理DNA在高温时也可以发生变性解链，当、温度降低后又可以复性成为双链。通过温度变化控制DNA的变性和复性，设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP，可完成特定基因的体外复制。高温变性，低温退火，适温延伸2流式细胞术的特点。1、实现对单列细胞的检测2、实现高通量检测3、多参数、多色荧光分析使对细胞识别技术更精确4、可定性定量分析细胞5、分选特定功能、性状的细胞3电穿孔仪与细胞融合仪的基本原理。电穿孔仪：细胞膜基本上是一绝缘体，膜两侧浸在含离子的电解质溶液中，在外加电场时，膜两边的电解质离子极化，形成外加膜电位差。高压电脉冲击穿细胞膜后，磷脂双分子层和细胞膜均可复原。细胞膜的复原不但与脂肪分子的排列和相互间引力有关，还与其他重要因素有关，如胶体渗透作用、溶液离子作用和膜蛋白的影响等。细胞融合仪：通过非均匀电场的电介质电泳作用，建立细胞(原生质体)间的紧密接触，形成细胞串。再利用高压脉冲的可逆击穿效应使接触区质膜上形成微孔，胞质通过微孔融合。4流式细胞仪的构成模块。流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统、分选系统。5荧光检测酶标仪的主要模块。1、一个激发光源（卤素灯氙灯、激光）2、荧光色团(染料)3、波长选择元件：滤光片对或光栅(区分激发光和发射光）4、检测发射光的检测器(光电倍增管,PMT)6超速离心机的主要使用注意事项。1、离心前预冷转子2、超速离心时，液体一定要加满离心管，避免离心管变形3、离心后清洁离心机腔体和转头，并擦干腔内冷凝水，打开门，直至腔内恢复常温7简述影响点穿孔仪和细胞融合仪的因素。1、采用指数型衰减波优于使用方形波2、达到临界电压，否则无法击穿细胞膜3、对于细菌由于有外膜，临界电压需要加大1～2个数量级。8分光光度计理想的光源条件是：1、提供连续的辐射；2、光强度足够大；3、在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；4、光谱范围宽；5、使用寿命长，价格低。9、双脱氧链末端终止法的原理：其原理是利用DNA的体外合成过程，但与普通PCR不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除有-脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入2’-双脱氧核苷三磷酸（2’-ddNTP），由于没有-OH，不能进行后续反应，使正在延伸的DNA链在此终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生DNA链的序列10．简述荧光定量PCR定量原理及计算方法反应最初，虽然产物是指数增长,但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加.当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。由于CT值处于指数期内，这时的反应成份不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR结果是可靠的，可以准确地反应体系中模板的初始量。如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数“决定；n为阈值线上扩增曲线之间的循环数（CT的差值）例如：10倍稀释的DNA样品，2n=10因此n=3.32，即CT值相差3.32个循环。11．荧光定量PCR的应用（1）实时监测产物量，计算初始模板量（2）基础研究的基因表达分析研究（3）临床病原体检测：病人体液中目标基因的检测：病毒,寄生虫,细菌（4）食品卫生检疫：a.转基因食品的检疫：根据转入基因的特异性区段设计探针b.食品中病原微生物的检测12．蛋白质分离纯化与鉴定的主要步骤（1）选择实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 （2）实验材料的预处理（3）蛋白质的提取（4）蛋白质粗分级（5）蛋白质细分级（6）蛋白质的鉴定13．蛋白质鉴定的相关要素（1）蛋白质分子质量（2）等电点（3）氨基酸组成及其顺序（4）免疫特性（5）结晶特性（6）生物学功能14．核酸分子杂交技术的原理有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe),与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。15．电子天平的工作原理基于通电导线在磁场中受到安培力的作用。当秤盘上放有被称量物体时，秤盘向下发生线性位移，触动电磁传感器，使原来处于平衡状态的两个光敏三极管在发光二极管的光量发生变化时产生电流，此电流经放大后反馈到磁铁内的线圈中，使受力增大，将秤盘托起，恢复至平衡位置。此时流经线圈的电流通过取样电阻时，产生电压降，电压值与被称量物体的质量成正比。电压信号经过放大、滤波等处理后，进行模／数转换。电流模拟信号转变成数字信号后，再经芯片处理，最终在显示器上显示出质量值。16.基因扩增的技术设备组成。由三部分构成：①模板DNA制备所需设备，主要为高速微量离心机或高速冷冻离心机；②PCR基因扩增仪；③DNA扩增结果判读和测定设备，主要有水平低压电泳仪、PCR核酸电泳槽以及紫外透射仪和DNA微量荧光计等。17.使用电子天平的注意事项1)在称量之前，特别是称量大量物质或连同容器一起称量时，一定要判断所称重总量是否在使用天平的称量范围之内，如超出称重范围，往往会引起天平故障。2)精确度高的天平常会因环境空气流动而引起称量结果漂移，造成测定结果不稳定，有些型号的仪器带有调整功能，可缩短称量时间。3)电子天平属精密仪器，应避免震动，减少移动。4)称量结束后在取走称量物之前应先关闭电源。5)天平周围及称量盘面应保持清洁。18.使用高压灭菌锅的注意事项1、易燃，易爆物品，禁用高压蒸气灭菌；锐性器械，不宜用此法灭菌；2、敷料包包扎及体积的影响：包裹不应过大、过紧；捆扎不宜过紧；包装使用的容器宜小而浅，并应带有通气孔。瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口；如有橡皮塞时，应插入针头排气；3、物品排列疏密的影响：消毒物品的体积不应超过灭菌室容积的85％。4、降温时待温度自然降至60℃以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。5、在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。6、在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。7、由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两个大气压的过热蒸汽，操作时，应有专人负责，每次灭菌前，应检查安全阀的性能，严格按照操作规程操作，以防压力过高发生爆炸，保证安全使用。8、一般认为按常规操作消毒物品就能无菌，这实际是一种错误观念。按常规操作只是一种正常消毒过程，并不能证明消毒物品已全部无菌，因此还要对灭菌效果进行测定。最普通的检验方法是将灭菌培养基放在37℃温箱培养24小时若无杂菌生长说明灭菌效果良好。19.超低温冰箱警报器启动报警的原因检查电源是否有问题或插头是否被拉出插座；检查内部温度计是否超出合适的范围；检查是否一次性置人物品过多。20.冻干过程中有两个放热过程和两个吸收过程。液体制品放出热量凝固成固体制品；固体制品在真空下吸收热量升华成水蒸气；水蒸气在冷凝器中放出热量凝华成冰霜；冻干结束后冰霜在冷凝器中吸收热量熔化成水。21.水蒸气的流动阻力来自以下几个方面：1)产品内部的阻力。水分子通过已经干燥的产品产生的阻力，这个阻力的大小与干燥层的结构和产品的种类、成分、浓度、保护剂等有关。2)容器阻力。容器的阻力主要来自瓶口，因为瓶口处截面积较小，瓶口处可能还有某些其他物品如带槽的橡皮塞、纱布等造成阻力。总之，瓶口截面积越大则阻力越小。3)机器本身的阻力。主要是冻干箱与冷凝器之间管道的阻力，管道粗、短、直则阻力小。另外阻力还与冻干箱和冷凝器的结构和几何形状有关22.基因枪的基本原理经适当处理后，使DNA液均匀地吸附在或包裹于微小的钨粉或金粉颗粒表面，利用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，发射出微弹与DNA的复合体，击中并高速穿透真空室中受体细胞的细胞壁及细胞膜，进入细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导人细胞或原生质体，获得整合与表达的目的。微弹复合体对受体细胞造成的损伤可以修复。23.激光共聚焦显微镜的工作原理？在它的光收集通道上包括两个光学系统：一是传统的光学组件，二是共聚集光圈。所谓Confocal共聚焦是指检测聚集光斑与检测点完全重合。这种光学结构保证了在聚集外部的光线不能达到信号探测器中。在共聚焦图像系统中的基本原则是：“只有聚集点是亮的，其余都是暗的”。由于这种简单明了的原理使得它的应用中有极大的灵活性。通过改变聚焦光圈，可以改变扫描光束的密度从而优化所选用的光源。通过光级NA透镜最小可形成大约0.5微米的扫描光斑。自由变换聚焦尺寸在检测较弱荧光时极为重要，它可以在图形质量及荧光亮度之间相互协调。四、问答1、激光共聚焦显微镜相较于普通显微镜的优势在哪里；此外，请简述激光共聚焦显微镜的应用。激光共聚焦显微镜能够形成完全聚集的3D样本图形。定位不同的荧光染料在3D样本图形中的着色位置。精确测量二维、三维平面及空间结构。具有识别空间位置的能力从而进行三维坐标定位。节省标本处理时间很少需要进行样本包埋用显微切片。应用：1、检测被一种或多荧光染料标记的样本2、检测样本荧光着色位置或其他特征3、完整观察新鲜或固定样本内部结构4、在活细胞或组织中描绘标记离子的荧光染料5、全程监控GFP转染后的细胞或组织2、冷冻干燥机的工作原理及对冻干制品的质量要求。冷冻干燥机的工作原理是将被干燥的物品先冻结到三相点温度以下，然后在真空条件下使物品中的固态水份（冰）直接升华成水蒸气，从物品中排除，使物品干燥。物料经前处理后，被送入速冻仓冻结，再送入干燥仓升华脱水，之后在后处理车间包装。真空系统为升华干燥仓建立低气压条件，加热系统向物料提供升华潜热，制冷系统向冷阱和干燥室提供所需的冷量。本设备采用高效辐射加热，物料受热均匀；采用高效捕水冷阱，并可实现快速化霜；采用高效真空机组，并可实现油水分离；采用并联集中制冷系统，多路按需供冷，工况稳定，有利节能；采用人工智能控制，控制精度高，操作方便。对冻干制品的质量要求是：生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。要获得高质量的制品，对冻干的理论和工艺应有一个比较全面的了解。冻干工艺包括预冻、升华和再冻干三个分阶段。合理而有效地缩短冻干的周期在工业生产上具有明显的经济价值。3、分光光度计吸收池的使用注意事项：①要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在1％洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。②严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。③严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。④吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：A=A1-A0高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个杯子的偏差置零。其他重要附件：高档分光光度计的样品室还可以更换各种重要附件，用于各种特殊量测。如换上“积分球”，可用来检测微弱透光和不透光的样品。换上“凝胶扫描装置”，可用于电泳凝胶胶条上样品带的扫描测量。4、如何使用荧光检测技术对细胞凋亡进行检测：Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。5、如何使用分光光度计对核酸进行定量。核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。6、荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点。1、都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系2、荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔3、荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成4、在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成7、请比较蛋白质与DNA测序过程的异同点。蛋白质测序DNA测序测序中判20种氨基酸且可能出现特殊的氨4种核苷酸断的复杂基酸性样品的性不同蛋白质和肽片段理化性质相不同DNA片段理化性质质差很大，存在不溶性和变性的问相差小，基本不存在不题溶性和变性的问题对样品量常为主要限制因素只要建立了克隆，样品的依赖性量不成问题测序速度手工操作者一天完成约4-5个残手工操作一天可完成数基的顺序，自动测序仪一天可完百个碱基的顺序，自动成约30个残基的顺序测序仪一天可完成数千碱基的顺序测定准确性常出现拼接和辨读错误准确性高费用高，对昂贵的仪器依赖性强较低，手工方法可满足一般测序要求8、影响电穿孔仪和电融合仪效率的因素(1)电脉冲的幅度、时间和脉冲波形使细胞膜不稳定而被击破的最低电压称为临界电压。大致上1～4kV/cm的电场加在半径为10μm的动物细胞上，即可产生膜的临界电压。植物细胞必须先把细胞壁去掉，剩下的原生质体的穿孔和融合所需电压与动物细胞相近；细菌的外膜相当强韧，所需临界电压也往往比普通动物细胞高1～2个数量级。脉冲的幅度只是要求条件之一。脉冲的宽度也必须比膜的充电时间和膜的弹性复原时间长，这样才能保证孔道在脉冲以后有机会继续开放一段时间。一般来说，宽度窄的脉冲，需要高幅度来弥补。太宽的脉冲往往会击破融合区外的细胞膜，导致细胞死亡，交流脉冲或多次脉冲能够充分利用脉冲电场的相向电泳压力，所以往往比单个直流(方形)脉冲有效。如果穿孔用的电脉冲，在以峰电压击破细胞膜后能以较低的电压维持孔道的短时间开放，则对提高穿孔效率有益，因此指数衰减的脉冲往往比同能量的方形脉冲有效。专门设计的脉冲形也许会比指数衰减形更有效，但指数衰减波形的脉冲最易制造，所以用途最广。(2)胶体渗透压和细胞膨胀细胞被脉冲击穿之后，水和一些离子可以自由进入，但大分子却不易通过击穿的小孔。由于渗透压的不平衡，水、部分离子和小分子会进入细胞，导致细胞继续膨胀而破裂。除非细胞膜在破裂前就复原。为避免细胞破裂，往往需要在细胞外的缓冲液加入大分子以维持渗透压平衡。在很多情况下，允许细胞稍微膨胀，会有助于引导药物和分子进入细胞，当水或缓冲液进入细胞时，会把孔道扩大，同时溶解在外液中的成分会随水流被带进细胞。所以一般在穿孔之前，把细胞放人稍低渗透压的缓冲液中，让细胞略微膨胀，细胞膜的张力也因而增高，横向张力可以帮助电压力穿破细胞膜。已有张力的膜很容易扩大，若用于电融合过程，初成的连接孔道也会较容易开扩，因而促成融合。在转染过程中，若需长链的DNA或质粒进入细胞，从理论上讲，需要很长时间，但由于细胞电穿孔后的复原时间仅几十分钟，即使电穿孔足够大，也不可能完成这一过程。但在实验过程中，电穿孔的转染效率比预期高很多。(3)细胞膜的复原穿孔后细胞膜复原的时间和过程随细胞而异，时间的长短也由复原期间的温度、外液的渗透压、所含离子和药物来决定。细胞膜复原的时间长些，有利于细胞外药物的扩散进入细胞内。对于有些操作过程，需要低温来延缓复原时间。但在复原过程中，细胞膜仍然是有漏洞的，所以内外的胶体渗透压必须仔细调节。在这段时间内，细胞仍然非常脆弱，所以应该避免机械振荡，尽量避免使用移液管或离心操作。细胞外液所含的离子，一方面影响细胞复原期间的细胞生存，另一方面也影响细胞膜复原的速度。以上几个最普通的因素，互相之间也有影响，例如，脉冲的强度和宽度大，孔也越来越多，药物进入快，融合的概率也高，但细胞对胶体渗透压和离子平衡也敏感。因此无论穿孔或融合的效率，在脉冲电压或宽度继续增高的条件下，往往会先达最高效率峰，然后急剧下降，原因就在于细胞死亡。最佳效率的条件是由多种因素匹配决定的，如果了解生物物理的原理，熟悉细胞的特性，就可以设计出适当的仪器和程序，进行电穿孔和电融合。9、PCR技术原理及特点：PCR技术又称为聚合酶链式反应，其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理，体外合成目的DNA片段的方法。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。其特点包括：（1）灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平；能从100万个细胞中检出一个靶细胞；病毒检测的灵敏度可达3个RFU；细菌检测的最小检出率为3个细菌（2）简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增（3）对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA10、蛋白质分离纯化的依据及其相应的分离纯化方法①蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质的肽链数目及每条肽链的氨基酸残基数目，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的；②蛋白质的带电特性蛋白质肽链的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸残基的侧链R基以及碱性氨基酸残基的侧链R基等，在不同的pH条件下会带有不同的电荷，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质；③蛋白质的溶解特性大多数蛋白质在水溶液中会形成稳定的胶体溶液，易溶于稀酸、稀碱或稀盐等，当破坏胶体稳定存在的条件时，蛋白质会沉淀析出，硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理；④蛋白质的变性与复性：蛋白质在一定的物理化学条件下会失去原有的空间结构、生物学功能以及部分理化特性等称为变性，在变性条件不剧烈，某些蛋白质在除去变性条件后会恢复原有的空间结构和生物学功能即为复性。例如，采用尿素变性复性的方法从包含体中纯化原核表达蛋白；⑤蛋白质的结晶：天然蛋白质在一定的物理化学条件下，浓度达到过饱和状态时就会结晶析出，如从鸡蛋中纯化溶菌酶等就可以采取结晶与再结晶的方法；⑥蛋白质分子表面的特性：蛋白质分子表面疏水氨基酸残基的数目、比例以及分布区域不同，因此它们与吸附剂的吸附作用力不同，蛋白质的吸附层析就是依据此原理；⑦蛋白质的分子形状：不同的蛋白质具有不同的分子形状，因此其与特定的配基(或配体)具有专一的结合特性，如酶与底物、酶与其抑制剂或激活剂，抗体与抗原，凝集素与葡聚糖等，亲和层析就是以此为依据；11、实验设计大肠杆菌中表达的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白的分离纯化(1)选择实验材料：大肠杆菌(含有His-GFP表达质粒)在液体LB培养基中培养，离心，除去LB培养基，收集菌体沉淀。(2)实验材料预处理：用蛋白质提取缓冲液悬浮菌体，离心后收集菌体沉淀，再用蛋白质提取缓冲液洗涤菌体一次，用少量提取缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下超声波破碎菌体，离心后的上清液即为绿色荧光蛋白粗提取液。(3)蛋白质粗分级：将绿色荧光蛋白粗提取液装入透析袋中浓缩，透析除去小分子杂质。(4)蛋白质细分级：使用镍亲和层析柱亲和纯化带有组氨酸标签的绿色荧光蛋白。(5)蛋白质的鉴定：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定绿色荧光蛋白分子质量，使用荧光分光光度计测定绿色荧光蛋白荧光光谱等。12、请分析蛋白质组学研究比基因组学研究难度大的原因。（1）蛋白质组的多样性：基因组作为遗传信息的载体，无论在什么样的生长条件下，它是始终不变的，然而，对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动状态，蛋白质组是具有多样性的。（2）基因与蛋白质不是一一的对应关系：一方面，人们已经发现有许多“拟基因”的存在，这些拟基因有和真基因相同的可读框，但却从不表达；另一方面，由于存在RNA水平上遗传信息的加工一mRNA编辑和蛋白质水平上遗传信息的加工一蛋白质剪接，许多蛋白质很难找到直接对应的可读框。所以，要想找到一个生物体基因组的全部基因和相应的全部蛋白质是一个非常困难的任务。（3）蛋白质组的动态性：一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。而作为新陈代谢的主要执行者的蛋白质组，在个体的生命活动中却总是变动不停。因为蛋白质的稳定性要比核酸差得多，在制备的过程中可能会发生降解或丢失。（3）蛋白质组的时空性：在蛋白质组的研究中，不仅要考虑时间因素，更要考虑空间的影响。首先不同的蛋白质分布在细胞的不同部位。它们的功能与其空间定位密切相关。要想真正了解蛋白质的功能，必须要知道蛋白质所处的空间位置。其次，许多蛋白质在细胞里不是静止不动的，它们在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里运动发挥作用。因此对于亚细胞蛋白质组学来说有两个难点：一是如何对细胞进行恰当的分级分离；二是如何区别亚细胞组成蛋白质和由于生理作用而在细胞不同区域进行运动的蛋白质。13、Westernblot的原理及其基本实验过程。首先将蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到尼龙膜或其他膜上，用抗体作为探针与之杂交，反应之后用放射自显影或底物显色来检测是否与抗体特异性结合的抗原。与DNA和RNA不同的是，蛋白质的转移只有靠电转移方可完成，反应时用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记第二抗体，