消毒技术规范2002版

PAGE—PAGE92—消毒技术规范TechnicalStandardFordisinfection(2002年版)中华人民共和国卫生部二○○二年十一月消毒技术规范TechnicalStandardFordisinfection(2002年版)中华人民共和国卫生部二○○二年十一月第一部分Part1总则GeneralPrinciple第二部分Part2消毒产品检验技术规范TechnicalStandardfortestingdisinfectionProducts第三部分Part3医疗卫生机构消毒技术规范TechnicalstandardforDisinfectionofMedicalandHealthStructures第四部分Part4疫源地消毒技术规范TechnicalStandardforDisinfectionofepidemicfocus消毒技术规范目录第一部分总则1.1引言11.2适用范围11.3术语11.4消毒产品功效检验的基本原则和要求31.4.1消毒产品检验基本要求31.4.2消毒产品理化检验基本要求71.4.3消毒产品毒理学实验基本原则81.4.4医疗卫生机构消毒、灭菌基本要求91.4.5疫源地消毒基本要求12第二部分消毒产品检验技术规范2.1消毒产品消毒效果检验技术规范152.1.1消毒剂杀微生物试验152.1.2消毒剂模拟现场和现场消毒鉴定试验432.1.3空气消毒效果鉴定试验532.1.4水的消毒效果鉴定试验562.1.5灭菌与消毒器械消毒功效鉴定试验622.1.6灭菌与消毒指示器材鉴定试验752.1.7灭菌医疗用品包装材料鉴定试验802.1.8抗（抑）菌试验832.1.9一次性使用医疗用品产品细菌和真菌污染的检测942.1.10隐形眼镜护理液鉴定试验992.1.11一次性使用卫生用品鉴定试验1022.2消毒产品理化检验技术规范1092.2.1消毒产品原料或单方制剂的测定法1092.2.2复方消毒产品有效成分含量测定的指导原则1232.2.3消毒产品稳定性测定1242.2.4消毒剂对金属腐蚀性的测定1242.3消毒产品毒理学实验技术规范1262.3.1急性经口毒性试验1262.3.2急性吸入毒性试验1282.3.3皮肤刺激试验1292.3.4急性眼刺激试验1312.3.5阴道黏膜刺激试验1322.3.6皮肤变态反应试验1342.3.7亚急性毒性试验1352.3.8致突变试验1362.3.9亚慢性毒性试验1462.3.10致畸胎试验1472.3.11慢性毒性试验1482.3.12致癌试验1492.3.13毒理学试验结果的最终判定150第三部分医疗卫生机构消毒技术规范3.1消毒与灭菌方法1523.2手术器械和用品的灭菌1683.3输注器材的灭菌1693.4一般诊疗用品的消毒1703.5内镜的消毒灭菌1713.6医务人员手的消毒1733.7皮肤与黏膜的消毒1743.8医院室内空气的消毒1753.9餐具和卫生洁具的消毒1763.10物体和环境表面消毒1783.11检验相关物品的消毒1793.12口腔诊疗器具与环境的消毒与灭菌1823.13织物的消毒1833.14污水的消毒处理1843.15污物的消毒处理1883.16尸体及其相关环境的消毒1923.17医院消毒灭菌的效果监测194第四部分疫源地消毒技术规范4.1常用消毒方法2064.2消毒面积与体积的测算2064.3消毒剂的应用2074.4紫外线强度及消毒剂浓度简易测定法2114.5各种污染对象的常用消毒方法2124.6疫区饮用水的消毒与管理2144.7疫源地消毒效果的微生物学评价2164.8各种传染病疫点消毒要求218附录A消毒试验用试剂和培养基配方226附录B疫点终末和随时消毒工作记录表2331.1引言根据《中华人民共和国传染病防治法》、《中华人民共和国传染病防治法实施办法》和《消毒管理办法》制订本规范。本规范含总则、消毒检验技术规范、医疗卫生机构消毒技术规范和疫源地消毒技术规范四个部分。1.2适用范围本规范适用于在中华人民共和国境内生产、经营、使用和检验消毒产品的组织，医疗卫生机构以及传染病疫源地和其他一切需要消毒的场所。1.3术语1.3.1消毒disinfection杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。1.3.2灭菌sterilization杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。1.3.3化学指示物chemicalindicator利用某些化学物质对某一杀菌因子的敏感性，使其发生颜色或形态改变，以指示杀菌因子的强度(或浓度)和/或作用时间是否符合消毒或灭菌处理要求的制品。1.3.4生物指示物biologicalindicator将适当载体染以一定量的特定微生物，用于指示消毒或灭菌效果的制品。1.3.5消毒剂disinfectant用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。1.3.6灭菌剂sterilant可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。1.3.7高效消毒剂high-efficacydisinfectant指可杀灭一切细菌繁殖体（包括分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子等，对细菌芽孢（致病性芽孢菌）也有一定杀灭作用，达到高水平消毒要求的制剂。1.3.8中效消毒剂intermediate-efficacydisinfectant指仅可杀灭分枝杆菌、真菌、病毒及细菌繁殖体等微生物，达到消毒要求的制剂。1.3.9低效消毒剂low-efficacydisinfectant指仅可杀灭细菌繁殖体和亲脂病毒，达到消毒要求的制剂。1.3.10有效氯availablechlorine有效氯是衡量含氯消毒剂氧化能力的标志，是指与含氯消毒剂氧化能力相当的氯量(非指消毒剂所含氯量)，其含量用mg/L或%浓度表示。（有效碘及有效溴的定义和表示法与有效氯对应）。1.3.11中和剂neutralizer在微生物杀灭试验中，用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂，使其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。1.3.12中和产物productofneutralization指中和剂与消毒剂作用后的产物。1.3.13菌落形成单位colonyformingunit，cfu在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。1.3.14自然菌naturalbacteria在消毒试验中，指存在于某一试验对象上非人工污染的细菌。1.3.15存活时间survivaltime，ST用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本有菌生长的最长作用时间(min)。1.3.16杀灭时间killingtime，KT用于生物指示物抗力鉴定时，指受试指示物样本，经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间(min)。1.3.17D值Dvalue杀灭微生物数量达90%所需的时间(min)。1.3.18杀灭对数值killinglogvalue当微生物数量以对数表示时，指消毒前后微生物减少的对数值。1.3.19杀灭率killingrate，KR在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值。1.3.20灭菌保证水平sterilityassurancelevel，SAL指灭菌处理后单位产品上存在活微生物的概率。SAL通常表示为10-n。如，设定SAL为10-6，即经灭菌处理后在一百万件物品中最多只允许有一件物品存在活微生物。1.3.21疫源地消毒disinfectionofepidemicfocus对存在或曾经存在传染源的场所进行的消毒。1.3.22随时消毒concurrentdisinfection有传染源存在时对其排出的病原体可能污染的环境和物品及时进行的消毒。1.3.23终末消毒terminaldisinfection传染源离开疫源地后进行的彻底消毒。1.3.24预防性消毒preventivedisinfection对可能受到病原微生物污染的物品和场所进行的消毒。1.3.25无菌检验sterilitytesting证明灭菌后的物品中是否存在活微生物所进行的试验。1.3.26生物负载bioburden被测试的一个单位物品上承载活微生物的总数。1.3.27暴露时间exposedtime消毒或灭菌物品受到消毒因子作用的时间。又称作用时间、处理时间。1.3.28人员卫生处理personneldecontamination对污染或可能被污染人员进行人体、着装、随身物品等的消毒与清洗等除污染处理。1.3.29载体carrier试验微生物的支持物。1.3.30抗菌antibacterial采用化学或物理方法杀灭细菌或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。1.3.31抑菌bacteriostasis采用化学或物理方法抑制或妨碍细菌生长繁殖及其活性的过程。1.4消毒产品功效检验的基本原则和要求1.4.1消毒产品检验的基本要求1.4.1.1消毒实验室的基本要求检验机构的微生物实验室应采取封闭式布局，建筑应便于清洁、消毒。为避免污染应在相对正压洁净条件下进行，但有时因特殊需要，用致病菌作指示菌时，则应在生物安全柜（负压）内进行。对无菌产品的无菌检查试验，必须在100级洁净度的实验室，或100级层流操作柜中进行。1.4.1.2无菌操作的基本要求（1）试验开始前，应以湿式方法清洁台面和打扫室内地面，然后以紫外线或其他方法对实验室内空气进行消毒；（2）实验人员应穿戴工作服、口罩、帽子；进行无菌检验时，需经风淋后进入实验室，然后，正确穿戴好无菌隔离衣、帽和口罩；（3）每吸取一次不同样液应更换无菌吸管，接种环（针）需在火焰上烧灼灭菌后，才可再次使用；（4）要求无菌的试剂，如蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、牛血清白蛋白、标准硬水、中和剂等，均需灭菌或过滤除菌；（5）无菌器材和试剂，使用前须检查容器或包装是否完整，有破损者不得使用；（6）正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中；（7）移液或接种时，应将试管口和琼脂平板靠近火焰，防止污染；（8）所有用过的污染器材，应立即放入盛有消毒液的容器中，以防止对周围环境和清洁物品造成污染；（9）若不慎发生微生物培养物摔碎或其他试验微生物泄漏事故时，不论是否具有致病性，均应立即对污染及可能波及的区域进行消毒处理；（10）全部试验结束后，应按常规对室内空气和环境表面进行消毒处理。1.4.1.3试验样品批次（件）的要求（1）消毒剂样品，送检单位应送检3批样品，样品包装和标识应与拟销售产品完全相同，在理化试验时，需检测3批样品，每批取1个样品平行测定2次，取平均值报告结果。在杀灭试验时，取3批样品中含量最低者进行试验。在毒理试验中，取3批样品中含量最高者进行试验。（2）消毒器械，送检单位应送检3件样品，大型器械可送检1件样品，标识应与拟销售产品完全相同。（3）化学指示物、生物指示物、灭菌包装、卫生用品和1次性使用医疗用品，送检单位应送检3批样品。1.4.1.4试验的基本要求（1）依据申报单位提供产品研制报告和产品的使用说明书进行检验。（2）用于评价消毒剂消毒效果的实验室试验应以悬液定量法为主，试验须重复3次。（3）用于评价医疗器械灭菌的消毒剂和消毒器械灭菌的功能鉴定试验应用载体定性法，试验应重复5次。在无特殊要求的情况下，一般以不锈钢圆片为载体。（4）对不宜用悬液定量法评价的消毒剂，如粘稠的消毒剂和冲洗消毒的消毒剂等的实验室试验用载体定量法，试验应重复3次。在无特殊要求的情况下，以布片为载体。（5）评价消毒剂消毒效果的实验室试验，试验浓度要用产品说明书规定的该消毒剂对某一有代表性消毒对象的最低使用浓度。试验设3个不同作用时间，原则上第一时间为说明书规定的最短作用时间的0.5倍，第二时间为最短作用时间，第三时间为最短作用时间的1.5倍。对多用途的消毒剂，消毒对象所涉及的微生物相同时，若使用浓度相同，选择各种用途中最短的作用时间。若使用时间相同，选择各种用途中最低的使用浓度。使用浓度低，作用时间短者与使用浓度高和作用时间长者同时存在时，以前者为准。使用浓度高，作用时间短者与使用浓度低，作用时间长者同时存在时，每个剂量均须进行试验。评价消毒剂灭菌效果的模拟现场灭菌试验，应用产品说明书规定的最低使用浓度和0.5倍的最短作用时间进行试验。评价消毒剂消毒效果的现场或模拟现场试验，应用产品使用说明书的最低有效浓度和最短作用时间进行试验。（6）在对消毒剂进行监督监测时，定量杀菌试验的消毒剂浓度和作用时间选择消毒对象中抗力最强的微生物，以说明书规定的最低浓度和最短时间验证其消毒效果。对用于灭菌的消毒剂则以说明书中规定的使用浓度和其0.5倍的作用时间验证其灭菌效果。（7）鉴定和监测多用途消毒剂与消毒器械消毒效果时，现场或模拟现场试验的消毒对象原则上是在类似物品中最难达到消毒合格者，如医疗器械消毒或灭菌选用止血钳；皮肤消毒选择人体前臂屈面皮肤；织物消毒选择棉布；一般物品表面（包括木质、塑料、橡胶、玻璃）消毒选择木质表面；餐具消毒选用竹(木)筷，不用于筷子消毒的可选用瓷质碗盘；地面消毒选择水泥地面；手消毒选择五指屈面；对于特指消毒对象而又在上述物品中不能选出有代表性物品时，则需用该特指对象进行试验。（8）对于经过充分清洗的消毒对象专用的消毒剂，可按其使用方法，在杀菌试验时可减低干扰物的浓度。1.4.1.5消毒产品鉴定测试项目的确定（1）有效成分含量的测定：有效成分系指具有杀菌作用的成分。所有化学消毒剂均应进行本项检测。所测含量在产品有效期内，不得低于企业标准的下限值。复方化学消毒剂测其杀菌主要成分的含量。植物消毒剂和用其提取物配制的消毒剂可不测定有效成分。（2）pH值的测定：所有消毒剂需测定消毒剂原液的pH值，固体消毒剂应测定最高应用浓度的pH值。对于需调节pH后使用的消毒剂则应在pH调节剂加入前后分别测定pH值。（3）稳定性试验：所有消毒剂均应进行稳定性试验，可用加速实验法37℃，90d和/或54℃，14d；也可选用室温留样法。以化学成分为主的消毒剂，用化学法进行稳定性实验；以植物为主要有效成分的消毒剂，用微生物法进行稳定性实验；以化学成分和植物为有效成分的消毒剂，同时用化学法和微生物法进行稳定性实验。（4）金属腐蚀性试验：用于金属物品消毒的消毒剂应进行本项检测，试验浓度应选择最高使用浓度。（5）微生物杀灭试验：所有消毒剂均应进行本项检测。试验前，必须先按不同种类的试验微生物分别进行相应的化学中和剂或其它残留消毒剂去除法的鉴定试验，选出适宜的中和试验微生物以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌(Escherichiacoli)8099作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC15442作为医院感染中最常分离的细菌繁殖体的代表；白色葡萄球菌(Staphylococcusalbus)8032作为空气中细菌的代表；龟分枝杆菌脓肿亚种(Mycobacteriumchelonaesubsp.abscessus)ATCC93326作为人结核分枝杆菌的代表；枯草杆菌黑色变种芽孢(Bacillussubtilisvar.niger)ATCC9372作为细菌芽孢的代表；白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC10231和黑曲霉菌(Aspergillusniger)ATCC16404作为致病性真菌的代表；脊髓灰质炎病毒-Ⅰ型疫苗株(Poliovirus-Ⅰ)作为病毒的代表。在上述规定的菌、毒株的基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌、毒株。不同用途的消毒剂和消毒器械，实验室杀灭微生物试验的代表微生物应按照表1-1所列者选择。若特指对某微生物有效时，则需进行相应微生物的杀灭试验。对于专用于灭菌，不作它用的消毒剂，只需做枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭试验，可不做病毒、真菌、分枝杆菌及细菌繁殖体杀灭试验，但对既用于灭菌，又用于消毒的消毒剂则按上述要求选择相应微生物进行试验；对枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭达到消毒要求（杀灭对数值≥5.00）的消毒剂，在不低于此浓度用作消毒时可不作病毒、真菌和分枝杆菌杀灭试验。表1-1杀灭试验中微生物的选择消毒对象微生物的种类金黄色葡萄球菌绿脓杆菌大肠杆菌白色念珠菌黑曲霉菌白色葡萄球菌龟分枝杆菌脓肿亚种枯草杆菌黑色变种芽孢脊髓灰质炎病毒手皮肤和黏膜++++++足+++空气+医疗器械和用品(灭菌与高水平消毒)+医疗器械和用品(中水平消毒)++++医疗器械和用品(低水平消毒)+++一般物品表面和织物++食(饮)具++饮水和游泳池水+瓜果、蔬菜+【注】表中‘+’为必做试验的微生物，消毒剂特指对某微生物具有杀灭作用者，则除按表中要求外，还需另选做该微生物杀灭试验。（6）模拟现场试验与现场试验：根据不同消毒对象按如下要求选择模拟现场或现场试验:用于、空气消毒的消毒剂须进行现场试验。用于饮水、手、皮肤、一般物体表面消毒的消毒剂任选模拟现场试验或现场试验。黏膜消毒剂的模拟现场试验或现场试验可用皮肤代替。用于食（饮）具、医疗器械和用品消毒的消毒剂进行模拟现场试验。其中医疗器械的模拟现场试验应区分消毒或灭菌。1.4.1.6消毒器械鉴定测试项目的确定消毒器械应根据产品功能与用途要求选择以下项目进行检测。对器械、耐压或电气性能及关键部件的使用寿命等的鉴定，由相关行业计量认证考核合格的检验机构按其标准进行检测，提供检验报告。（1）杀菌因子强度或浓度的测定杀菌因子指消毒器械所产生的具有杀菌作用的物理或化学因子。物理因子包括热、微波、紫外线等。对物理杀菌因子应测定其规定杀菌条件下的强度，如对热力杀菌器械应测量其温度，对紫外线杀菌器材测定其辐照度值。化学因子则由消毒器械产生具有杀菌作用的化学物质，常见有次氯酸钠、臭氧、二氧化氯等，可测定所产生消毒液中有效成分的浓度。（2）金属腐蚀性试验主要检测杀菌器械所产生化学杀菌因子对金属的腐蚀性。其要求与消毒剂的金属腐蚀性试验相同。（3）实验室杀灭微生物试验用于消毒的器械，应采用定量杀灭试验;用于灭菌的器械应做定性杀灭试验。（4）安全性试验包括电器安全试验和消毒器械产生的化学因子的毒理学试验。（5）模拟现场和现场试验用于消毒及灭菌的器械均须进行模拟现场试验。消毒器械产生的化学因子按消毒剂的要求进行模拟现场或现场试验。空气消毒剂需用进行模拟现场和现扬试验。1.4.1.7消毒产品有效成分含量表示方法有效成分含量以法定计量单位表示。复方消毒剂以其杀菌主要有效成分含量表示；植物消毒剂以百分浓度表示，如1份原液加4份水即该消毒剂溶液的浓度为20%。1.4.1.8对重复试验的要求对所要求的重复性试验，并不是只在同次试验中增加菌片数，或多作几份样本，而是应分期分批进行。必要的器材和试剂应重新制备或灭菌，以防产生系统性误差。中和剂鉴定试验，应将各组3次重复试验结果平行列出，以便对比分析。1.4.1.9最终评价的要求由于影响消毒与灭菌鉴定试验结果的因素很多，其中也包括试验的准确性和设计的科学性，所以在根据试验结果进行最终评价时应综合分析。除反复推敲试验过程和结果的准确性外，还应和国内外文献报导该消毒剂（消毒器械）的性能和不同试验方法所得结果进行比较，以判断所下结论有无不妥之处。如有不同于通常规律的结果，应重新考虑实验设计。如试验组距设置，消毒剂(器械)浓度(强度)测定和计算，实验条件(温度、湿度、pH值等)是否符合规定，特别要注意中和剂的选择试验是否符合要求等。必要时，还需要经过多种试验，多个实验室重复，查阅国内外文献，从各个角度证明，才能做出可靠的结论。1.4.1.10试验记录的要求实验室对所进行的试验，必须按计量认证（或实验室认可）要求认真观察试验结果，作好原始记录。为使记录规范化，须用表格方式记录，表格中应包括样品名称与编号、检验日期、检测项目、检测依据、试验条件、使用仪器编号、观察结果、试验者和校核者签名等栏目。表格中每一栏目应用蓝黑或碳素墨水逐项填写。一次试验填写一份表格。原始记录数据和计算应及时校核，整理装订附于检验报告后，入档保存备查。1.4.1.1检测报告的要求检测报告是试验情况和结果的书面表达，具有长期保存和法律价值，因此必须逐项填写清楚。因为技术规范或标准等的规定只写出共性部分，即使再详细亦难以包括所有情况和要求。各样品检测可能有其特殊性，因样品用途、用法不同，其检验条件和检验方法亦可随之改变，若检验报告中不说明其改变的情况，将会影响对所得结果做出准确的评价。凡是检验方法与本规范不一致或有更改者，必须详细叙述补充或删改的部分，以便阅读者了解检验工作的全过程，对检验样品的质量作出恰如其分的评价。检验报告的结果部分，用表格将各试验组、阳性对照、阴性对照及其他对照组的数据列出（定性的对照可用文字加以说明）。试验组应列出其杀灭对数值，杀灭对数值≥5.00时，无须列出具体数值，当杀灭对数值≤5.00时，则应列出具体杀灭对数值。并用文字简要叙述所得的结果。检验报告的结论部分，应根据试验结果得出明确的结论。此外，对试验中出现某些异常现象亦应加以说明。1.4.1.12实用剂量的要求日常消毒与灭菌中影响杀菌效果的因素较多，而实验室试验所规定的条件，均应控制在一个固定的范围之内，因此，需根据多种试验结果和实践经验确定。杀菌剂量包含有两个参数，一是杀菌因子的强度，二是作用的时间。在确定实用剂量时需考虑的因素主要有：污染微生物的种类和数量；有机物的含量；杀菌因子的稳定性；环境的温湿度变化；腐蚀性的强弱；酸碱度；消毒对象的性质；允许使用的浓度；允许作用的时间；杀菌因子的穿透能力；对人体和环境的危害等。实用剂量应符合下列要求：（1）申请检验单位应根据消毒产品的研制结果，针对不同用途，提出杀灭微生物有效、安全的实用剂量。（2）实用剂量不低于模拟现场试验或现场试验所测得的结果。（3）实用剂量应对人体和环境无危害，对物品无损害。1.4.2消毒产品理化检验基本要求消毒剂配方中不能含有“消毒剂禁用物质”，也必须符合消毒剂限量物质要求。消毒剂有效成分必须符合我国允许的消毒剂组分。1.4.2.1标准品或对照品的纯度≥99.0%；用标准品或对照品进行标定过的标准溶液作为含量测定的对照物也可。1.4.2.2以滴定法分析有效成分时，滴定液用量不宜超过滴定管所标示的量。文内规定滴定时所取样本的质量或容量(包括浓度)，均根据此原则设定。若所测消毒剂浓度过高，可适当减少取样量或经稀释后测定，以减少测定结果的误差；若消毒剂浓度过低，可增加取样量或采用灵敏度更高的方法进行测定。1.4.2.3溶液或消毒剂的有效成分含量的表示，以mg/L或mg/kg为主。采用百分数表述含量时有下列2种含义：①液体和液体之间为体积百分数，用“%”表示，即100ml溶液中含溶质若干ml，或100ml消毒剂中含有效成分若干ml；②固体和固体之间为质量百分数，用“%”表示，即100g消毒剂中含有效成分若干g；对固体和液体之间采用质量浓度表示（mg/L、g/L等），即1L溶液中含溶质若干mg或g，或1L消毒剂中含有效成分若干mg或g等。1.4.2.4方法中所用试剂的纯度涉及基准、分析纯、化学纯及色谱纯等，未作专门说明者，一般采用分析纯。配制滴定液试剂(如硫代硫酸钠)因配制后尚需专门处理，亦可用化学纯。1.4.2.5本规范中，“滴定液”是指经过标定，浓度准确至0.001mol/L～0.0001mol/L的溶液。未经浓度标定者则称“溶液”，以示区别。摩尔(mole，mol)为物质量的单位，当分子、原子或其它粒子等的个数约为6.02×1023时即为1mol。本规范中滴定液浓度的计算，除碘滴定液按原子量计算外，其它滴定液均按分子量计算。1.4.2.6滴定液的标定及所有样品测定均平行进行两次。将滴定管中滴定液补足至全量后滴定。所有试验结果(包括消毒剂有效成分测定及滴定液标定)应当以空白试验校正。所使用的滴定液应按要求在有效使用期内使用。1.4.2.7对仪器设备进行计量检定。玻璃仪器清洗干净，用蒸馏水冲洗3遍。所用容量瓶和量筒等不能加热。1.4.2.8容量分析实验室工作温度应控制在20℃～25℃。1.4.2.9送检3批具有代表性的样品。每批取1个样品平行测定2次，取平均值报告结果。1.4.2.10粉剂和片剂的取样量为测定所需量的10倍，经研磨后精确称取适量样品进行测定。1.4.2.11如果选用色谱法或分光光度法，进行方法可靠性论证时应附空白样品（不含被测成分的其它成分所构成的样品）、模拟样品（空白样品加有效成分的标准品）以及待测样品的色谱图或光谱图。如果无法提供空白样品，可用加入标准量法进行方法可靠性的论证。1.4.2.12对于本规范中测定方法不适用的产品，有效成分的测定，由厂家提供检测方法及方法可靠性的论证报告，经检验机构认可后方可采用。1.4.3消毒产品毒理学实验基本要求为了确保消毒剂的安全性，消毒剂除在配方组分或杂质（污染物）含量方面必须达到国家有关部门颁发的相关技术法规或强制性标准对它们的禁用或限用的要求外，消毒剂还需进行相应的安全性毒理学评价。1.4.3.1消毒产品毒理学实验评价程序消毒剂安全性毒理学评价，可分为4个阶段。(1)第一阶段(急性毒性试验、皮肤刺激试验和黏膜刺激试验)1)急性经口毒性试验2)急性吸入毒性试验3)皮肤刺激试验4)急性眼刺激试验5)阴道黏膜刺激试验6)皮肤变态反应试验(2)第二阶段(亚急性毒性试验和致突变试验)1)亚急性毒性试验2)致突变试验①体外哺乳动物细胞基因突变试验(体细胞基因水平，体外试验)L5178Y细胞基因突变试验V79细胞基因突变试验②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验(体细胞染色体水平，体外试验)③小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验(体细胞染色体水平，体内试验)④哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验(体细胞染色体水平，体内试验)⑤程序外DNA修复合成试验(DNA水平，体外试验)⑥小鼠精子畸形试验(性细胞基因和染色体水平，体内试验)⑦睾丸生殖细胞染色体畸变试验(性细胞染色体水平，体内试验)小鼠精原细胞染色体畸变试验小鼠精母细胞染色体畸变试验(3)第三阶段（亚慢性毒性试验和致畸胎试验）1)亚慢性毒性试验2)致畸胎试验(4)第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）1)慢性毒性试验2)致癌试验1.4.3.2各种消毒产品毒理学试验的规定为便于对消毒剂进行毒理学评价，将消毒剂分为三类。(1)第一类消毒剂：指我国首创或根据国内外文献报道首次生产的消毒剂。原则上需进行上述4个阶段的毒理学试验。首先必须做急性经口毒性试验(包括小鼠和大鼠)、亚急性毒性试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验和三项致突变试验(包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型试验)。根据试验结果，判断是否需继续做其它试验项目。(2)第二类消毒剂：指国外已批准生产、现由我国首次生产或首次进口的消毒剂。首先必须做急性经口毒性试验、亚急性毒性试验和两项致突变试验(包括反映基因水平和染色体水平两种类型试验)。根据试验结果，判定是否需继续做其它项目试验。(3)第三类消毒剂：指与国内已获准生产的消毒剂属于同类的产品或植物成分组配的消毒剂。首先必须做急性经口毒性试验和一项致突变试验(反映体细胞基因水平或染色体水平类型的试验)；若消毒剂（皮肤黏膜消毒剂）直接用于人体，并有可能重复接触的，还必须增做亚急性毒性试验。根据试验结果，判定是否需继续做其它试验。(4)室内空气消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须做急性吸入毒性试验和急性眼刺激试验。视其试验结果，判定是否需做其它试验项目。(5)手和皮肤消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须进行完整皮肤刺激试验。如果偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，采用一次完整皮肤刺激试验；如果每日使用或连续数日使用的消毒剂，采用多次完整皮肤刺激试验。接触皮肤伤口的消毒剂，还必须增做一次破损皮肤刺激试验；接触创面的消毒剂，应增做眼刺激试验。使用过程中，必需接触皮肤的其它消毒剂，也应增做完整皮肤刺激试验。根据消毒剂的成分，估计可能有致敏作用者，还需增做皮肤变态反应试验。(6)黏膜消毒剂：除按第一类、第二类或第三类消毒剂的要求进行毒理学试验外，还必须做急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验。如果偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，采用一次阴道黏膜刺激试验；如果每日使用或连续数日使用的消毒剂，采用多次阴道黏膜刺激试验。1.4.3.3毒理学试验用消毒产品样品的规定（1）受试样品必须是按照既定的生产工艺和配方进行规范化生产的消毒产品，其成分和浓度与实际生产和销售的相同。（2）提供受试样品与毒性有关的物理、化学性质的资料，以及消毒剂的配方、主要成分的化学结构和含量、pH值等，但植物成分组配的消毒剂可不提供化学结构。（3）进行安全性毒理学评价用受试物根据不同毒理学试验的目的，采用相应的受试物。1）在急性经口毒性试验、急性吸入毒性试验、亚急性毒性试验、致突变试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验、慢性毒性试验和致癌试验时，一般采用消毒剂原形样品。消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉剂、片剂或原液。对于二元或多元包装的消毒剂，以按比例混合配制后作为消毒剂原形。2）在皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用受试物的浓度，通常是对皮肤、黏膜消毒时应用浓度的5倍。使用原形（原液）对皮肤、黏膜进行消毒的消毒剂，则采用消毒剂原形（原液）作为试验受试物，不需对消毒剂原形再进行浓缩。3）在皮肤变态反应试验时，采用的诱导浓度应为引起皮肤刺激反应的最低浓度或原液，激发浓度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液。1.4.4医疗卫生机构消毒、灭菌基本要求1.4.4.1消毒因子作用的水平根据消毒因子的适当剂量（浓度）或强度和作用时间对微生物的杀灭能力，可将其分为四个作用水平的消毒方法。（1）灭菌：可杀灭一切微生物（包括细菌芽孢）达到灭菌保证水平的方法。属于此类的方法有：热力灭菌、电离辐射灭菌、微波灭菌、等离子体灭菌等物理灭菌方法，以及用甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢等消毒剂进行灭菌的方法。（2）高水平消毒法：可以杀灭各种微生物，对细菌芽孢杀灭达到消毒效果的方法。这类消毒方法应能杀灭一切细菌繁殖体（包括结核分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子和绝大多数细菌芽孢。属于此类的方法有：热力、电力辐射、微波和紫外线等以及用含氯、二氧化氯、过氧乙酸、过氧化氢、含溴消毒剂、臭氧、二溴海因等甲基乙内酰脲类化合物和一些复配的消毒剂等消毒因子进行消毒的方法。（3）中水平消毒法：是可以杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒方法，包括超声波、碘类消毒剂(碘伏、碘酊等)、醇类、醇类和氯已定的复方，醇类和季铵盐（包括双链季铵盐）类化合物的复方、酚类等消毒剂进行消毒的方法。（4）低水平消毒法：只能杀灭细菌繁殖体（分枝杆菌除外）和亲脂病毒的化学消毒剂和通风换气、冲洗等机械除菌法。如单链季铵盐类消毒剂(苯扎溴铵等)、双胍类消毒剂如氯己定、植物类消毒剂和汞、银、铜等金属离子消毒剂等进行消毒的方法。1.4.4.2医用物品对人体的危险性分类医用物品对人体的危险性是指物品污染后造成危害的程度。根据其危害程度将其分为三类：（1）高度危险性物品：这类物品是穿过皮肤或黏膜而进入无菌的组织或器官内部的器材，或与破损的组织、皮肤、黏膜密切接触的器材和用品，例如，手术器械和用品、穿刺针、输血器材、输液器材、注射的药物和液体、透析器、血液和血液制品、导尿管、膀胱镜、腹腔镜、脏器移植物和活体组织检查钳等。（2）中度危险性物品：这类物品仅和破损皮肤、黏膜相接触，而不进入无菌的组织内。例如，呼吸机管道、胃肠道内窥镜、气管镜、麻醉机管道、子宫帽、避孕环、压舌板、喉镜、体温表等。（3）低度危险性物品：虽有微生物污染，但在一般情况下无害，只有当受到一定量的病原微生物污染时才造成危害的物品。这类物品和器材仅直接或间接地和健康无损的皮肤相接触，包括生活卫生用品和病人、医护人员生活和工作环境中的物品。例如，毛巾、面盆、痰盂（杯）、地面、便器、餐具、茶具、墙面、桌面、床面、被褥、一般诊断用品(听诊器、听筒、血压计袖带等)等。1.4.4.3微生物对消毒因子的敏感性一般认为，微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序为：（1）亲脂病毒（有脂质膜的病毒），例如乙型肝炎病毒、流感病毒等。（2）细菌繁殖体。（3）真菌。（4）亲水病毒（没有脂质包膜的病毒），例如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。（5）分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、龟分枝杆菌等。（6）细菌芽孢，例如炭疽杆菌芽孢、枯草杆菌芽孢等。（7）朊毒（感染性蛋白质）。1.4.4.4选择消毒、灭菌方法的原则（1）使用经卫生行政部门批准的消毒药、械，并按照批准使用的范围和方法在医疗卫生机构和疫源地等消毒中使用。（2）根据物品污染后的危害程度选择消毒、灭菌的方法。1）高度危险性物品，必须选用灭菌方法处理。2）中度危险性物品，一般情况下达到消毒即可，可选用中水平或高水平消毒法。但中度危险性物品的消毒要求并不相同，有些要求严格，例如内窥镜、体温表等必须达到高水平消毒，需采用高水平消毒法消毒。3）低度危险性物品，一般可用低水平消毒方法，或只作一般的清洁处理即可，仅在特殊情况下，才作特殊的消毒要求。例如，在有病原微生物污染时，必须针对所污染病原微生物的种类选用有效的消毒方法。（3）根据物品上污染微生物的种类、数量和危害性选择消毒、灭菌的方法1）对受到细菌芽孢、真菌孢子、分枝杆菌和经血传播病原体（乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等）污染的物品，选用高水平消毒法或灭菌法。2）对受到真菌、亲水病毒、螺旋体、支原体、衣原体和病原微生物污染的物品，选用中水平以上的消毒方法。3）对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品，可选用中水平或低水平消毒法。4）对存在较多有机物的物品消毒时，应加大消毒药剂的使用剂量和/或延长消毒作用时间。5）消毒物品上微生物污染特别严重时，应加大消毒药剂的使用剂量和/或延长消毒作用时间。（4）根据消毒物品的性质选择消毒方法选择消毒方法时需考虑，一是要保护消毒物品不受损坏，二是使消毒方法易于发挥作用。应遵循以下基本原则：1）耐高温、耐湿度的物品和器材，应首选压力蒸汽灭菌；耐高温的玻璃器材、油剂类和干粉类等可选用干热灭菌。2）不耐热、不耐湿，以及贵重物品，可选择环氧乙烷或低温蒸汽甲醛气体消毒、灭菌。3）器械的浸泡灭菌，应选择对金属基本无腐蚀性的消毒剂。4）选择表面消毒方法，应考虑表面性质，光滑表面可选择紫外线消毒器近距离照射，或液体消毒剂擦拭；多孔材料表面可采用喷雾消毒法。1.4.4.5消毒、灭菌基本程序被甲类传染病病人，以及肝炎、结核、艾滋病、炭疽病等病人的排泄物、分泌物、血液等污染的器材和物品，应先消毒再清洗，于使用前再按物品危险性的种类，选择合理的消毒、灭菌方法进行消毒或灭菌处理。普通病人用过的物品，可先清洗后消毒。1.4.4.6消毒工作中的个人防护消毒因子大多对人是有害的，因此，在进行消毒时工作人员一定要有自我保护的意识和采取自我保护的措施，以防止消毒事故的发生和因消毒操作方法不当可能对人体造成的伤害。(1)热力灭菌：干热灭菌时应防止燃烧；压力蒸汽灭菌应防止发生爆炸事故及可能对操作人员造成的灼伤事故。(2)紫外线、微波消毒：应避免对人体的直接照射。(3)气体化学消毒剂：应防止有毒有害消毒气体的泄漏，经常检测消毒环境中该类气体的浓度，确保在国家规定的安全范围之内；对环氧乙烷气体消毒剂，还应严防发生燃烧和爆炸事故。(4)液体化学消毒剂：应防止过敏和可能对皮肤、黏膜的损伤。(5)处理锐利器械和用具应采取有效防护措施，以避免可能对人体的刺、割等伤害。1.4.5疫源地消毒基本要求1.4.5.1组织执行与人员（1）对甲类传染病和肺炭疽、艾滋病等乙类传染病必须在当地疾病预防控制和监督机构的监督指导下，由有关单位和个人及时进行消毒处理，或由当地疾病预防控制和监督机构负责进行终末消毒。（2）对乙类传染病中的病毒性肝炎、细菌性痢疾、伤寒和副伤寒、脊髓灰质炎、白喉、布鲁菌病、炭疽、钩端螺旋体病、流行性出血热、淋病、梅毒等和丙类传染病中肺结核，必须按照当地疾病预防控制和监督机构提出的卫生要求，由病人陪护人或所在单位进行消毒处理或由当地疾病控制机构组织进行消毒处理。（3）对丙类传染病中的急性出血性结膜炎、感染性腹泻等由病人或其陪护人进行消毒处理。（4）各类传染病(包括非法定传染病)爆发流行时应在当地疾病预防控制和监督机构的监督指导下，由有关单位及时进行消毒，或由当地疾病预防控制和监督负责对其进行消毒处理。（5）在医院中对传染病病人的终末消毒由医院安排专人进行。（6）非专业消毒人员开展疫源地消毒前应接受 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。1.4.5.2时限要求接到甲类传染病疫情报告和乙类传染病中的肺炭疽和艾滋病的疫情报告后，城市应在6h内，农村应在12h内采取消毒措施，其他传染病按病种不同应在24h至48h内采取消毒措施。1.4.5.3装备要求承担疫源地消毒任务的单位，应根据工作需要和条件配备消毒工具和防护用品，储备一定数量的消毒剂。(1)消毒工具：背负式喷雾器、气溶胶喷雾器、机动喷雾器、配药桶（10L）、刻度量杯（筒）、工具箱、消毒车。(2)防护用品：工作服、隔离服、防护眼镜、口罩、防鼠疫口罩、帽子、手套、长筒胶靴、毛巾、污物袋、手电筒、皮卷尺、雨衣、长柄毛刷、装工作衣的布袋（30cm×30cm×40cm）、肥皂盒、皮肤消毒盒（瓶）。(3)消毒剂：储备一定量的消毒剂并与有关厂家建立联系，确保处理突发疫情的需要。常用消毒剂有过氧乙酸、含氯消毒剂、碘伏等。1.4.5.4技术要求(1)疫区消毒1)消毒范围和对象：以传染源排出病原体可能污染的范围为依据确定消毒范围和对象。2)消毒持续时间：以传染病流行情况和病原体监测结果为依据确定消毒的持续时间。3)消毒方法的选择：以消毒因子的性能、消毒对象、病原体种类为依据选择消毒方法。尽量避免破坏消毒对象的使用价值和造成环境的污染。4)疑似传染病疫源地的消毒：可按疑似的该类传染病疫源地进行消毒处理或按下一条进行处理。5)不明传染病疫源地的消毒：应根据流行病学指征确定消毒范围和对象，采取最严格的消毒方法进行处理。6)注意与其它传染病控制措施配合：搞好传染源的管理，疫区的封锁、隔离，杀蝇、防蝇，灭鼠、防鼠，灭蚤，搞好饮用水、污水、食品的消毒及卫生管理，搞好环境卫生。加强易感人群的保护。7)填报消毒工作记录，必要时进行消毒效果评价。(2)疫点的随时消毒1)对病人应根据病情做到“三分开”与“六消毒”。“三分开”是指：①分住室（条件不具备可用布帘隔开，至少要分床）；②分饮食；③分生活用具（包括餐具、洗漱用具、便盆、痰罐等）。“六消毒”是指：①消毒分泌或排泄物（如呼吸道传染病主要为口鼻分泌物，肠道传染病主要为粪便，接触性传染病主要为脓液、痂皮等）；②消毒生活用具；③消毒双手；④消毒衣服、被单；⑤消毒患者居室；⑥消毒生活污水、污物。2)病人陪伴和护理人员，除做好病人的随时消毒外，应做好本人的卫生防护，护理病人后，应消毒双手。(3)疫点的终末消毒程序1)在出发前，应检查所需消毒用具、消毒剂和防护用品，做好准备工作。2)消毒人员到达疫点，首先查对门牌号和病人姓名，并向有关人员说明来意，做好防疫知识宣传，禁止无关人员进入消毒区域内。3)对脱掉外衣应放在自带的布袋中（不要放在污染或可能受到污染的地方）。穿隔离服、胶鞋，戴上口罩、帽子。用过氧乙酸或含氯制剂时，须戴防护眼镜。4)仔细了解病员患病前和患病期间居住的房间、活动场所，用过的物品、家具，吐泻物、污染物倾倒或存放地点，以及污水排放处等，据此确定消毒范围和消毒对象。根据消毒对象及其污染情况，选择适宜的消毒方法。5)进入疫点时，应先消毒有关通道。6)测量房屋、家具及地面需消毒的面积和体积，估算需消毒的污水量。7)必要时，由检验人员对不同消毒对象进行消毒前采样。8)消毒前应关闭门窗，将水缸盖好，将未被污染的贵重衣物、饮食类物品、名贵字画及陈列物品收藏好。9)如系呼吸道传染病，应对室内空气进行消毒。10)如系肠道传染病，应先于室内灭蝇，再进行消毒。11)对室内地面、墙壁、家具和陈设物品消毒时，应按照先上后下，先左后右的方法，依次进行消毒。12)病人用过的餐（饮）具、污染的衣物若不能集中在消毒站消毒时，可在疫点进行煮沸、浸泡或擦拭消毒。作浸泡消毒时，必须使消毒液浸透被消毒物品。作擦拭消毒时，必须反复擦拭2次～3次。对污染重、经济价值不大的物品和废弃物，在征得病家同意后焚烧。13)室内消毒后，必要时对厕所、垃圾、下水道口、自来水龙头、缸水和井水等进行消毒。14)对传染源密切接触者进行人员卫生处理。15)疫点消毒工作完毕，对消毒人员穿着的工作服、胶靴等进行喷洒消毒后脱下。将衣物污染面向内卷在一起，放在布袋中带回消毒。所用消毒工具表面用消毒剂进行擦洗消毒。16)必要时，到达规定的消毒作用时间后，由检验人员对不同消毒对象进行消毒后采样。17)填写疫点终末消毒工作记录。18)离开病家前，让病家开窗通风，擦拭打扫。(4)消毒人员注意事项1）出发前，要检查应携带的消毒工具是否齐全无故障，消毒剂是否足够。2）应主动取得病家合作和相关人员的配合。选择消毒因子时，应尽量采用物理法消毒。在用化学法消毒时应尽量选择对相应致病微生物杀灭作用良好，对人、畜安全，对物品损害轻微，对环境影响小的消毒剂。3）消毒过程中，不得吸烟、饮食。要注意自我保护，既要防止或减少受到消毒因子的伤害又要避免受到微生物感染。4)消毒过程中，不得随便走出消毒区域，禁止无关人员进入消毒区内。5)消毒应有条不紊，突出重点。凡应消毒的物品，不得遗漏。严格区分已消毒和未消毒的物品，勿使已消毒的物品被再次污染。6)携回的污染衣物应立即分类作最终消毒。7)清点所消耗的药品器材，加以整修、补充。8)填好的消毒记录应及时上报。2.1消毒产品消毒效果检验技术规范2.1.1消毒剂杀微生物试验2.1.1.1适用范围主要适用于消毒剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证，侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。2.1.1.2菌悬液与菌片的制备2.1.1.2.1适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。2.1.1.2.2试验器材（1）菌种:金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。（2）有机干扰物：见附录A。（3）磷酸盐缓冲液：见附录A。（4）无菌蒸馏水。（5）稀释液：见附录A。（6）细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）等，见附录A。（7）革兰染色液：见附录A。（8）芽孢染色液：见附录A。（9）恒温水浴箱。（10）玻璃漏斗。（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。（12）数字可调移液器（10μl，20μl，100μl，200μl，1000μl）及配套用一次性塑料吸头。（13）离心机。（14）电动混合器（15）浊度计。2.1.1.2.3细菌悬液制备程序（1）细菌繁殖体悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0ml～10.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。2）取菌种第3代～14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合（振荡）20s，或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4）细菌繁殖体悬液应保存在4℃冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。（2）细菌芽孢悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5ml～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18h～24h，即为第3代培养物。2）用10.0ml吸管吸取5.0ml～10.0ml第3代～5代的18h～24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5d～7d。3）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽孢形成率达95%以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。改良芽孢染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃条件下，加热30min。取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5%沙黄水溶液，染1min。水洗，待干后镜检。芽孢呈绿色，菌体呈红色。4）罗氏瓶培养物，用10.0ml吸管加10.0ml无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24h，使菌自溶断链，分散成单个芽孢。6）用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块。7）将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以3000r/min速度离心30min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。8）将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。9）将芽孢液放于80℃水浴中10min（或60℃，30min），以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。10）芽孢悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。11）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。2.1.1.2.4菌片的制备程序（1）消毒试验中使用的菌片是以菌液滴加于载体上制成。载体应根据消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为10mm×10mm。当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试管撞碎，故改用12mm直径圆形金属片（厚0.5mm）。（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：①将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30min；②以自来水洗净；③用蒸馏水煮沸10min；④用蒸馏水漂洗至pH呈中性；⑤晾干、熨平备用。（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经18h～2