鹿茸乙醇提取物对秀丽隐杆线虫抗衰老的作用

衰老是生理功能持续退化的过程，有关衰老的学说有免疫学说、遗传基因学说、端粒学说和自由基学说等。自由基学说认为随着年龄的增长和外界环境的有害刺激，会使机体代谢过程中产生大量自由基，并加速组织功能损伤或衰老［1-2］，大量抗衰老物质的研究是从抗氧化为入口进行探索，而衰老及与其相关的疾病已对人类健康和生命造成巨大威胁，成为当今医学界和社会界的重要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。因此，机体抗氧化作用能保持自由基产生与消除的平衡，对预防衰老有重要意义。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,C.elegans)具有生命周期短、易培养、与人类基因相似度高等特点［3-4］，使其成为抗衰老、抗氧化研究的生物模型［5-6］,并广泛用于药物研究及评价。已有研究表明,胰岛素/胰岛素样生长因子-1(Insulin/IGF-1)信号通路、饮食限制信号通路、线粒体信号通路，在线虫衰老调控中起重要作用［7-12］。紫薯提取物通过在胰岛素信号通路中调控相关抗氧化基因的表达水平,增强抗氧化应激能力,延长线虫寿命［13］。紫果苷提取物通过daf-16介导的途径延长线虫寿命［14］。枸杞通过调控线粒体内抗氧化基因的表达延长线虫寿命［15］。鹿茸的来源为鹿科动物梅花鹿、马鹿等雄鹿密生茸毛尚未骨化的幼角。其性味甘、咸,归肾、肝经,用于肾阳不足、精血虚亏、阳痿早泄、宫寒不孕、头晕耳鸣、腰膝酸软、四肢冷、溃疡久不愈合等［16］。鹿茸中含有丰富的蛋白质、多糖、磷脂等多种活性物质,胡太超等［17］通过测定鹿茸多肽对小鼠超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)等指标的影响，证明了鹿茸多肽能降低MDA水平,提高SOD、GSH-Px活性,加速自由基清除,增强小鼠抗氧化能力,达到延缓衰老和抗疲劳的作用。韩丛成等［18］通过研究复方鹿茸口服液对老年小鼠B型单胺氧化酶(monoamineoxidaseB,MAO-B)、SOD、MDA、脑单胺类递质的影响，证明了复方鹿茸口服液具有清除体内过多的活性氧自由基的作用,从而达到延缓衰老的效果。另外,鹿茸还具有提高免疫抗肿瘤、胃粘膜保护等作用［19-21］,有广泛的药用价值。以往研究鹿茸抗衰老作用常以小鼠为动物模型，本文选取鹿茸乙醇提取物(velvetantlerethanolextractVAEE、为材料，以秀丽隐杆线虫为模型，研究其对线虫衰老的影响，为鹿茸的深度开发利用提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器大肠杆菌(Escherichiacoli)OP50、野生型N2(Bristol)秀丽隐杆线虫(C.elegans)、突变体线虫clk-1(qm30)、daf-2(e1368)、eat-2(ad1116)CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)；鲜鹿茸吉林省长春市双阳鹿场；胰蛋白胨、琼脂粉、NaCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2O、酵母提取物、胆固醇上海萨恩科技有限公司；胡桃醌上海阿拉丁试剂公司；SYBRGreenBIO-RAD公司。RE-5型旋转蒸发器上海雅荣公司；KQ-50B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；FA2004N型电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司；LRH-70F生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司;T6新世纪紫外可见光分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司SMZ-161显微镜麦克奥迪公司；THZ-103B型恒温培养摇床上海一恒科学仪器有限公司；YM50立式压力蒸汽灭菌器上海三申医疗器械有限公司。1.2实验方法1.2.1鹿茸乙醇提取物的制备将鲜鹿茸切片为厚度是0.2cm,质量为30.8g,加5倍量的50%乙醇，88C。回流提取4次,每次4h。合并滤液,旋转浓缩至流浸膏,将其加入5倍量的80%乙醇,醇沉后合并滤液并浓缩至每1.95g浓缩液含1g原药材,浓缩液冷藏保存。1.2.2秀丽隐杆线虫的培养及同期化固体培养基(nematodegrowthmedia,NGM、配制：称4.0g琼脂、0.5g蛋白胨、0.6gNaCl加入100mL蒸馏水溶解摇匀,再加入1mol/LMgSO4溶液、1mol/LCaCl2溶液各200|J_,pH6.0磷酸氢钾缓冲液3.25mL,摇匀后补足蒸馏水至200mLo121C。高压蒸汽灭菌20min,温度降至60C。左右，加入200山5mg/mL胆固醇乙醇溶液,倒板备用。取L4期野生型N2线虫于涂布OP50的NGM培养基内,观察其产卵情况,开始产卵4h后,将L4期成虫挑去,将卵培养至L4期成虫,该批成虫即为同期化成虫。1.2.3对秀丽隐杆线虫衰老指标的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 加药组NGM配制方法同1.2.2,加入VAEE后需使NGM终浓度分别为5、2.5、1mg/mL,对照组NGM的配制方法同1.2.2，需加入与VAEE等量的蒸馏水。1.2.3.1寿命实验将同期化的野生型N2线虫，随机挑取50条至加药组（5、2.5、1mg/mLVAEE）与对照组，此时记为第0无20C。下培养,每天同一时间将线虫转移至新的同浓度培养皿内,并观察线虫的存活情况。线虫死亡及剔除标准：无运动迹象,用铂丝轻触后10s无反应；线虫因爬出培养皿失踪或致死、虫卵在体内孵化成袋样虫的不计入数据。实验重复3次,整理数据并绘制曲线。1.2.3.2紫外应激实验将同期化的野生型N2线虫随机挑取30条至加药组（5、2.5、1mg/mLVAEE）与对照组，20C。下培养3天，第4天于紫外条件下照射1h,再转入相应NGM中继续培养,此时记为第0天,每天更换培养基同时观察并记录线虫死亡情况,标准同上。实验重复3次，整理数据并绘制曲线。1.2.3.3热应激实验将同期化的野生型N2线虫随机挑取30条至加药组（5、2.5、1mg/mLVAEE）与对照组，20C。下培养3天，第4天于37C。下培养2h,再转入相应NGM中继续培养，此时记为第0无每天更换培养基同时观察并记录线虫死亡情况，标准同上。实验重复3次，整理数据并绘制曲线。将同期化的野生型N2线虫随机挑取50条至加药组与空白对照组，此时记为第0天，分别于第3、5、7、9天，随机取10条线虫置于M9中（M9配制方法：称取0.3gH2PO4,1.51gNa2HPO4.12H2O，0.5gNaCl，置于蒸馏水中定容至500mL，于121C。高压蒸汽灭菌20min，温度降至50-60C时为宜，加入无菌1mol/LMgSO4溶液500山），2min后观察30s内每条线虫的移动情况（身体摆动定义为头或尾从一侧摆向另一次侧）。实验重复3次，整理数据并作图。1.2.3.5产卵实验将同期化的L4期野生型N2线虫，随机挑取1条至加药组与空白对照组，每组10个培养皿，此时记为产卵第1天，每隔24小时将线虫挑至新培养基中，每天记录虫卵数目（产卵量），实验重复3次，整理数据并作图。1.2.4野生型N2线虫及突变体线虫氧化应激实验在20C。下将同期化线虫｛野生型N2线虫、突变体线虫clk-1（qm30）、daf-2（e1368）、eat-2（ad1116）｝于加药组、对照组NGM培养基内培养3天后，转入200ymol/L胡桃醌NGM培养基中，每板50条，全程尽量减少光照直射，于显微镜下连续观察线虫每小时的死亡情况，直至线虫全部死亡，死亡和剔除标准同上。实验独立重复3次，整理数据并绘制生存曲线。1.2.5q-PCR实验按照文献报道的方法［22-23］,取30条野生型N2线虫的成虫产卵4h,得到同期化的虫卵,然后将虫卵转移到加药组（2.5mg/mLVAEE）和对照组线虫的培养基上，线虫成长到成虫时期收集线虫，按照试剂盒说明书的方法测定基因gst-4、gst-7、skn-1、hsp16.2的转录水平。1.3数据统计分析数据分析采用GraphPadPrism8.0作图，实验结果采用“平均值±标准差”表示，利用两步差异分析法（ANOVA、作显著性差异分析，“*”表示P抗紫外辐射和耐热的能力也是考察抗衰老的一种表现。有研究表明，过度的紫外辐射会引起机体DNA损伤，诱导细胞凋亡［24］。李贞景等［25］发现花生四烯酸对紫外辐射损伤后的线虫具有一定的修复作用，能降低线虫体内活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS、的水平。本实验检测了鹿茸乙醇提取物对野生型N2线虫紫外应激和热应激的影响。实验结果表明，线虫在紫外辐射条件下，1mg/mL加药组与对照组相比不能延长线虫生存时间，2.5mg/mL加药组线虫平均寿命为2.81天（表1），2.5mg/mL与5mg/mL加药组与对照组相比，曲线明显右移，具有显著性差异。线虫运动能力和产卵量这两个指标同线虫的寿命具有直接相关性，能评价线虫的衰老速度。在寿命和紫外应激实验中2.5mg/mL鹿茸乙醇提取物作用效果最佳，因此选用此浓度检测线虫运动能力和产卵量。线虫的运动能力不但能够体现机体健康情况，还能反应神经系统的健康程度。从摆动实验结果可以看出，与对照组相比，从第5天开始鹿茸乙醇提取物能明显提高线虫的运动能力（图3A）；从产卵实验结果可以发现，与对照组相比，鹿茸乙醇提取物从第3天开始能显著提高线虫的产卵量（图3B）,表明其对线虫的生殖能力有正向增强作用，达到延缓衰老的作用。外界环境刺激以及线粒体会产生各种过氧化因子，如超氧阴离子、H2O2、羟自由基等，它们可以触发细胞内氧化反应，同时细胞进化了抗氧化防御系统，如SOD、GSH-Px、Vc、VE等［26-27］，来应对过量的活性氧。赵红玉等［28］发现鹿茸单一多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均有清除作用，具有抗氧化活性；陈晓光等［29］发现鹿茸多胺能明显提高小鼠清除自由基的能力，抑制脂质过氧化反应，具有抗氧化作用，Ding等［30］从鹿茸中提取纯化得到抗氧化四肽，它能够抑制肝细胞活性氧的产生，在体外及斑马鱼模型中表现出明显的抗氧化能力。胡桃醌能使暴露在其中的线虫体内活性氧增多，影响机体正常生理代谢，造成组织损伤导致线虫死亡［31］。本实验构建了200ymol/L胡桃醌氧化应激条件，考察了鹿茸乙醇提取物对野生型N2线虫在此条件下的生存时间。实验表明，各浓度加药组线虫的平均寿命均延长，且生存曲线较对照组都明显右移（表3,图4A）,表明鹿茸乙醇提取物具有明显的抗氧化应激能力，这可能与其含有多种能降低各种过氧化因子的活性物质有关。其中2.5mg/mL与5mg/mL加药组效果接近,但在寿命实验中2.5mg/mL加药组效果最佳,因此选用该浓度应用于突变体线虫。为进一步探究鹿茸乙醇提取物抗衰老作用机理,考察了3条相关信号通路的突变体线虫在氧化应激条件下的生存时间。实验结果表明,在胰岛素信号通路突变体线虫daf-2和饮食信号通路突变体线虫eat-2的氧化应激实验中,加药组与对照组相比线虫平均寿命延长，生存曲线明显右移（表3,图4B和4C）,鹿茸乙醇提取物能增强daf-2、eat-2突变体线虫的抗氧化应激能力,然而clk-1突变体线虫加药组与对照组的平均寿命和生存曲线无明显差异（P=0.8597）,表明鹿茸乙醇提取物抗氧化作用可能与线粒体信号通路有关通过在鹿茸乙醇提取物对线虫衰老影响的相关实验中，发现鹿茸乙醇提取物为2.5mg/mL时具有最佳的抗衰老作用。线虫寿命实验研究显示,VAEE为2.5mg/mL时线虫平均寿命为19.59天，最长寿命为28天，强于对照组；线虫紫外应激和热应激实验研究显示,VAEE为2.5mg/mL时线虫平均寿命分别为2.81天和3.28天,与对照组比具有显著性差异；VAEE在该浓度下与对照组比，从第5天开始能明显提高线虫的运动能力，从第3天开始能显著提高线虫的产卵量；野生型N2线虫氧化应激实验研究显示,VAEE为2.5mg/mL时线虫平均寿命为4.58小时，优于对照组；加药组与对照组clk-1突变体线虫在氧化应激实验中生存时间无明显差异，VAEE能够通过clk-1信号通路促进SKN-1细胞核转位降低内源性ROS，进而上调抗氧化基因gst-4、gst-7在线虫体内的表达。综上所述，鹿茸乙醇提取物具有抗衰老及抗氧化作用，本文为鹿茸的后续开发利用提供参考。