生物工程设备（电子图书）第七章 生物反应器的放大与控制

第七章  生物反应器的放大与控制 生物工程技术的最终目标是为人类提供服务，创造社会和经济效益。因此，一个生物工程产品必须经历从实验室到规模化生产直至成为商品的一系列过程，其研究开发包含了实验室的小试，适当规模中试和产业规模化生产等几个阶段。随着生物产品的生产规模增大，生物加工过程中的关键设备——生物反应器也逐渐增大。生物反应器的放大是生物加工过程的关键技术之一。 从小型的实验室生物反应器到生产规模的生物反应器，离不开工艺条件和参数优化。这时，就要对生物反应器的多项参数进行检测，利用自动化技术实现生物反应过程的最优控制。 本章就生物反应器的放大与计算、生物反应过程的参数检测与控制作一阐述。 第一节  生物反应器的放大 生物反应过程的工艺和设备改进的研究，首先在小型设备中进行，然后再逐渐放大到较大的设备中进行。然而在实践中往往是小罐中获得的规律和数据，常常不能在大罐中再现。这就涉及反应器放大的问题。生物反应器的放大是指将研究设备中的优化的培养结果转移到高一级设备中加以重演的技术，实际上也兼具生物反应过程放大的含义。它是生物技术开发过程中的重要组成部分，也是生物技术成果得以实现产业化的关键之一。 反应器的放大涉及内容较多。除涉及微生物的生化反应机制和生理特性外还涉及化工放大方面的内容，诸如：反应动力学，传递和流体流动的机理等。因此，它是一个十分复杂的过程。 目前反应器的放大方法主要有：经验放大法、因次分析法、时间常数法和数学模拟法。 一、经验放大法 经验放大法是依据对已有生物反应器的操作经验所建立起的一些规律而进行放大的方法。这些规律多半是定性的，仅有一些简单的、粗糙的定量概念。由于该法对事物的机理缺乏透彻的了解，因而放大比例一般较小，并且此法不够精确。但是对于目前还难进行理论解析的领域，还要依靠经验放大法。对于生物反应器来说，到目前为止，应用较多的方法也是根据经验和实用的原则进行反应器的放大和设计。下面介绍一下具体的经验放大原则： （一）几何相似放大 生物反应器的尺寸放大大多数是利用几何相似原则放大。所谓的几何相似指的是两台设备的几何形状完全相似。在几何相似放大中，放大倍数实际上就是反应器体积的增加倍数，即：                                                  （7-2） 和                                             （7-3） 式中  ——反应器的高度，m； ——反应器的内径，m； ——反应器的体积，m3； 下标“1”——-模型反应器； 下标“2”——放大的反应器。 若按几何相似放大法，当体积增加10倍时，生物反应器的直径和高度均放大101/3倍。 （二）以单位体积液体中搅拌功率相同放大。 以单位体积液体所分配的搅拌轴功率相同这一准则进行的反应器的放大，是一般机械搅拌式化学反应器的放大准则，可以将此准则应用于生物反应器的放大，即：                                                      （7-4） 对于不通气时的机械搅拌生物反应器，根据轴功率计算公式，可以得到：                                              （7-5） 因此                                                      （7-6） 所以                                                     （7-7）                                                     （7-8） 式中  ——不通气时的搅拌功率，kW； ——反应器的内径，m； ——发酵液的体积，m3； 下标“1”——模型反应器； 下标“2”——放大的反应器。 对于通气式机械搅拌生物反应器，可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大，即：                                                    （7-9） 根据通气时搅拌轴功率的计算公式，可知：                                                （7-10） 所以                                          （7-11）                                        （7-12） 式中  ——通气搅拌率； ——通气量； ——空气的线速度。 （三）以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大 生物细胞培养过程中空气流量的表示方式有两种： （1）单位培养液体积在单位时间内通入的空气量（ 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 态），即： ，m3/（m3·min）                                      （7-13） （2）操作状态下空气的线速度，m/h。 ，m/h   （7-14） ，m3/h                               （7-15） ，m3/（m3·min）                     （7-16） 式中  ——反应器内径，m； ——反应器的温度，℃； ——发酵液体积，m3； ——液柱平均绝对压力，Pa。 以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大时，有 ， 即                                      （7-17） 因此                                                  （7-18） 由上式可知，当体积放大100倍时，，如果忽略液柱压力，则即线速度增大4.64倍，其结果是显得空气线速度放大过多。 （四）以空气线速度相同的原则进行放大 以空气线速度相同的原则进行放大时有                                                       （7-19） 即                                             （7-20） 由上式可知，当体积放大100倍时，即，若忽略液柱压力，即，即通风量减少4.64倍，其结果是通风量过小。 （五）以相同的原则进行放大 在耗氧发酵过程中，由于氧在培养液中的溶解度很低，生物反应很容易因为反应器供氧能力的限制受到影响，因此以反应器的相同作为放大准则，往往可以收到较好的效果。 反应器的与操作条件及培养液的物性有关，在进行放大时，培养液性质基本相同，所以可只考虑操作条件的影响。 根据文献报道，与通气量、液柱高度、培养液体积存在如下的比例关系：                                                （7-21） 按相等的原则进行放大，则有：                                  （7-22） 故                                              （7-23） 又因为                                             （7-24） 所以                                                （7-25） 又因为                                               （7-26） 故                                        （7-27） 也有采用下面的表达式作为放大基础：                              （7-28） 因此                                            （7-29） 若以                                               （7-30）                                             （7-31） 按相同的原则进行放大，则：                                         （7-32）                                         （7-33）                                       （7-34） （六）搅拌器叶尖速度相同的准则 按照搅拌器的叶尖速度相等的原则进行放大。当大小反应器中搅拌器的叶尖速度相等时，，因此：                                                       （7-35） （七）混合时间相同的准则 混合时间是指在反应器中加入物料，到它们被混合均匀时所需的时间。在小反应器中，比较容易混合均匀，而在大反应器中，则较为困难。 通过因次分析，得到以下关系：                                 （7-36） 对于几何相似的反应器，时，从上式可以得出：                                                    （7-37） 需要指出的是上述放大方法是各强调一个侧重点，得出的结论往往有较大的差异。下表所列出的是10L小罐（n=500r/min，通气1VVM）放大到10000L（即放大1000倍）时，按照不同的放大准则所得出的结论，并以搅拌转速来进行比较。 表7-1 放大方法的比较 方法 放大后搅拌转速，r/min 方法 放大后搅拌转速，r/min 等体积功率   等氧质系数 79 非通气 107 等叶端速度 50 通气 85 等混合时间 1260 从表中的数据可以看到，按照不同准则放大，结果是放大后的反应器其他参数发生了悬殊的差别。这说明在放大中选用什么准则是很重要的，这要根据放大体系的特点而确定。 反应器的放大问题现在尚未解决，在放大时往往外还要凭借经验。有人统计，实际放大过程中应用最多的是和相同。 二、其他放大方法 除了上述的一些放大方法之外，还在实验中采用因次分析法、时间常数法、数学模拟法等。 因次分析法也称相似模拟法，它是根据相似原理，以保持无因次准数相等的原则进行放大。该法是根据对过程的了解，确定影响过程的因素，用因次分析方法求得相似准数，根据相似理论的第一定律（各系统互相相似，则同一相似准数的数值相等的原理），若能保证放大前与放大后的无因次数群相同，则有可能保证放大前与放大后的某些特性相同。 迄今为止，因次分析法已成功地应用于各种物理过程。但对有生化反应参与的反应器的放大则存在一定的困难。这是因为在放大过程中，要同时保证放大前后几何相似、流体力学相似、传热相似和反应相似实际上几乎是不可能的，保证所有无因次数群完全相等也是不现实的，并且还会得出极不合理的结果。 在生物反应器的放大过程中，由于同时涉及微生物的生长、传质、传热和剪切等因素，需要维持的相似条件较多，要使其同时满足是不可能的，因此用因次分析法一般难以解决生物反应器的放大问题。为此常需要根据已有的知识和经验进行判断，以确定何者更为重要，同时也能兼顾其他的条件。 时间常数是指某一变量与其变化速率之比。常用的时间常数有反应时间、扩散时间、混合时间、停留时间、传质时间、传热时间和溶氧临界时间等。时间常数法可以利用这些时间常数进行比较判断，用于找出过程放大的主要矛盾并据此来进行反应器的放大。 数学模拟法是根据有关的原理和必要的实验结果，对实际的过程用数学方程的形式加以描述，然后用计算机进行模拟研究、设计和放大。该法的数学模型根据建立方法不同，可分为由过程机理推导而得的“机理模型”、由经验数据归纳而得的“经验模型”和介于二者之间的“混合模型”。 机理模型是从分析过程的机理出发而建立起来的严谨的、系统的数学方程式。此模型建立的基础是必须对过程要有深刻而透彻的了解。 经验模型是一种以小型实验、中间试验或生产装置上实测的数据为基础而建立的数学模型。 混合模型是通过理论分析，确定各参数之间的函数关系的形式，再通过实验数据确定此函数式中各参数的数值，也就是把机理模型和经验模型相结合而得到的一种模型。 下图为数学模拟放大法用于一般过程开发的示意图   数学模拟放大法是以过程参数间的定量关系为基础的，因而消除了因次分析中的盲目性和矛盾性，而能比较有把握地进行高倍数的放大，并且模型的精度越高，放大率、倍数越大。然而模型的精密程度又建立在基础研究之上。由于受到这方面的限制，数学模拟实际取得成效的例子不够多，特别是对生物反应过程，由于过程的复杂性，这方面的问题还远没解决，但无疑它是一个很有前途的方法。 第二节  生物反应器的参数检测 一、生物加工过程的参数（物理、化学参数） 要对生化过程进行有效的操作和控制，首先要了解生化过程的状态变化，也就是要了解生化过程的各种信息。这些信息可以分为物理变量信息（如发酵温度）、化学变量信息（如pH）以及生物变量信息（如生物质浓度）。具体项目见下表： 表7-2  生物加工过程的物理、化学参数 物理参数 化学参数 间接参数 成熟 尚不成熟 温度 pH 成分浓度 氧利用速率（OUR） 压力 氧化还原电位 糖 二氧化碳释放速率（CER） 功率输入 溶解氧浓度 氮 呼吸熵（RQ） 搅拌速率 溶解 CO2浓度 前体 总氧利用体积氧传递系数 通气流量 排气氧分压 诱导物   位置 排气CO2分压 产物   加料速率 其他排气成分 代谢物 细胞浓度（X）     金属离子 细胞生长速率     Mg2+，K+，Ca2+ 比生长速率（μ） 培养液重量   Na+， SO42- 细胞得率（YX/S） 培养液体积   PO43- 糖利用率     NAD，NADH 氧的利用率 培养液表观糖度   ATP，ADP，AMP 比基质消耗率（υ） 积累量   脱氢酶活力 前体利用率 酸   其它各种酶活力 产物量（ρ） 碱   细胞内成分 比生产率 消泡剂   蛋白质 其他需要计算的值参数     DNA   细胞量   RNA 功率   功率准数 气泡含量   　 雷诺数 面积   　 生物量 表面张力 　 　 生物热 　 　 　 碳平衡 　 　 　 能量平衡 下面对其中的一些重要参变量简要加以说明 （一）设定参数 工业规模发酵对就地测量的传感器的使用十分慎重，不轻易采取一些无保证、未经考验的就地测量仪器。现在采用的发酵过程就地测量仪器是经过考察、很可靠的化学工厂也在使用的传感器，如用热电耦测量罐温、压力表指示罐压、转子流量计读空气流量和测速电机显示搅拌转速等。常规在线测量和控制发酵过程的设定参数有罐温、罐压、通气量、搅拌转速、液位等。 1．压强 对通气生物发酵反应，必须往反应器中通入无菌的洁净空气，一是供应生物细胞呼吸代谢所必须的氧，二是强化培养液的混合与传质，三是维持反应器有适宜的表压，以防止外界杂菌进入发酵系统。对气升式反应器，通气压强的适度控制是高效溶氧传质及能量消耗的关键因素之一。对嫌气发酵，如废水的生物厌氧生物处理，对反应体系内压强的监控也是十分必要的。 2．温度 不管生物细胞或是酶催化的生物反应，反应温度都是最重要的影响因素。不同的生物细胞，均有最佳的生长温度或产物生成温度，而酶也有最适的催化温度，所以必须使反应体系控制在最佳的发酵反应温度范围。 3．通气量 不论是液体深层发酵或是固体通风发酵，均要连续（或间歇）往反应器中通入大量的无菌空气。为达到预期的混合效果和溶氧速率，以及在固体发酵中控制发酵温度，必须控制工艺规定的通气量。当然，过高的通气量会引起泡沫增多，水分损失太大以及通风耗能上升等不良影响。 4．液面（或浆液量） 对液体发酵，反应器的液面或是装液量的控制是反应器设计的重要因素。液面的高低决定了反应器装液系数即影响生产效率；对通风液体深层发酵，初装液量的多少即液面的高低需按工艺规定确定，否则通入空气后发酵液的含气率达一定值，液面就升高，加之泡沫的形成，故必须严格控制培养基液面。特别地，对气升内环流式反应器，由于导流筒应比液面低一适当高度才能实现最佳的环流混合与气液传质，但在通气发酵过程中，排气会带出一定水分，故反应器内培养液会蒸发减少，因此液面的检测监控更重要，必要时需补加新鲜培养基或无菌水，以维持最佳液位。同理，连续发酵过程液位必须维持恒定，液面的检测控制也十分重要。 5．搅拌转速与搅拌功率 对一定的发酵反应器，搅拌转速对发酵液的混合状态、溶氧速率、物质传递等有重要影响，同时影响生物细胞的生长、产物的生成、搅拌功率消耗等。对某一确定的发酵反应器，当通气量一定时，搅拌转速升高，其溶氧速率增大，消耗的搅拌功率也越大。在完全湍流的条件下，搅拌功率与搅拌转速的三次方成正比，，其N中为搅拌转速。此外，某些生物细胞如动植物细胞、丝状菌等，对搅拌剪切敏感，故搅拌转速和搅拌叶尖线速度有其临界上限范围。 同时，搅拌功率与上述的搅拌转速的关系，是机械搅拌通气发酵罐的比拟放大基准。因而直接测定或计算求出搅拌功率也十分重要。 6．泡沫高度 液体生物发酵，不管是通气还是厌气发酵均有不同程度的泡沫产生。发酵液泡沫产生的原因是多方面的，最主要的是培养基中所固有的或是发酵过程中生成的蛋白质、菌体、糖类以及其他稳定泡沫的表面活性物质，加上通气发酵过程大量的空气泡以及厌气发酵过程中生成的CO2气泡，都会导致生物发酵液面上生成不同程度的泡沫层。如控制不好，就会大大降低发酵反应器的有效反应空间即装料系数低，增加感染杂菌的机会，严重时泡沫会从排气口溢出而造成跑料，这导致产物收率下降。 7．培养基流加速度 对生物发酵的连续操作或流加操作过程，均需连续或间歇往反应器中加入新鲜培养基，且要控制加入量和加入速度，以实现优化的连续发酵或流加操作，获得最大的发酵速率和生产效率。 8．冷却介质流量与速度 生物发酵过程均有生物合成热产生，对机械搅拌发酵罐还有搅拌热，为保持反应器系统的温度在工艺规定的范围内，必须用水等冷却介质通过热交换器把发酵热移走。根据生化反应器的热量平衡算式：                                                 （7-38）                                              （7-39） ——微生物发酵热，J/min； ——搅拌热，J/min； ——冷却水所带走的热量，J/min； ——冷却水流量，m3/min； ——水的比热容，J/min3·℃； ——冷却水出口温度，℃； ——冷却水入口温度，℃； 要维持工艺要求的发酵温度，对应不同的发酵时期有不同的发酵热以及冷却介质的温度，需相应改变其流量。故必须测定冷却介质的进出口温度与流量，据此也可间接推定发酵罐中的生物反应是否正常进行。 9．培养基质浓度和产物浓度 对生物发酵生产，基质浓度如糖浓度等对生物细胞的生长及产物生成具有重要作用，在发酵结束时，培养液基质浓度则是发酵转化率及产物得率的重要衡量。尤其是连续发酵和流加培养操作，发酵液中的基质浓度更为重要。类似地，产物浓度的测知也同样重要，因为掌握了发酵液中的产物浓度，就可确定发酵的进程以及决定发酵是否正常及是否需要结束发酵。所以基质与产物浓度的检测、控制对各种发酵均是必要的。 （二）状态参数 状态参数是指能反映反应过程中微生物的生理代谢状况的参数，如pH、DO、溶解CO2、尾气O2、尾气CO2、黏度、菌浓等。 1．黏度（或表观黏度） 培养基的黏度主要受培养基的成分及浓度、细胞浓度、温度、代谢产物等影响。而发酵液的黏度（或表观黏度）对溶液的搅拌与混合、溶氧速率、物质传递等有重要影响，同时对搅拌功率消耗及发酵产物的分离纯化均起着重要作用。 2．pH 生物发酵过程培养液的pH是生物细胞生长及产物或副产物生成的指示，是最重要的发酵过程参数之一。因每一种生物细胞均有最佳的生长增殖pH值，细胞及酶的生物催化反应也有相应的最佳pH范围。而在培养基制备及产物提取、纯化过程也必须控制适当的pH。因此生物反应生产对pH的检测控制极为重要。 3．溶氧浓度和氧化还原电位 好气性发酵过程中，液体培养基中均需维持一定水平的溶解氧，以满足生物细胞呼吸、生长及代谢需要。在通风深层液体发酵过程中，溶解氧水平和溶氧效率往往是发酵生产水平和技术经济指标的重要影响因素，不同的发酵生产和不同的发酵时间，均有适宜的溶氧水平和溶氧速率。故对生物反应系统即培养液中的溶氧浓度必须测定和控制。此外，发酵过程溶解氧水平还可以作为判别发酵是否有杂菌或噬菌体污染的间接参数，若溶氧浓度变化异常，则提示发酵系统出现杂菌污染或其他问题。 对一些亚好氧的生物发酵反应如某些氨基酸发酵生产，在产物积累时，只需很低的溶解氧水平，过高或过低都会影响生产效率。这样低的溶解氧浓度使用目前的溶氧电极是无法测定的，故使用氧化还原电极电位计（ORP仪）来测定微小的溶氧值。 4．发酵液中溶解CO2浓度 对通气发酵生产，由于生物细胞的呼吸和生物合成，培养液中的氧会被部分消耗，而溶解的CO2含量会升高。对大部分的好氧发酵，当发酵液中溶解CO2浓度增至某值时，就会使细胞生长和产物生成速率下降。例如组氨酸发酵，二氧化碳分压应低于0.005MPa；而精氨酸发酵，CO2分压应在0.015 Mpa以下，否则会使生产效率降低。当然，对光照自氧的微藻培养，则适当提高CO2浓度就有利于细胞产量的提高。 5．细胞浓度及酶活特性 生化反应过程都是通过菌体的各种酶类来促使反应进行的，而菌体的浓度与酶的活动中心密切相关。通过菌体干重的测定，可以了解生物的生长状态，从而控制和改变生产工艺或补料和供氧，保证达到较好的生产水平。当然，以酶做催化剂的生化反应，则酶浓度（活度）是必须检测监控的参变量。 6．菌体形态 在生化反应过程中，菌体形态的变化也是反应它的代谢变化的重要特征。可以根据菌体的形态不同，区分出不同的发酵阶段和菌体的质量。 （三）间接参数 间接参数是指那些通过基本参数计算求得的参数，如氧利用速率（OUR）、二氧化碳释放速率（CER）、比生产速率（μ）、体积氧传质速率（KLa）、呼吸熵（RQ）等。通过对发酵罐作物料平衡可计算后者反映微生物的代谢状况，尤其能提供从生长向生产过渡或主要基质间的代谢过渡指标。 1．呼吸代谢参数 微生物的呼吸代谢参数通常有三个：即微生物的氧利用速率，二氧化碳释放速率，和呼吸熵。假设流出反应器的气体流量与空气流入量相等，空气中氧浓度为21%，二氧化碳的浓度为零，测量到排出气体的氧浓度为，二氧化碳的浓度为，则由气相物料平衡计算可得： 氧利用速率（OUR）                              （7-49） 二氧化碳释放速率（CER）                                    （7-50） 呼吸熵（）                            （7-51） 其中  ——空气流量，m3/min； ——反应液体积，m3。 2．菌体比生长速率 每小时每单位重量的菌体所增加的菌体量称为菌体的比生长速率，单位为1/h。菌体的比生长速率与生物的代谢有关。例如，在抗生素合成阶段，若比生长速率过大，菌体量增加过多，代谢向菌体合成的方向发展，这不利于合成抗生素。菌体的比生长速率是生化反应动力学中的一个重要参数。 3．氧比消耗速率（rO2） 氧比消耗速率称为菌体的呼吸强度，即每小时每单位重量的菌体所消耗的氧的数量，其单位为毫克分子氧/克干菌体小时。例如，在抗生素生产过程中，根据抗生素比生产速率与氧比消耗速率的关系，可以求得菌体最适当的氧比消耗速率。 二、检测方法与仪器 研究微生物生长过程所需要的检测参数大多是通过在反应器中配置各种传感器和自动分析仪来实现的。这些装置能把非电量参数转化为电信号，这些信号经适当处理后，可用于监测发酵的状态、直接作发酵闭环控制和计算间接参数。图7-2为生物反应器配置传感器或检测装置的示意说明图。 一般可粗略地把检测仪器分成在线检测（On-line measurement）和离线检测（Off-line measurement）两大类。前者是仪器的电极等可直接与反应器内的培养基接触或可连续从反应器中取样进行分析测定，如溶氧浓度、pH、罐压等；而离线测量是指在一定时间内离散取样，在反应器外进行样品处理和分析的测量，包括常规的化学分析和自动实验分析系统。 表7-3典型生物状态变量的测量范围和准确度或控制变量的精度 变量 测量范围 准确度或精度，% 变量 测量范围 准确度或精度，%     温度 0~150℃ 0.01 MSL挥发物       搅拌转速 0~3000rpm 0.2 甲醇，乙醇 0~10g/L 1~5   罐压 0~2bar 0.1 丙酮 0~10g/L 1~5   重量 90~100kg 0.1 丁酮 0~10g/L 1~5     0~1kg 0.01 在线FIA:       液体流量 0~8m3/h 1 葡萄糖 0~100g/L <2     0~2kg/h 0.5 NH4+ 0~10g/L 1   稀释速率 0~1h-1 <0.5 PO43- 0~10g/L 1~4   通气量 0~2vvm 　 在线HPLC:       泡沫 开/关 　 酚 0~100mg/L 2~5   气泡 开/关 　 碳酸盐 0~100g/L 2~5   液位 开/关 　 有机酸 0~1g/L 1~4   pH 2~12 0.1 红霉素 0~20g/L <8   pO2 0%~100%饱和 1 其他副产物 0~5g/L 2~5   pCO2 0~100mbar 1 在线GC：       尾气 16%~21% 1 乙酸 0~5g/L 2~7   尾气 0%~5% 1 羟基丙酮 0~10g/L <2   荧光 0~5V — 丁二醇 0~10g/L <8   氧还电位 0.6~0.3V 0.2 乙醇 0~5g/L 2   RQ 0.5~20（mol/L）/（mol/L） 取决于传播误差 甘油 0~1g/L <9   传感器 0~100AU 变化很大 　 　 　   发酵过程对传感器的要求： 1.发酵过程对传感器的常规要求为准确性、精确度、灵敏度、分辨能力要高，响应时间滞后要小，能够长时间稳定工作，可靠性好，具有可维修性。 2.对发酵用传感器的特殊要求是由发酵反应的特点决定的，发酵底物中含有大量的微生物，必须考虑卫生要求，发酵过程中不允许有其他杂菌污染。 3.传感器与发酵液直接接触，一般要求传感器能与发酵液同时进行高压蒸汽灭菌，不能耐受蒸汽灭菌的传感器可在罐外用其他方法灭菌后无菌装入。 4.发酵过程中保持无菌，要求传感器与外界大气隔绝，采用的方法有蒸汽汽封、O形圈密封、套管隔断等。 5.发酵用传感器容易被培养基和细菌污染，应选用不易污染的材料如不锈钢，同时要注意结构设计，选择无死角的形状和结构，防止微生物附着及干扰，便于清洗，不允许泄漏。 6.传感器只与被测变量有关而不受过程中其他变量和周围环境条件变化影响的能力，如抗气泡及泡沫干扰等。 由于上述种种原因，使得许多传感器，尤其是检测化学物质浓度、微生物质浓度的传感器，很难在工业规模的生化过程中使用。 （一）主要参数检测原理及应用 1．温度的测量 常用的温度检测仪表有热电阻检测器（RTD）、半导体热敏电阻、热电偶和玻璃温度计等。其中热电阻是中低温区最常用的温度检测元件，具有性能稳定、测量精度高、在中低温区输出信号大、信号可以远传等优点。根据新的国家标准，热电阻的测温范围为-200~850℃。所以在生化反应和后处理过程中，这是最常用的测温元件。 大多数金属导体的电阻随温度而变化的关系可由下式表示：                                            （7-52） 式中  ，——分别为热电阻在t℃和t0℃的电阻值； α——热电阻的电阻温度系数，1/℃。 从上式可见，只要α保持不变（常数），则金属电阻将随温度线性增加。且α越大，灵敏度越大。纯金属的电阻温度系数α为（0.3~0.6）%1/℃，但是绝大多数金属导体的α并不是一个常数，它也随着温度的变化而变化，只能在一定的温度范围内把它近似地看作一个常数。 典型热电阻温度与电阻的关系见图7-3。 测温电阻材料最合适的原材料是铂（Pt），此外还有铜和镍等金属。图7-4为封装在玻璃管内的测温电阻元件的结构实例。线圈的芯子由与白金线膨胀系数相同的玻璃圆棒制成，在这个圆棒上开两个平行的槽，在上面往复缠上白金线并使其固定，这是为了防止电感应的缘故，再将线圈芯子放入玻璃管内，并把两端封死。套管式测温电阻是将测温电阻元件与无机绝缘材料一起牢固地封入在很细的不锈钢管前端的一种温度传感器。这种测温电阻具有响应速度快，抗震性强，对恶劣环境适应性强，弯曲加工容易等优点。 2．压强的检测 压力、压差传感器的测量原理大致可分为以下四个方面： （1）压力与弹性体的变形应力相平衡，并转换成弹性体的位移； （2）压力与别的流体压力或电磁力等相平衡，并将其变换成力或电流，这种原理多用于工业生产过程压力测量变送传感器； （3）压力与流体的重量相平衡，由对应的液体量求得压力，如U形管压力计； （4）压力与固体的重量相平衡，由对应的固体重量求得压力，多用来标定压力计。 工业上常用的为弹性压力计，主要有波登管式压力传感器、波纹管式压力传感器、膜式压力传感器、电阻应变片等。它们存在的共同性问题是温度对弹性的影响，滞后现象，时效性等。在具体应用上，因观测和控制的需要，通常把压力信号转换成电信号，以便能远距离监控。在生物反应器中，在压力表安装时必须注意使仪表的管路能够加热灭菌，尽量不存死角，这样才能保证反应器的无菌操作。 3．液位和泡沫高度的检测 在生化反应过程中，液位（或泡沫液位）测量有几种方法，其中最简便的方法是导电电极法。这种导电电极可用在不腐蚀导体的液体的液面测量。如图7-5所示，该测量方法可由一支或两支电极所组成，若罐体是金属材料制成的，可只用一支电极。当液面或泡沫达到不绝缘的金属棒的端点时，就会有电流信号产生，指示出液体或泡沫的存在。这种液位电极传感器所施加的电压一般不超过24V，电流大约为15mA。比较安全可靠的电压为交流10V。采用交流的目的是防止被测液体的极化。 （a）两支电极法               （b）单电极法 图7-5  电极法测液面   另一种泡沫传感器是电阻式泡沫电极。当电极垂直安装在罐体上时，其电极电流正比于不绝缘电极棒浸没入液体的长度，由此来测量泡沫液位高度。这种电极有单电极形式和双电极形式。当使用单支电极测量液位或泡沫液位时，往往由于结垢、微生物在电极上的附着等容易造成短路，出现虚假信号。当用该信号进行控制时，就会产生误动作。要防止这一现象发生，主要是在传感器上进行改进。一般用的是单电极传感器，现在可改用双电极传感器，如图7-6所示。这种双电极传感器，比单电极传感器多了一个电极，即保护电极（也叫截流环）。该保护电极能对应生化反应过程中的结垢污染、绝缘降低而造成的漏电流，产生一个相应的补偿作用，这样，就可以在比较恶劣的工作环境下工作，提高了泡沫液位测量准确性，确保泡沫液位控制系统的正确控制。 4．流量测量 测量流量的方法很多，所用的仪表结构各不相同。按照工作原理，流量仪表大致可分为三大类：容积式、速度式和质量式流量计。容积式流量计应用容积法测量流量，即以单位时间内所排出流体的固定容积数目作为测量依据来计算流量，它包括椭圆齿轮流量计、腰轮流量计、括板式流量计及旋转活塞式流量计等。其特点是流量的大小以及流体的密度、黏度等物理条件对精度影响较小，因而可得到较高的测量精度。速度式流量计主要应用流体力学法测量流量，即以测量流体在管道内的流速作为测量依据来计算流量。这类流量计包括差压式流量计、转子流量计、电磁流量计、涡轮流量计、靶式流量计等。质量流量计大致可分成两类：直接型质量流量计和间接型质量流量计。直接型质量流量计是通过直接检测与质量流量成比例的参数来实现质量流量的测量。间接型质量流量计则是通过体积流量计与密度计的组合来实现质量流量测量。下面简要介绍其中几种常见的流量计。 （1）差压式流量计 差压式流量计也叫节流式流量计，是流量测量中最成熟、最常用的一种流量计，它依据流体流动的节流原理，利用流体流经节流装置时产生的压力差来实现流量测量，其压力差与流体流量成对应关系。如图7-8这种流量计由节流元件、引压导管、差压计（或差压变送器及显示仪表）三部分组成。节流元件将被测介质的流量变换成差压信号，经引压管的传递，进入差压计或差压变送器及显示仪表进行显示。这种装置比较简单，长期用于液体、气体的流量测量。 （2）转子流量计 转子流量计由一根上粗下细的锥形管和一个能在其内上下浮动的转子所组成。如图7-9，被测流体自下而上从转子和锥形管内壁之间的环隙中通过，由于流体通过环隙时被突然收缩，在转子上下两侧就产生了压差，使转子受到一个向上的冲力而浮起。当这个力正好等于浸没在流体中的转子的重量时，则作用在转子上的上、下两个作用力达到平衡，转子就停留在某一高度上。如果流体流量增加，则作用在转子上的“冲力”加大，转子就要向上运动。而随着转子的上升，转子与锥形管之间的环形流通截面积增大，流速减低，因而“冲力”也就降低，当“冲力”再次等于转子在流体中的重量时，转子就停留在一个新的高度上。这样，根据转子平衡位置的高低，就可得知流量的大小。 转子流量计的刻度标定及实际流量与被测流体介质性质及工作状态有密切关系，当实际使用条件与刻度标定时的条件不一致时，就必须对流量指示值进行标定。对于液体流量。                                           （7-53） 其中，为被测液体实际流量；为用水标定的仪表刻度体积流量指示值（标准状态下）；为转子材料密度（通常采用耐酸不锈钢，）；为被测液体的密度；为标定介质水的密度（在101.3） 对于气体流量                                    （7-54） 其中，为被测气体实际体积流量（工作状态下）；为仪表刻度体积流量指示值（101.32kPa，293K下空气标定）；分别为工业状态下被测气体的绝对压力和绝对温度；、分别为工业标准状况时的绝对压力、绝对温度（）； INCLUDEPICTURE "http://swgcsb.jpkcc.com/site/datas/course/images/7/image094.gif" \* MERGEFORMATINET 、分别为标定气体（空气）和被测气体在标准状态（、）下的密度（）。 当用金属管转子流量计测量饱和蒸汽（温度不超过200℃）流量时，                                                 （7-55） 其中，为被测饱和蒸汽的质量流量；为仪表刻度体积流量指示值（101.32，293下，用水标定）；为被测饱和蒸汽密度。 INCLUDEPICTURE "http://swgcsb.jpkcc.com/site/datas/course/images/7/image109.gif" \* MERGEFORMATINET （3）电磁流量计 电磁流量计是利用电磁感应原理制成的流量测量仪表，凡是导电液体（如酸、碱盐溶液）以及含有固体颗粒或纤维的导电液体（如纸浆、泥浆糖浆、乳制品等）均可用它来计量。 电磁流量计由检测和转换两部分组成，前者将被测介质流量转换成感应电势，然后由后者转换成4~20mA直流电流作为输出，其原理如图7-10所示。在一段非导磁材料制成的管道外面，安装有一对磁极N和S，用以产生磁场，当导电液体流过管道时，因流体在磁场中作垂直方向流动而切割磁力线。根据法拉第电磁感应定律，这时在磁极垂直方向安装的两个电极上将产生感应电势。其大小为                                                      （7-56） 式中  ——感应电势，V； ——常数； ——磁感应强度，T； ——管道直径，m，即垂直切割磁力线的导体长度； ——垂直与磁力线方向的液体平均流速，m/s； 因为                                              （7-57） 即                                                       （7-58） 从其测量原理可看出，电磁流量计采用非接触式测量，具有压力损失小、反应速度快、测量范围大、输出信号不受液体的物理条件变化和流动状态的影响等特点。但被测介质必须是导电的液体，一般其导电率要求不小于水的导电率。 5．发酵液黏度的测量 发酵上常用的黏度测定仪毛细管黏度计、回转式黏度计和涡轮黏度计等。一般装设自动无菌取样循环系统，使发酵液通过取样管路流过回转式黏度计或毛细管黏度计，以实现发酵液黏度的连续在线检测。回转式黏度计测定范围为0.015~100Pa·S，响应时间数十秒，灵敏度为满刻度的±1%。 6．搅拌转速和搅拌功率 搅拌转速检测的常用方法有磁感应式、光感应式和测速发电机等三种。前两种测速仪是利用搅拌轴或电机轴上装设的感应片切割磁场或光束而产生脉冲信号，此信号即脉冲频率与搅拌转速相同。而测速发电机是利用在搅拌轴上或电机轴上装设一小型发电机，后者的输出电压与搅拌速率成线性关系。搅拌功率直接影响发酵液的混合与溶氧、细胞分散及物质传递、热量传递等特性，但目前，生产规模的发酵罐搅拌功率只是测定驱动电机的电压与电流，或直接测定电机搅拌功率，此功率中包含了传动减速机构的功率损失。 7．pH值的测量 为了测量pH值，需要一个测量电极和一个参比电极，其工作原理是利用玻璃电极与参比电极浸泡于某一溶液时具有一定的电位，其pH可表示为： pH                                           （7-59） 式中  ——标准电极电位，mV； ——被测溶液的玻璃电极电位，mV； ——法拉第常数； ——气体常数，8.314J/（mol k）； ——热力学温度，K； pH电极最重要的部位为玻璃微孔膜，若受到蛋白质等大分子污染吸附，则影响膜内外之间的质量传递，pH计的灵敏度和响应时间会下降和延长，此时必须用蛋白酶浸泡使蛋白质酶解溶出。 现在一般采用复合电极。在复合电极中，玻璃电极由参比电极包裹着。由式（7-59）可见温度对pH值的准确测量有很大的影响，为了补偿温度的影响，在pH复合电极中加一温度敏感元件，从而构成测量电极、参比电极和温度传感元件三位一体的三合一电极，对环境温度有很好的补偿作用。此外，电极内容会随使用时间尤其是高温灭菌而不断发生变化，必需在每批发酵灭菌操作前后进行标定，即用标准pH缓冲溶液校准。 8．溶氧浓度的检测 在工业发酵中因为要进行高温灭菌处理，所以发酵液溶解氧浓度的测量采用耐高温消毒的带金属护套的玻璃极谱电极。其化学基础是氧分子在阴极上还原，因而有电流产生，所产生的电流和被还原的氧量成正比，故测出此电流值就可以确定发酵液的溶氧浓度。用一层由聚四氟乙烯和聚硅氧烷做成的复合膜使电极与被测溶液分开。这层复合膜既有高的氧分子渗透性，又有贮氧作用。当在阴极（铂电极）和阳极（银电极）之间加一极化电压（0.6~0.8V），在有氧的情况下，在电极上将产生选择性的氧化还原反应，其反应式为： 值得注意的是，溶氧电极测得的是氧在溶液中的分压，即电极电位与氧分压有关，但与溶液中氧的溶解浓度没有直接关系，所以溶氧电极测量得到的信号并不是溶液中的氧浓度（mgO2/L）。但由Herry定律可知，溶液中的氧浓度与其分压（pO2）成正比关系，即： 式中  ——溶液中氧浓度； ——氧分压； ——溶解度常数； 如果溶解度常数是常数，那么氧电极电流就可以直接表示成溶液中氧的浓度。但事实上，溶解度常数不仅强烈地受温度的影响，而且随溶液的组成变化而变化。因此，通常用溶氧电极来测量发酵液中的氧含量时，只有当发酵罐温度、压力以及发酵液的组成一定时，才能准确地反应发酵液中的溶解氧。此外测定时要使电极周围的液体适度流动，以加强传质，尽量减小与电极膜接触的液膜滞流层厚度，并减少气泡和生物细胞在膜上积存，以保证溶氧测定的准确。 9．溶解CO2浓度的检测 发酵工业中，溶解CO2浓度的检测是利用对CO2有特殊选择渗透通过特性的微孔膜，使扩散通过的CO2进入饱和碳酸氢钠缓冲溶液中，平衡后显示的pH与溶解的CO2浓度成正比，由此原理并通过变换就可测出溶解CO2浓度。由于电极内的饱和碳酸氢钠在高温灭菌时会部分分解，故要每次灭菌校准后才能测定。目前商品化的溶解CO2浓度仪的测定范围是1.5~150g/m3，精度±2%~5%FS，响应时间数十秒至数分钟。 10．细胞浓度的测定 细胞浓度的测定分全细胞浓度和活细胞浓度。 全细胞浓度：尽管微生物培养一般都是纯种培养，但发酵液中的细胞在细胞龄、大小上仍有差异，最重要的是有活细胞和死细胞之分。其测量方法可分为湿重法、干重法、浊度法、湿细胞体积法等。其中干重法准确度最高。 常用的在线检测全细胞浓度仪为流通式浊度计。其原理为在一定的细胞浓度范围内，全细胞浓度与光密度（也称消光系数，OD）值成线性关系。流通式浊度计的光源可用单色光、激光或紫外光，最常用的是可见光或同一波长的激光束，前者波长范围在400~660nm之间，根据不同的生物细胞选用不同的波长。应当注意流通式浊度计适用于游离细胞，对丝状的霉菌、放线菌等的测量误差较大，不宜用此法，应用湿重法或干重法。此外，传感器的比色皿会因细胞附壁而增大测定误差，可通过提高发酵液流过光电比色皿的速度来减小误差。 活细胞浓度的测定：发酵液中活细胞浓度的测定原理是利用活生物细胞催化的反应或活细胞本身特有的物质而使用生物发光或化学发光法进行测定。活生物细胞为了维持呼吸与代谢，必须有一定的能量物质ATP，其含量视细胞种类及活性等不同有变化，生长条件相同的同一类细胞具有的ATP水平是一样的。当细胞死灭，其中的ATP就迅速水解而消失，因此可通过发酵液的ATP浓度检测来测定活细胞浓度。在ATP存在下，荧光素氧化酶可使荧光素氧化，同时生成荧光，反应发出的荧光强度与ATP浓度成正比，由此可检测发酵液中的活细胞浓度。此外，在生物细胞培养过程中的某一时期，相同细胞在同等培养条件产生的NADH量是不变的，在对数生长期，活细胞浓度与NADH浓度成正比，这也是荧光法测定活细胞浓度的依据。 国外报道用介电质测定微生物细胞浓度，其原理是利用生物细胞的介电性质，通过测定含有细胞的溶液的电容量，从而计算出细胞数，可做到在线测定。该测定电极由电介质、内侧电极、外侧电极组成，其特点是可测定浮游细胞和固定化细胞浓度；可在温度、pH、基质温度、离子浓度等变化条件下进行测定；可在有气泡、担体等固形物、悬浮物存在下进行测定；可测定活细胞；不影响培养发酵状态；测定时间短；可作灭菌处理。 11．高压液相分析系统（HPLC） 在发酵生产上往往有产物抑制生物质的生长或产物的形成的情况发生，为了获得高的产率，就必须对这些抑制物的浓度加以控制，使其保持在优化轨迹上。但至今对这些物质的大多数还缺乏工业可用的在线检测仪器进行浓度的测量。 高效液相分析系统广泛地用于液体系统组分浓度的分析，但都只是作为离线分析。在发酵过程中，发酵液中物质浓度的实验室分析测量往往要经过几个小时，HPLC的分析响应时间相对较短，可近似认为是在线测量。 利用HPLC在线测量物质浓度，并配有发酵出口气体CO2分析仪和pH与氧化还原电极的发酵系统。在图7-13中，CO2分析仪和pH与氧化还原电极的信号由一台HP-349A来采集，然后送给主机。产物的浓度，如木糖、乙醇和有机酸等，通过对发酵液采样过滤后进入过滤取样模件FAM（Filter Acquisition Module），再由HPLC系统进行分析。FAM-HPLC由一台PC来控制，这台PC测量记录FAM-HPLC分析的数据，然后再送给主计算机。在线的HPLC测量系统，首先将发酵液以100ml/min的速率连续取出，经过过滤把生物质从发酵液中分离出来，使清洁的发酵液注入到FAM-HPLC系统，多余的发酵液再循环回到发酵罐中。经过滤的清洁发酵液通过取样回路，以0.05ml/min排放出来。每30分钟，流经取样回路的样品在几秒内，把已过滤的发酵液25μl自动注到HPLC分析柱中。样品经分析，特定组分的浓度信号送到主计算机。主计算机根据这些信息来调整流加物质的流加速率。每30分钟采集分析一次，显然比4小时取样分析得到的数据及时。 12．流动注射式（Flow Injection Analyser）分析系统 由于生物传感器具有不能承受高温灭菌、测量线性范围小、适合的操作条件与生化过程环境不同等缺点，使其不能直接插入反应器内。1975年Ruzicka和Hansen首先提出了流动注射分析仪系统(FIA系统)，此后，Reed、Munch等人又对此系统进行了不断的完善和发展并将其应用于生化工程。FIA系统实质是将样品送至检测装置的一种手段，可以直接将样品送至检测装置，也可与载气、反应剂混合送至检测系统。1987年Reuss提出了自动取样过滤系统。从而，通过自动取样装置，传感器与FIA系统结合应用于生化过程进行在线测控。利用此系统，生物传感器不用直接插入反应器，而是安装在反应器外，被测样液经取样装置、FIA系统后样品被送至传感器检测单元，再与生物传感器接触反应产生信号。从而，生物传感器不必高温灭菌，样品也可进行适当的稀释，还可将样品进行预处理，并调整到合适的检测环境，克服了传感器尤其是生物传感器自身的缺点。另外，整个系统可随时进行调整而不会影响生化过程；还可运用多通道阀门进行多个样品同时检测，且整个过程不会影响样品的组成。该系统包括取样与样品预处理装置、泵、注射选择阀、传感器、信号转换和计算机。整个系统如图7-14所示。 样品经无菌取样装置，再经预处理后由注射阀注入与载气混合流经检测装置，产生信号转换数据经计算机处理，再按照数学模型及控制理论进行反馈控制。目前，取样过滤装置一般采用超滤膜过滤、交错流微生物过滤以及膜过滤电极，膜过滤电极最为常用。其安装方式有2种：一种是直接安装在反应器内，另一种是安装在反应器外，如图7-15所示。 （a）为膜过滤电极在反应器外，培养基经泵进入膜过滤单元，再经循环返回反应器内，由于培养基要返回反应器内，所以要求整个回路装置要保证无菌，常用蒸汽灭菌和化学灭菌法对整个回路进行灭菌。（b）为直接安装在反应器中，采用滤膜透析的原理，培养基通过渗透进入膜管内随缓冲液一起流出反应器，再进检测装置。虽然用这种取样方法能尽量避免染菌，但此法最大的缺点是细胞和培养基内小颗粒物质容易沉淀在膜上，使膜受到污染，所以要经常清洗和更换。也有人采用剥离膜，可方便膜的更换。目前常用的与FIA连用的生物传感器有电流式电极、pH电极、Bio－FET电极以及光学生物传感器、光纤维传感器、光发射二极管传感器、化学发光传感器。随着科技的发展将会有更多新型的电极出现如神经网络电极等。上述各种传感器与FIA连用可以实现生化过程化学物质、生物物质的浓度以及细胞浓度的在线测量，目前广泛应用于生化过程。例如，葡萄糖传感器、尿素传感器、乳酸传感器等生物传感器与FIA系统结合测定葡萄糖、尿素、乳酸的浓度；Hunchi等人将D型乳酸脱氢酶固定在碳胶电极上与FIA系统连用也可在线检控乳酸的浓度；Villadsen等人应用化学发光传感器于FIA系统，监控乳酸；Wandreyand利用NADH荧光电极与FIA系统连用监控氨基酸的生产和动物组织培养。光学生物传感器与FIA系统连用在线监控生化过程目前研究最为广泛，如Schmid利用光学生物传感器与FIA系统连用监控生化过程等；Bracewell利用回声光生物传感器与FIA系统连用监控从E.coli发酵液中提取抗体片段过程；利用荧光生物传感器与光发射二极管传感器结合监控绿色荧光蛋白质的生产等。另外，生物量是生化过程中一个重要参数，各种电极的应用使得在线测量生物量成为可能，如光学电极的应用，利用光的散射或吸收的电极主要用于测量微生物的细胞浓度。如Konstantinov利用高灵敏度的激光传感器测定细胞的浓度。目前还出现了荧光电极与FIA系统连用测定生物量，主要利用NADH荧光减少来测定生物量。而以声学、电学为基础的传感器也有所应用，Kilburn等人在培养人类细胞过程利用声学共振（ARD）控制生物量；Qualitz等人利用在线核磁共振光谱(NMR)控制生物量，此法主要用于中空纤维管反应器高密度培养动物细胞的监测。也可用电化学方法在线测定生物量，Blute等人利用以电传导率为基础的方法控制中空纤维管培养高密度细胞培养中的生物量。此外，还可利用测电容的方法控制生物量。 13．映像在线监控系统 目前，随着光学技术的发展，出现了在线监测细胞数目、尺寸和形态的系统，即直接将光学显微镜安装在反应器中，通过此系统可以观察到细胞的数目，单个细胞的尺寸和形态，还可利用荧光显微镜同时估计细胞代谢过程。Konstantinov 1994年提出了实时监控细胞的形态和尺寸，如图7-16所示。细胞浓度及细胞形态种类监测摄影仪(CCDcamera)直接安装在反应器中，观测到的映像经放大、计算后送至计算机进行进一步处理，从而得到细胞的数目以及单个细胞的形态、尺寸。利用在线映像监控系统已经成功控制酵母细胞絮凝现象。另外也可和FIA系统连用，如1985年Omann首次提出流体注射血细胞计数系统（FAFCS）之后不断地完善，Ruizhao等人利用此系统监控E.coli细胞。目前许多人都在进一步研究在线映像系统。 （二）在线发酵仪器的研究进展 有一种自动在线葡萄糖分析仪与适应性控制策略结合可用于高密度培养时控制葡萄糖浓度在设定点处。还有一种基于葡萄糖氧化酶固定化的可消毒的葡萄糖传感器曾用于大肠杆菌补料分批发酵中。采用流动注射分析（FIA）同一些智能数据处理方法（如基于知识的系统、人工神经网络、模糊软件传感器与卡尔曼滤波器结合）作在线控制用，可快速可靠地监测样品，所需时间少于2min。在线HPLC系统被用于监测重组大肠杆菌的计算机控制的补料分批发酵过程中的乙酸浓度。 光学测量方法在工业应用上更具吸引力，因它是非侵入性的而且可靠。有人开发了一种二维荧光分光术用于试验和生产规模生产，以改进生物过程的监测性能，此法基于荧光团（fluorphore），可用于监测蛋白质；用近红外分光法于重组大肠杆菌培养中的碳氮养分及菌量与副产物的在线测量；采用在线显微镜监测可以获得有关细胞大小、体积、生物量的信息。 此外，还研究了其他一些测量菌量的方法。这些方法是基于声音、压电薄膜、生物电化学、激光散射、电导纳波谱、荧光、热量计和黏度。一般，用传感器测得的信号并不与发酵过程变量呈简单的线性关联。但也能使测量值与用于控制的状态变量关联（如ATP或NAD（P）与菌量的关联）。但状态变量测量分析表明，测得的变量是多因素复合作用的结果。在适当的校验条件下，这些因素多数不大变动或可以相互抵消、并能关联。 Sato等在清酒糖化期间采用一种ATP分析仪（ATPA-1000）在线测量酿酒酵母的胞内ATP。用一种含有0.08%苄索氯铵（benzethonium chloride）的试剂萃取胞内ATP，萃液中的ATP浓度用FIA法测定，用一光度计测量细胞的荧光素-荧光素酶反映生物荧光强度——这些反应在分析仪中自动进行。不锈钢筛网过滤器的酵母细胞萃液被生理盐水自动稀释，然后将50μl经稀释的样品注入分析仪中。测量一个样品所需时间为4min，这些操作与测量都是在一定间隔时间内自动进行的。 下面简要介绍几种较好新的在线检测技术： 1．红外光谱技术 很多物质对红外线都有一定的吸收能力，且不同物质有不同特征吸收波段。红外线被吸收的数量与吸收介质的浓度有关，当其通过待测介质后，其强度按指数规律减弱，符合朗伯比尔定律。将光源的连续谱辐射全部投射到被测样品上，根据样品吸收辐射能的情况来判定被测成分的含量。一直以来，原位过程监测中红外光的传递和高性能红外探头的研制是难以解决的问题。近几年通过研究取得了巨大的突破，如借助光路系统或光导纤维来传递红外光，利用衰减全反射(ATR)原理，采用多次反射复合金刚石、锆等材料制做的红外探头，可适用于包括水溶液或其它强红外吸收溶剂、固体粉末或红外强吸收的样品，红外光进入样品的光程恒定，样品只要与全反射晶体材料紧密贴合即可。1992年，KunYu等用在线ATR探头跟踪了蔗糖水解、大肠杆菌发酵等过程，从蔗糖水解过程的红外谱图的变化，可清楚地看到蔗糖吸收峰的吸光度下降，葡萄糖和果糖吸收峰的吸光度增加，亦能判断完全水解所需要的时间，显示出ATR/FTIR用于在线控制过程的优势。 2．荧光检测技术 荧光检测可分为酶键合标记法、直接荧光测量法、荧光试剂测量法。 酶键合标记法采用专一性强的键合剂，根据标记与非标记物在键合中心的竞争性反应，测定由键合剂置换下来的溶液含量，由此测知代谢中间物或基质的含量。当采用荧光标记物时，就可以用荧光分析法进行测定。此种测定法多用光导纤维探头。二股光导纤维中的一股用来传输激发用的紫外光，另一股用来接收并传输测定室内(含有荧光标记物、待测物及被固定于光纤表面的键合剂)激发出的荧光，荧光经滤光片后由光敏器件接收，根据光强即可测知待测液中代谢物的浓度。 直接荧光测量法适用于测量自身能够受激发发生荧光的物质，可不加试剂直接在激发光照射下进行比色，由于一定的荧光物质只能吸收一定频率的光，而且能产生荧光的物质发出的荧光波长也不尽相同，因而只要控制激发光和荧光单色器的波长，便可得到好的选择性结果，仪器安装在培养液面下的反应器视镜上，激发光源经滤色片照射到培养液上，待测物产生荧光，荧光强度由光电倍增管测量，反射的激发光及其它波长的荧光在通过滤色片时被滤去。荧光试剂测量法适用于不能直接受激发出荧光，但具有与荧光素/荧光素酶产生光发射特征的物质。Lasko等将cDNA(控制荧光素酶合成)插入大肠杆菌的基因中，使其能合成荧光素酶。当在培养基中加入荧光素时，胞内ATP与荧光素在荧光素酶的催化下发生反应，并产生荧光。因荧光强度与ATP浓度有关，所以检测荧光可知ATP浓度。 3．离子敏场效应晶体管传感技术 是利用离子敏感薄膜或生物活性功能膜代替金属构成的新型有源半导体化学敏感器件。它与普通的场效晶体管的不同之处在于前者没有金属栅电极，栅极介质裸露或在其表面上覆盖对不同离子敏感的膜。当将器件置于待测溶液中时，栅介质(或离子敏感膜)直接与待测溶液接触。传感器对离子活度的响应可由栅介质与电解液界面处的电化学势对阈电压的影响来说明：                                               （7-60） 式中  ——阈电压； ——常数； ——离子敏场效应晶体管的灵敏度； ——待测离子的活度。 当参比电极及晶体管的其它参数恒定时，则阈值电压与待测离子活度的对数呈线性关系。 工业测量中的另一条途径就是采用间接测量的思路，利用易于获取的其它测量信息（secondary variable），通过计算机来实现被检测量（primary variable）的估计。近年来过程控制领域涌现的一种新技术——软测量技术（soft-sensing technique）正是这一思想的集中体现。软测量技术是以目前可有效获取的测量信息为基础，其核心是软测量模型是用计算机语言编制的各种软件，通过计算机实现重要过程变量的估计，其软件可根据被测对象的变化进行改造。在发酵过程中，由易测量的过程变量（如O2和CO2），借助于“软测量”模型，通过各种计算和估计，实现对待测过程变量（如生物量、产物浓度）的软测量。 链霉素是抗生素的主要品种，与一般的发酵过程相比，其发酵过程具有以下特点：链霉素是次级代谢产物，菌体生长与产物生成不平行；理论产量难以用物料平衡来推算；生产稳定性差。在链霉素发酵的不同阶段，既有菌体自身的生长、繁殖、老化，又有链霉素的合成及水解，存在多种生化过程，其复杂程度远远超过物理、化学过程，而且可能存在的酶反应超过几百个，影响因素繁多，相当一部分的作用仍然不十分清楚。由于以上原因，工业上链霉素的生产基本依靠生产经验，使生产中链霉素发酵水平时高时低，经济效益缺少保障。夏锋等通过从可测量的参数中选择主变量，确定发酵时间、粘度、碳源浓度、氮源浓度等为影响链霉素发酵的主要变量，利用RBF神经网络建立了链霉素发酵过程中产物浓度的软测量模型。结果表明其预测检验误差小，发酵中后期均保持在0.5%以内，发酵前期也不超过2%；而且学习效率较快，只经过了28代训练。 软测量技术的研究经历了从线性到非线性、从静态到动态、无校正功能到有校正功能的过程。软测量技术作为过程控制与过程检测研究的一个重要方向，将会得到更大的发展。 第三节  控制理论与应用 以上讲述了生物反应过程中的各种检测手段，然而检测的目的是为了基于它所提供的信息，对整个生化反应过程进行适当的控制，为生物质的生长和产物的形成提供适宜的条件，同时降低原材料和能量消耗。 一、生物过程的控制特征 发酵过程的一些特征使其比化学反应过程更易受控制。首先，生物反应器在很大程度上能自我调节，这是微生物靠长期进化培养出来的适应环境的能力。故突然消失的反应在生物过程中是不存在的，当遇条件不适，反应过程会自然衰减。许多生物过程运行并非绝对依赖过程的控制，但这并不等于不能通过优化控制来改进生物过程。如现有的探头和激励器，便可在较大范围内控制过程向所需方向进行。例如，调节得很好的控制回路通常可以维持过程温度或pH条件很接近所需值（如±0.3℃， pH±0.2）。发酵过程的第二易受控特征是其相当长的时间常数。此特征对生物过程的运行更为直接，对其过程控制进程相对慢些。 （一）温度的控制 生物反应的最佳温度范围是比较狭窄的，所以发酵过程需把生物反应器的温度控制在某一定值或区间内。最适发酵温度的选择往往既要考虑有利于提高生物合成反应的速度，又要顾及生物合成反应的持久性，同时还要兼顾其它环境条件的影响。此外，对于次级代谢产物的合成来说，由于初级代谢和次级代谢的酶系不同，适合于微生物生长和产物合成的温度也可能不同，故在整个发酵过程中应根据生长和产物合成的不同需要，在不同的发酵阶段选择不同的温度。影响生化反应温度的主要因素有微生物发酵热、电极搅拌热、冷却水本身的温度以及周围环境温度的改变。 生化反应器采用通冷却水的方式带走生化反应热。其冷却水冷却的方式有两种，小型的采用夹套冷却形式，而大型的生化反应器通常采用在反应器内装盘管冷却器的形式。 在冷却水温度比较稳定的情况下，生化反应器的温度常采用单回路的PID控制。这样的温度控制系统由四个环节组成，即温度测量元件，通常用铂热电阻温度计T，控制器，调节阀和被控过程的生化反应器（发酵罐）。 （二）pH的控制 发酵液的pH值既是培养基理化性质的反映，又是微生物生长代谢的结果，反过来又影响微生物生长和发酵产物的合成。不适当的pH值将显著降低微生物的生长速度，减少发酵产物，甚至完全没有发酵产物的形成。 前已述及，pH是发酵过程中代谢平衡，特别是碳、氮平衡的反映。一般说来，pH上升多半是碳代谢不足，这时应考虑增加培养基中糖浓度（采用补糖的办法）；相反，pH下降主要是由于碳源过量或氮源不足，这时应降低培养基中的糖浓度（减少或停止补糖）或增加容易利用的氮源的浓度（如补玉米浆、通氨或补硝酸盐）。因此，以pH作为补料控制的指标，在微生物发酵过程优化控制中有着十分重要的意义。例如，青霉素发酵采用调节补糖的方法维持pH的稳定，比用酸、碱调节pH的恒速补糖法，使最终发酵产量提高25%。其次，对于次级代谢产物，生长期与生产期的最适pH往往是不同的。 发酵过程中pH的控制首先要考虑基础培养基中生理酸、碱物质的平衡，使他们能够均衡代谢以保持pH的稳定性。其次是维持生理酸、碱性物质在补料中的平衡，使其不致因为补料而造成pH大的幅度波动。再次是当pH一旦发生较大的波动，在偏离最适pH范围前，适当加入酸、碱予以调节。 工业上常用的生化反应器的pH控制系统如图7-19。系统由pH测量电极和变送器、pH控制器、空气开关和气动开关阀组成。氨水不是直接加入反应器，而是通过空气管道与空气一起送入反应器，这样使氨水充分分散于发酵液中，不会造成局部pH值的偏高或偏低。为了防止调节阀门的泄漏，调节阀采用气动开关阀，它由电磁空气开关来控制。所以，pH控制系统是一开关控制系统，控制器根据pH偏差信号计算出开关阀门开关周期和开与关的时间长短，来控制输入的氨水的量，从而达到控制pH的目的。 （三）溶氧控制 由于微生物发酵过程涉及许多氧化反应，故氧作为反应的参与者和其它基质一样，它在发酵液中的浓度将直接影响产物的合成。但是氧在发酵液中的溶解度较低，一般不会像其他基质那样因过高的浓度产生生物合成抑制或阻遏反应，而较常见的是溶氧浓度过低对生物合成的限制。 由于溶氧浓度受到传氧与耗氧两方面影响，故它的控制也因从这两方面入手，从耗氧方面考虑，在以糖为生长限制基质的情况下，当溶氧浓度偏低时，可减少补糖率以降低菌体生长速率；反之，增加补糖率来提高菌体生长速率。在这种意义上，溶氧浓度可作为补料控制的依据。从传氧方面考虑，一般通过加大搅拌转速、通气量或罐顶压力的方法，提高氧传递速率。 溶解氧的控制系统如图7-20，图中溶解氧通过控制发酵罐压力和空气流量的方法来控制。系统由溶解氧电极和变送器、溶解氧多路控制器、压力控制系统和空气流量控制系统组成。由于压力控制系统与空气流量控制系统相互有影响，即有耦合作用。因为提高发酵压力，使发酵中二氧化碳的溶解度也增加，这不仅会改变发酵液的pH值，而且会影响氧的溶解度，因此，常用控制溶解氧的方法控制空气流量。 （四）补料控制 在补料发酵过程中，随着发酵的进行，微生物生长和代谢都要求连续不断地补充营养物质，使微生物生长沿着优化的生长轨迹生长，以获得高产的微生物代谢产物。由于微生物的浓度和代谢状况无法实时在线测量，使得补料控制一直都极为困难。近年来，随着理论研究和工业应用的不断发展，从补料方式到计算机最优化控制等都取得了较大进展。就补料方式而言，有连续流加和变速流加。每次流加又可分为快速流加、恒速流加、指数速率流加。从补加的培养基成分分，又可分为单一组分补料和多组分补料等等。 为了有效地进行中间补料，必须选择恰当的反馈控制参数，了解这些参数对于微生物代谢菌体生长、基质利用及产物形成之间的关系。采用的最优的补料程序也是依赖于比生长曲线形态、产物生成速率及发酵的初始条件等情况。因此，欲建立补料培养的数学模型及选择最佳控制程序，都必须充分了解微生物在发酵过程中的代谢规律及对环境条件的要求。 图7-21为工业上常用的发酵过程补料控制原理图。补料控制实际上是流量控制，整个控制系统由流量测量环节、流量控制器和调节阀组成。其中流量测量环节可用电磁流量计或带远传转子流量计来测量。 二、先进控制理论在反应器控制中的应用 （一）模糊逻辑控制在生化过程中的应用 在好氧性发酵过程中，发酵液中的氧参与菌体的生长、产物的形成和维持细胞代谢，因此发酵液中的溶氧(DO)是发酵过程的一个重要参数。影响罐内物料溶氧值的因素主要细菌需氧量、通风量、罐压及搅拌转速。其中发酵不同阶段的需氧量由实验及经验确定，是不可控因素。因此在搅拌器转速恒定的情况下，可控因素为通风流量和罐压。工艺要求罐压P和通流量Q稳定，超调小。工艺上罐压由进气调节阀的开度控制，通风流量则由出气调节阀的开度控制，两个回路之间相互关联，采用常规PI控制难于稳定，易失控及振荡，有较大的超调。因此在这两个控制回路中引入模糊控制概念，即将二者的相互影响适当量化，存入计算机内，实时控制时，先根据经验整定两组PI参数，注意将二者的频域拉开，然后对系统的响应(即P、Q)进行监测，根据预定的步骤和指标进行模糊推理，自动对PI参数超前修正。实施该控制 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 可基本上消除压力和流量回路的耦合。再根据发酵不同阶段的溶氧设定值调整通风流量，形成定罐压下的溶氧串级PID模糊控制，其框图如图1所示。其中：Ｐ为罐压回路，定值控制；Q为通风流量，串级副回路；DO为溶氧，串级主回路。   Tanaka等在碱性纤维素酶的工业规模发酵中采用一改良的基于模糊推理的故障检测系统来减少操作人员的监督时间。此检测系统可根据生产失灵程度的计算，自动将发酵过程分成正常、较不正常和异常3种状态。只有在较不正常的状态下才需要操作人员去监督操作。采用这种改良系统在125m3发酵罐中做了200批试验，只有2批属于异常，1批属于较不正常。使用结果，操作人员的总监督时间大为减少。 模糊控制的控制规则的来源依赖设计人员的经验，因此设计人员经验的正确与否以及是否最优，直接关系到整个模糊控制器的控制效果。且模糊控制器不具备学习能力，因此不可能根据过程的历史记录来消除人为设计的模糊规则的主观性。 （二）生化过程知识库系统 由于生化过程中的重要变量都无法在线测量，通过全面利用发酵过程的各种信息，如报批数据、实验室分析数据、配方数据和在线检测数据等，经综合分析了解真实的生化反应过程，从而指导操作的控制发展过程，具有重要的现实意义。因此，在管控一体化网络中建立了一个发酵过程知识库（KBS）系统。KBS中包括发酵过程监督知识库（BIO-KBS）和工厂统筹规划调度知识库，并与过程控制的状态估计、仿真、优化等相联系，这两个知识库都得到在线数据库的支持，数据库中存放所有有用信息，见图7-23。     KBS应用所获得的信息可进行发酵过程的实时控制，例如补料等策略，可对发酵过程的各种事故进行检测与诊断，并可进行多个发酵罐的生产计划调度，发酵产出率得到很大提高。Alford等简述了一种用于中试规模工业发酵的智能远程报警系统，它能进行自动数据分析、有效性检查、过程故障查找及放罐时机的判断。这样的知识库系统能应付不确定事物的发生，以启发式方式，结合定量与定性或符号表达式来再现老练的过程操作人员的操作。 （三）基于专家系统的人工神经网络 为进一步优化发酵工艺参数，采用了基于专家知识的人工神经网络。该网络模型采用5层感知机网络（MLP），用直接控制率确定最优控制规线(溶氧为主)，用误差反传法（BP）学习和确定神经网络参数和控制作用，从而弥补了现有工艺参数确定方法的不足，使系统具有较好的鲁棒性及控制方法的动态重复性，达到较满意的结果。在学习过程中，采用广义Ｓ型函数描述神经元的输入输出特性，首先设置系统ｋ=0时的初始条件，利用专家知识及直接最优控制策略求最优控制作用{ｕ（ｋ）.....}，将求得ｋ时刻的最优控制{ｎ(ｋ)}加入实际系统，并测量{ｚ(ｋ+1)}，用来训练神经网络模型参数，求出实际控制参数，其框图如图7-24 所示。 生化过程控制理论存在的难点： 1.无论是前馈还是反馈控制，都必须建立在在线监测的各种参数上，但适用于生化反应过程的传感器的研究大大落后于生物工业的发展。 2.各种微生物具有独特的生理特性、生产各种代谢产物又有各自的代谢途径，应用于生化反应过程的控制理论不具有普适性。 3.控制理论自身的局限，至今不能模拟生化反应过程的高度非线性的多容量特性。 4.在具体的控制模型构建时，缺乏以细胞代谢流为核心的过程分析，采用以动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法实质上是化学工程动力学概念在发酵工程上的延伸。目前发酵动力学模型主要通过经验法、半经验法或简化法得到，一般为非结构动力学模型，如Monod、Moser、Tessier、Contois等模型方程。国内外都有学者提出基于参数相关的发酵过程多水平问题的研究。