消毒剂安全性毒理学评价程序和方法

ICS 11.080C59中华人民共和国国家标准GBXXXXX—XXXX消毒剂安全性毒理学评价程序和方法ToxicologicalproceduresandmethodsofsafetyevaluationfordisinfectantXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施/目  次前言Ⅱ引言Ⅲ1　范围12　消毒剂安全性毒理学评价程序13　消毒剂毒理试验项目确定原则24　毒理试验用受试物的要求35　消毒剂安全性评价的毒理试验方法35.1　急性经口毒性试验35.2　急性吸入毒性试验115.3　皮肤刺激试验135.4　急性眼刺激试验145.5　阴道黏膜刺激试验175.6　皮肤变态反应试验185.7　亚急性经口毒性试验205.8　致突变试验215.9　亚慢性毒性试验335.10　致畸胎试验345.11　慢性毒性试验365.12　致癌试验376　对消毒剂的安全性评价38参考文献40前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由中华人民共和国卫生部负责解释。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心。本标准主要起草人：金银龙、王有森、班海群、李毅民、张流波。引  言消毒是切断传染病传播途径、预防疾病和保障人体健康的重要手段。判定消毒剂合格与否的两个主要条件是消毒剂的消毒灭菌功效和对人体安全无害。本标准针对消毒剂终产品对人体的安全性评价提出了要求。本标准可用于消毒剂生产企业设定消毒剂终产品质量安全性和实施GMP时设定消毒剂产品安全性的期望值；可用于卫生行政部门对消毒剂产品的评审、监督和管理的科学依据和法律依据；可用于消毒产品检测机构进行毒理试验的方法标准。消毒剂安全性毒理学评价程序和方法范围本标准规定了消毒剂安全性毒理学评价的程序、确定毒理试验项目的原则、对毒理试验用受试物（受检消毒剂样品）的要求、毒理试验方法和对毒理试验结果的安全性评价。本标准适用于在我国或外国生产，在我国销售和使用的消毒剂产品质量的安全性评价。消毒剂安全性毒理学评价程序评价程序要求消毒剂安全性毒理学评价程序采用分阶段系统法，逐阶段进行毒理试验，毒理试验依次分为四个阶段，如果前一阶段毒理试验结果不符合安全性要求，需增做其后阶段相应的毒理试验。消毒剂安全性评价毒理试验第一阶段试验，包括：急性经口毒性试验；急性吸入毒性试验；皮肤刺激试验：1)一次完整皮肤刺激试验；2)一次破损皮肤刺激试验；3)多次完整皮肤刺激试验。急性眼刺激试验；阴道黏膜刺激试验；皮肤变态反应试验。第二阶段试验，包括：亚急性经口毒性试验；致突变试验：1)体外哺乳动物L5178Y细胞基因突变试验（体细胞基因水平，体外试验）；2)体外哺乳动物V79细胞基因突变试验（体细胞基因水平，体外试验）；3)体外哺乳动物细胞染色体畸变试验（体细胞染色体水平，体外试验）；4)小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验（体细胞染色体水平，体内试验）；哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验（体细胞染色体水平，体内试验）；程序外DNA修复合成试验（DNA水平，体外试验）；小鼠精原细胞染色体畸变试验（性细胞染色体水平，体内试验）。第三阶段试验，包括：亚慢性毒性试验；致畸胎试验。第四阶段试验，包括：慢性毒性试验；致癌试验。消毒剂毒理试验项目确定原则原则要求确定毒理试验项目，取决于消毒剂的特点、使用范围和安全性评价前一阶段毒理试验的结果。消毒剂必做的毒理试验项目消毒剂均应进行以下试验项目：急性经口毒性试验；（1项）致突变试验。消毒剂增做的毒理试验项目根据消毒剂使用范围，除3.2必做的两项毒理试验外，分别增做以下试验：使用于室内空气的消毒剂，增做急性吸入毒性试验；使用于手和（或）皮肤的消毒剂：1)偶尔使用或间隔数日使用的消毒剂，增做一次完整皮肤刺激试验；2)手消毒剂增做多次完整皮肤刺激试验；3)接触破损皮肤（包括用于注射部位、手术切口部位消毒）的消毒剂，增做一次破损皮肤刺激试验；4)接触创面（包括用于外科换药、烧伤皮肤消毒）的消毒剂，增做一次破损皮肤刺激试验和急性眼刺激试验；使用于黏膜的消毒剂，增做急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验；使用于游泳池水的消毒剂，增做急性眼刺激试验；在消毒过程中接触手和（或）皮肤的消毒剂，增做一次完整皮肤刺激试验。新消毒剂增做的毒理试验项目在我国首次生产和（或）销售含有新的杀菌主要成分的新消毒剂，需做的毒理试验：急性经口毒性试验（包括小鼠和大鼠）；亚急性经口毒性试验；3项致突变试验（包括反映体细胞基因水平、体细胞染色体水平和性细胞染色体水平三种类型试验）；亚慢性经口毒性试验；致畸胎试验。根据消毒剂的成分，可能有致敏作用的，增做皮肤变态反应试验。毒理试验用受试物的要求受试物必须是按照消毒剂生产者既定的生产工艺和配方进行规范化生产的消毒剂，其成分和浓度必须与实际生产和销售的相同。生产者应提供受试物的物理、化学性质的资料（包括消毒剂的配方、杀菌活性成分的化学结构和含量、pH值等，但植物消毒剂可不提供化学结构）。在急性经口毒性试验、急性吸入毒性试验、亚急性毒性试验、致突变试验、亚慢性毒性试验、致畸胎试验、慢性毒性试验和致癌试验时，采用消毒剂原形样品。消毒剂原形是指在销售过程中原包装的粉剂、片剂或原液。对于二元包装的消毒剂，按产品使用说明比例混合配置后作为消毒剂原形样品。在皮肤刺激试验、急性眼刺激试验和阴道黏膜刺激试验中所用样品的浓度，必须是对皮肤、黏膜消毒时应用浓度的5倍。对使用产品原液对皮肤、黏膜进行消毒的消毒剂，则采用消毒剂原液作为试验样本。在皮肤变态反应试验时，采用的诱导浓度应为引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度或原液，激发浓度应为不引起皮肤刺激反应的最高浓度或原液。消毒剂安全性评价的毒理试验方法急性经口毒性试验目的检测消毒剂对实验动物的急性毒性作用和强度。为亚急（慢）性毒性试验和致突变试验提供剂量选择的依据。实验动物小鼠或大鼠任选一种，雌雄各半。小鼠体重18g～22g，大鼠体重180g～220g，根据不同的急性毒性试验设计方法，选用适当的动物数量，通常分为4～6个剂量组；一般小鼠每组选用8～10只动物，动物总数不少于50只。大鼠每组选用5～6只动物，动物总数不少于30只。试验分组如应用概率单位-对数图解法计算LD50，随机分为5～6个剂量组。通常最高剂量组的动物死亡率应≥90%，最低剂量组动物死亡率应≤10%。可先以较大的组距，对少量动物进行预试验，找出其粗略致死剂量范围，然后再设计正式试验的剂量分组。如应用霍恩（Horn）法，则可先通过预试验找出其粗略致死剂量范围，然后按照1.0、2.15、4.64乘以t10（t=0，1，2，3），或者按照1.0、3.16乘以t10（t=0，1，2，3）的方法设4～5个剂量组。操作程序动物的准备：试验前，禁食过夜，不限制饮水。受试物的配制：常以水或食用植物油为溶剂配制成溶液，或采用0.5%羧甲基纤维素配制成混悬液。染毒方法：用灌胃方式将受试物一次给予动物。灌胃量一般小鼠不超过0.2mL/10g体重，大鼠不超过1.0mL/100g体重。若受试物毒性很低，一次灌胃容量太大，可在24h内分成2～3次给予，其总剂量作为一日剂量计算。染毒后观察动物的中毒表现和死亡数及死亡时间，并对死亡动物和观察期满处死动物进行尸体解剖，肉眼观察，发现有异常的组织或脏器，尚需进一步作组织病理学检查。观察时间14d。根据给予受试物后14d内的各剂量组动物死亡率计算LD50（半数致死剂量）。LD50的计算方法概率单位-对数图解法根据各剂量组动物死亡率，从表1中查各组的概率单位。因死亡率为0%和100%的概率单位，与所试动物数有关，故需另在表2中查找。某组死亡率为45%的概率单位，查表1。先在表的左侧第一列上找到40，而后在表的第一行找到5，两者交叉点处的4.87，即为45%的概率单位。某组用10只实验动物，如果全部存活（死亡率为0%），查表2，其概率单位为3.04。百分率-概率单位换算表百分率%01234567890—2.672.953.123.253.363.453.523.593.66103.723.773.823.873.923.964.0014.0054.0084.12204.164.194.234.264.294.334.364.394.424.45304.484.504.534.564.594.614.644.674.694.72404.754.774.804.824.854.874.904.924.954.97505.005.0035.0055.0085.105.135.155.185.205.23605.255.285.315.335.365.395.415.445.475.50705.525.555.585.615.645.675.715.745.775.81805.845.885.925.955.996.046.086.136.186.23906.286.346.416.486.556.646.756.887.057.33注:横标目数字为死亡率的个位数，纵标目数字为死亡率的十位数。相应于反应率为0％及100％的概率单位该组动物数反应率该组动物数反应率0％100％0％100％———113.007.0023.856.15122.977.0333.626.38132.937.0743.476.53142.907.1053.366.64152.877.1363.276.73162.857.1573.206.80172.827.1883.136.87182.807.2093.096.91192.787.22103.046.96202.767.24用方格纸绘散点图，横轴表示剂量的对数值（x），纵轴为概率单位值（y），将各组数值点在图上。按各点的分布趋势，用直尺绘出一条最适合于各点的直线，使线上方的点到线的总距离与线下方的点到线的总距离相近，此线应尽量靠近概率单位为5的点及附近的点。查出求概率单位5处的剂量对数，其反对数即为LD50。按公式（1）、公式（2）和公式（3）计算LD50的95%可信限。；(1)式中：S—LD50的标准差；y1—概率单位等于4；y2—概率单位等于6；x1—概率单位等于4（y1）时相应的剂量对数值；x2—概率单位等于6（y2）时相应的剂量对数值。；(2)式中：Sm—LD50的标准误；N—概率单位y1（=4）及y2（=6）相应的死亡率间所用的动物数。log（LD50）的95%可信限=log（LD50）±1.96Sm；(3)式中：LD50—半数致死剂量；Sm—LD50的标准误。公式（3）结果，经反对数变换后，可得LD50的95%可信限。霍恩法根据各剂量组动物死亡率，从表3或表4查出其相应的LD50值和95%可信限。表3用于每组5只动物，组距剂量递增公比为，意即10=21.5，21.5=46.4……，余此类推。此剂量系列排列如下：1.0010t、2.1510t、4.6410t……，t=0，1，2，3……。表4用于每组5只动物，组距剂量递增公比为，意即10=31.6，31.6=100……，余此类推。此剂量系列排列如下：1.0010t、3.1610t、10.010t……，t=0，1，2，3……。每组5只动物、组距倍LD50值和95%可信限各剂量组动物死亡数剂量组剂量1=0.46410t剂量2=1.0010t剂量3=2.1510t剂量4=4.6410t剂量1=1.0010t剂量2=2.1510t剂量3=4.6410t剂量4=10.010t剂量1=2.1510t剂量2=4.6410t剂量3=10.010t剂量4=21.510t1组2(3)组3(2)组4组LD50可信限LD50可信限LD50可信限00352.001.372.914.302.956.269.266.3613.500451.711.262.333.692.715.017.945.8410.800551.47—3.16—6.81—01252.001.233.244.302.656.989.265.7015.0001351.711.052.783.692.275.997.944.8912.901451.470.9512.273.162.054.886.814.4110.501551.260.9261.712.712.003.695.844.307.9402251.711.012.913.692.176.287.944.6713.502351.470.8622.503.161.865.386.814.0013.502451.260.7752.052.711.694.415.843.609.50表3（续）各剂量组动物死亡数剂量组剂量1=0.46410t剂量2=1.0010t剂量3=2.1510t剂量4=4.6410t剂量1=1.0010t剂量2=2.1510t剂量3=4.6410t剂量4=10.010t剂量1=2.1510t剂量2=4.6410t剂量3=10.010t剂量4=21.510t1组2(3)组3(2)组4组LD50可信限LD50可信限LD50可信限02551.080.7411.572.331.603.995.0013.447.3003351.260.7402.142.711.594.625.843.439.9503451.030.6651.752.331.433.785.0013.088.1410351.961.223.144.222.636.769.095.6614.610451.621.072.433.482.315.247.504.9811.310551.331.051.702.872.263.656.194.877.8711251.961.063.604.222.297.759.094.941.6711351.620.8663.013.481.876.497.504.0216.711451.330.7372.412.871.595.206.193.4211.211551.100.6611.832.371.423.955.113.0078.5112251.620.8183.193.481.766.377.503.8014.812351.330.6582.702.871.425.826.193.0512.512451.100.5502.202.371.194.745.112.5510.213351.100.5232.322.371.134.995.112.4310.820351.901.003.584.0082.167.718.804.6616.620451.470.8062.673.161.745.766.813.7412.420551.140.6741.922.451.454.135.283.138.8921251.900.8394.294.081.819.238.803.8919.921351.470.6163.503.161.337.536.812.8616.221451.140.4662.772.451.005.985.282.1612.922251.470.5733.763.161.248.106.812.6617.422351.140.4063.182.450.8756.856.281.8914.800441.961.183.264.222.537.029.095.4615.100541.621.272.053.482.744.427.505.909.5301341.960.9783.924.222.118.449.094.5418.201441.620.8932.923.481.926.307.504.1413.601541.330.8852.012.871.914.336.194.119.3302241.960.9304.124.222.008.889.094.3119.102341.620.7973.283.481.727.067.503.7015.202441.330.7152.492.871.545.366.193.3211.502541.100.6861.772.371.483.805.113.198.1903341.330.6762.632.871.465.676.193.1412.2表3（续）各剂量组动物死亡数剂量组剂量1=0.46410t剂量2=1.0010t剂量3=2.1510t剂量4=4.6410t剂量1=1.0010t剂量2=2.1510t剂量3=4.6410t剂量4=10.010t剂量1=2.1510t剂量2=4.6410t剂量3=10.010t剂量4=21.510t1组2(3)组3(2)组4组LD50可信限LD50可信限LD50可信限03441.100.5992.022.371.294.365.112.789.3910441.900.9693.714.082.097.998.804.5017.210541.471.022.113.162.204.546.814.749.7811341.900.7574.754.081.6310.28.803.5122.011441.470.6543.303.161.417.106.813.0315.311541.140.5812.222.451.254.795.282.7010.312241.900.7065.094.081.5211.08.803.2823.612341.470.5643.823.161.218.246.812.6217.712441.140.4542.852.450.9976.135.282.1113.213341.140.4233.052.450.9126.575.281.9714.220441.780.6624.783.831.4310.38.253.0722.220541.210.5832.522.611.265.425.622.7111.721341.780.4556.953.830.98015.008.252.1132.321441.210.3274.482.610.7059.665.621.5220.822241.780.4107.723.830.88316.68.251.9035.822341.210.2665.522.610.57311.95.621.2325.600531.901.123.204.082.426.898.805.2214.801431.900.7774.634.081.679.978.803.6021.501531.470.8062.673.161.745.766.813.7412.402331.900.6785.304.081.4611.48.803.1524.602431.470.6163.503.161.337.536.812.8616.202531.140.6022.152.451.304.625.282.799.9603331.470.5733.763.161.248.106.812.6617.403431.140.5032.572.451.085.545.282.3311.910531.780.8563.693.831.857.968.253.9817.111431.780.4816.583.831.0414.28.252.2330.511531.210.4513.252.610.9727.015.622.0915.112331.780.3908.113.830.84017.58.251.8137.612431.210.3104.742.610.66810.25.621.4422.013331.210.2795.262.610.60211.35.621.3024.4每组5只动物、组距倍LD50值和95%可信限各剂量组动物死亡数剂量组剂量1=0.31610t剂量2=1.0010t剂量3=3.1610t剂量4=10.010t剂量1=1.0010t剂量2=3.1610t剂量3=10.010t剂量4=31.610t1组2(3)组3(2)组4组LD50可信限LD50可信限00352.821.604.958.915.00715.700452.241.413.557.084.4711.200551.78—5.62—01252.821.365.848.914.3018.501352.241.084.647.083.4214.701451.780.9273.415.622.9310.802252.241.014.977.083.1915.702351.780.8013.955.622.5312.502451.410.6822.934.472.169.2502551.120.6381.973.552.026.2403351.410.6363.144.472.019.9203451.120.5422.323.551.717.3510352.741.355.568.664.2617.610452.051.113.806.493.5112.010551.541.072.214.873.406.9811252.741.106.828.663.4821.611352.050.8065.236.492.5516.511451.540.6323.754.872.0011.911551.150.5372.483.651.707.8512252.050.7405.706.492.3418.012351.540.5344.444.871.6914.112451.150.4083.273.651.2910.313351.150.3783.533.651.2011.220352.611.016.778.253.1821.420451.780.7234.375.622.2913.820551.210.5542.653.831.758.3921252.610.7688.878.252.4328.121351.780.4846.535.621.5320.721451.210.3184.623.831.0014.622251.780.4347.285.621.3723.0022351.210.2595.673.830.81917.900442.741.275.888.664.00318.600542.051.432.946.494.539.31表4（续）各剂量组动物死亡数剂量组剂量1=0.31610t剂量2=1.0010t剂量3=3.1610t剂量4=10.010t剂量1=1.0010t剂量2=3.1610t剂量3=10.010t剂量4=31.610t1组2(3)组3(2)组4组LD50可信限LD50可信限01342.740.9687.758.663.0624.501442.050.8435.006.492.6715.801541.540.8332.854.872.639.0102242.740.8968.378.662.8326.502342.050.7115.936.492.2518.702441.540.6043.924.871.9112.402541.150.5682.353.651.807.4203341.540.5554.274.871.7613.503441.150.4632.883.651.479.1010442.610.9537.158.253.0122.610541.781.033.065.623.279.6811342.610.65810.48.252.0832.711441.780.5285.985.621.6718.911541.210.4423.323.831.4010.512242.610.59411.58.251.8836.312341.780.4237.485.621.3423.612441.210.3054.803.830.96615.213341.210.2765.333.830.87116.820442.370.53910.47.501.7033.0020541.330.4463.994.221.4112.621342.370.30718.37.500.97058.021441.330.1879.494.220.59230.022242.370.26221.47.500.83067.822341.330.13713.004.220.43341.000532.611.195.718.253.7718.101432.610.6849.958.252.1631.501531.780.7234.375.622.2913.802332.610.55812.28.251.7638.602431.780.4846.535.621.5320.702531.210.4673.143.831.489.9403331.780.4347.285.621.3723.0003431.210.3564.123.831.1313.0010532.370.7937.107.502.5122.411432.370.33316.97.501.0553.4表4（续）各剂量组动物死亡数剂量组剂量1=0.31610t剂量2=1.0010t剂量3=3.1610t剂量4=10.010t剂量1=1.0010t剂量2=3.1610t剂量3=10.010t剂量4=31.610t1组2(3)组3(2)组4组LD50可信限LD50可信限11531.330.3035.874.220.95818.612332.370.24423.17.500.77173.0012431.330.17210.34.220.54532.613331.330.14812.14.220.46738.1一次最大限度试验如20只动物（雌雄各半）一次灌胃剂量5000mg/kg体重，在14d内又无一死亡，可判定LD50≥5000mg/kg体重。其他方法也可采用其他方法如寇氏（Karber）法、固定剂量法（Fixeddosemethod）及上下法（Upanddownprocedure）等。急性经口毒性试验评价规定急性经口毒性试验评价规定见表5。经口毒性分级LD50/（mg/kg体重）毒性分级LD50≥5000实际无毒500≤LD50＜5000低毒50≤LD50＜500中等毒1≤LD50＜50高毒LD50＜1剧毒急性吸入毒性试验目的检测消毒剂对实验动物的急性吸入毒性作用和强度。实验动物小鼠或大鼠任选一种，雌雄各半。小鼠体重为18g～22g，大鼠体重为180g～220g。操作程序染毒方法急性吸入毒性试验可采用静式染毒法或动式染毒法。静式染毒法静式染毒是将实验动物放在一定体积的密闭容器（染毒柜）内，加入一定量的消毒剂，并使其挥发，造成实验需要消毒剂浓度的空气，一次吸入性染毒2h。染毒柜的容积以每只染毒小鼠不少于3L/h空气计，每只大鼠不少于30L/h计。计算染毒浓度，染毒浓度一般应采用实际测定浓度。在染毒期间一般可测4～5次，求其平均浓度。在无适当测试方法时。可用公式（4）计算染毒浓度:(4)式中：c—染毒浓度，单位为毫克每立方米（mg/m3）；a—消耗消毒剂量，单位为立方米（m3）；d—消毒剂密度，单位为毫克每立方米（mg/m3）；V—染毒柜容积，单位为立方米（m3）。动式染毒法动式染毒是采用机械通风装置，连续不断地将含有一定浓度消毒剂的空气均匀不断地送入染毒柜，并排出等量的染毒气体，维持相对稳定的染毒浓度。一次吸入性染毒2h。气体消毒剂，经流量计与空气混合成一定浓度后，直接输入染毒柜。易挥发液体消毒剂，通过空气鼓泡或适当加热促使挥发后输入染毒柜。若消毒剂现场使用采取喷雾法时，可采用喷雾器或超声雾化器使其雾化后输入染毒柜。计算染毒浓度，染毒浓度一般应采用动物呼吸带实际测定浓度，每30min一次，取其平均值。若无适当的测试方法，也可采用公式（5）计算染毒浓度：(5)式中：c—染毒浓度，单位为毫克每立方米（mg/m3）；a—气化或雾化消毒剂量，单位为立方米（m3）；d—消毒剂密度，单位为毫克每立方米（mg/m3）；V1—输入染毒柜风量，单位单位为立方米（m3）；V2—染毒柜容积，单位为立方米（m3）。LC50的计算观察、 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 染毒过程和观察期内的动物症状和死亡情况。关于染毒浓度的设计、动物分组、观察期限、观察指标和LC50（半数致死浓度）的计算等可按5.1的要求进行。在预试验的基础上，如20只动物（雌雄各半）一次2h吸入染毒浓度10000mg/m3，在14d内无一死亡，可判定LC50≥10000mg/m3。急性吸入毒性试验评价规定急性吸入毒性试验评价规定见表6。急性吸入毒性分级2hLC50/（mg/m3）毒性分级LC50≥10000实际无毒1000≤LC50＜10000低毒100≤LC50＜1000中等毒110≤LC50＜100高毒LC50＜10剧毒皮肤刺激试验目的检测消毒剂对实验动物皮肤的刺激（腐蚀）作用和强度。实验动物每次试验至少需3只皮肤完好的健康家兔或豚鼠。操作程序一次完整皮肤刺激试验试验用受试物的浓度一般为皮肤消毒应用液的5倍或使用消毒剂原液。在试验前24h，用脱毛剂或剪刀将家兔或豚鼠背部脊柱两侧的毛去掉。去毛范围，各约3cm×3cm，不得损伤皮肤。次日将受试物0.5mL（g）直接滴于面积为2.5cm×2.5cm的一侧去毛完整皮肤上，或滴于同样大小的2层～4层纱布上并敷贴在一侧去毛皮肤表面，然后用一层无刺激塑料膜或油纸覆盖，再用无刺激胶布固定。另一侧去毛皮肤作为空白对照（或溶剂对照）。敷贴时间为4h。对于用后清洗的消毒剂，敷用时间至2h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂除去残留受试物。分别于去除受试物后1h、24h和48h观察皮肤局部反应，并按表7进行刺激反应评分。皮肤刺激反应的评分标准皮肤刺激反应皮肤刺激反应评分红斑形成无0勉强可见1明显2严重3紫红色红斑，并有焦痂4表7（续）皮肤刺激反应皮肤刺激反应评分水肿形成无0勉强可见1皮肤隆起，轮廓清楚2水肿隆起约1mm3水肿隆起超过1mm4一次破损皮肤刺激试验涂受试物前，在2.5cm×2.5cm的去毛皮肤上，用75％酒精清洁、消毒暴露皮肤，待酒精挥发后，用灭菌刀片或注射针头在皮区内划一个“井”形的破损伤口，并在该破损皮区内染毒。注意皮肤破损仅达表皮，不要伤及真皮。试验用受试物的浓度、手术前的皮肤准备、手术后受试物的涂抹、局部皮肤反应的观察和评分方法按5.3.3.1的要求进行。注意鉴别感染和原发性刺激反应的区别，若有感染可疑，应进行重复测试。多次完整皮肤刺激试验试验前动物皮肤准备按5.3.3.1.2的要求。次日将受试物0.5mL（g）涂在一侧皮肤上，受试物的浓度同5.3.3.1.1，另一侧涂溶剂作为对照，在涂抹后4h，用水或无刺激的适宜溶剂清洗，除去残留物。每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果，按表7评分。为了便于受试物的涂抹和结果观察，必要时应剪毛。对照区的处理方法同试验区。评价规定一次皮肤刺激试验在各个观察时间点，按照表7对动物的皮肤红斑与水肿形成情况进行评分，并分别按时间点将3只动物的评分相加，除以动物数，获得不同时间点的皮肤刺激反应积分均值（刺激指数）。取其中最高皮肤刺激指数，按表8评定该受试物对动物皮肤刺激强度的级别。皮肤刺激强度分级皮肤刺激指数DI刺激强度级别0≤DI＜0.5无刺激性0.5≤DI＜2.0轻刺激性2.0≤DI＜6.0中等刺激性6.0≤DI≤8.0强刺激性多次皮肤刺激试验按公式（6）计算每天每只动物皮肤刺激指数（DI），并以表8判定皮肤刺激强度。(6)式中：DI－皮肤刺激指数；M－每只动物14d的红斑和水肿总积分；n－受试动物数；14－多次皮肤试验刺激天数。急性眼刺激试验目的检测消毒剂对实验动物眼睛的急性刺激和腐蚀作用。实验动物使用3只家兔。试验前检查家兔双眼，有异常者不能用于试验。操作程序试验用受试物一般为黏膜或空气消毒应用液的5倍浓度的溶液或消毒剂原液。吸取受试物0.1mL，滴入家兔一侧眼结膜囊内。另一侧眼以生理盐水作为正常对照。滴受试物后，将眼被动闭合4s，30s后用生理盐水冲洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼观察家兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤与恢复情况。如果72h内未出现刺激反应，或第7d或第14d，眼睛刺激反应完全恢复，即可提前终止试验。必要时，用2%荧光素钠溶液或裂隙灯、放大镜检查角膜及虹膜变化。评价规定按表9对家兔眼角膜、虹膜和结膜的急性刺激反应进行评分，并分别计算每只动物在3个不同观察时间（24h、48h和72h）的角膜损害、虹膜损害、结膜充血和结膜水肿四方面的“平均评分”（即每只动物的24h、48h和72h评分之和除以观察数3）。分别以动物眼角膜、虹膜和结膜充血、水肿的平均评分和恢复时间，按表10、表11眼刺激反应分级标准判定受试物对眼睛的刺激强度。家兔急性眼刺激反应的评分标准眼损害表现评分角膜损害无溃疡形成或混浊0散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1半透明区易分辨，虹膜模糊不清2出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见3角膜不混浊，虹膜无法辨认4虹膜损害正常0皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍有反应1出血、肉眼可见破坏，或瞳孔对光无反应2表9（续）眼损害表现评分结膜（睑结膜、球结膜）充血血管正常0血管充血呈鲜红色1血管充血呈深红色，血管不易分辨2弥漫性充血呈紫红色3结膜（睑结膜、球结膜）水肿无水肿0轻微水肿（包括瞬膜）1明显水肿，伴有部分眼睑外翻2水肿至眼睑近半闭合3水肿至眼睑大半闭合4眼刺激性反应分级标准损伤类型分级标准可逆性损伤无刺激性3只动物的平均评分：角膜损害＜1、虹膜损害＜1、结膜充血＜2和结膜水肿＜2或3只动物中至少有2只动物的平均评分符合上述标准，另外1只动物的刺激反应在21d内完全恢复a。轻刺激性3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥1；虹膜损害≥1；结膜充血≥2；结膜水肿≥2，且7d内全部动物的刺激反应完全恢复a。可逆性损伤刺激性b3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥1；虹膜损害≥1；结膜充血≥2；结膜水肿≥2，且21d内全部动物的刺激反应完全恢复。不可逆性损伤腐蚀性c至少有1只动物的角膜、虹膜或结膜的刺激反应在21d的观察期内未完全恢复或（和）在3只动物中有2只动物的平均评分：角膜损害≥3；虹膜损害≥1.5。完全恢复是指动物的眼刺激反应评分，角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1。刺激性是指接触受试物后所产生的可逆性炎性反应。腐蚀性是指接触受试物后所产生的不可逆性组织损伤。眼刺激性反应分级标准平均评分动物数只恢复时间ad损伤类型角膜损害＜1和虹膜损害＜1和结膜充血＜2和结膜水肿＜2≥2≤21可逆性损伤无刺激性角膜损害≥1或虹膜损害≥1或结膜充血≥2或结膜水肿≥2≥2≤7可逆性损伤轻刺激性≤21刺激性表11（续）平均评分动物数只恢复时间ad损伤类型角膜损害≥3或虹膜损害≥1.5≥2不可逆性损伤腐蚀性b角膜损害≥1或虹膜损害≥1或结膜充血≥1或结膜水肿≥1≥1>21恢复时间是指动物刺激反应评分恢复至角膜损害=0，虹膜损害=0，结膜充血=0或1，结膜水肿=0或1的时间。至少有1只动物于21d尚存在角膜粘连或血管翳，也可判为腐蚀性。阴道黏膜刺激试验目的检测消毒剂对实验动物阴道黏膜的刺激作用和强度。实验动物选用健康、初成年的雌性白色家兔，同一品系，体重2.0kg～3.0kg。试验前应检查动物阴道口有无分泌物、充血、水肿和其他损伤情况。如有炎症或（和）损伤，应弃用。选择未交配的动物进行试验。试验分组分为染毒组和对照组，每组3只。操作程序稀释使用的消毒剂采用黏膜消毒时应用液5倍浓度的溶液作为受试物。若应用液为原液的消毒剂则用原液作受试物。对照组采用生理盐水。将长度为8cm左右的钝头软管或12号硅胶导尿管与2mL的注射器连接。注射器和导管注满受试液备用。每只动物各准备一套。一次阴道黏膜刺激试验的染毒方法：将动物仰面固定，暴露出会阴和阴道口。将导管用受试液或对照液湿润后轻柔地插入阴道（4cm～5cm），并用注射器缓慢注入2mL受试液，抽出导管，完成染毒。对照组动物用生理盐水作同样处理。由于动物阴道容积的个体差异，有时受试液注入后可能有溢出，可用消毒棉或软纸拭去。末次染毒后24h，采用气栓法处死动物，剖腹取出完整的阴道，纵向切开，肉眼观察是否有充血、水肿等表现，供病理取材时参考。然后将阴道放入10%福尔马林溶液中固定24h以上，选取阴道的两端和中央（即位于耻骨联合处附近）3个部位的组织制片，HE染色后，进行组织病理学检查。评价规定组织病理学检查结果，按表12规定对阴道黏膜的刺激反应进行评分。阴道黏膜刺激反应评分标准a阴道组织反应反应评分A．上皮组织完整—正常0细胞变性或变扁平1组织变形2局部糜烂3广泛糜烂或溃疡4B．白细胞浸润（每个高倍视野）无0极少＜25个1轻度25～50个2中度51～100个3重度＞100个4C．血管充血无0极少1轻度2中度3重度伴血管破裂4D．水肿无0极少1轻度2中度3重度4a刺激反应积分=A+B+C+D。将实验组3只动物3个部位的刺激反应积分相加后，再除以观察总数（动物数×3），得出实验组阴道黏膜刺激反应的平均积分，最大记分为16（见表12）。对照组评分方法同5.5.5.1和5.5.5.2。将实验组平均积分减去对照组平均积分得出刺激指数后，按表13进行刺激强度分级。阴道黏膜刺激强度分级阴道黏膜刺激指数DI阴道黏膜刺激反应强度0≤DI＜1无1≤DI＜5极轻5≤DI＜9轻度9≤DI＜12中度DI≥12重度当对照组动物阴道黏膜刺激反应平均积分大于9时，应采用6只动物进行复试，以鉴别是否与操作损伤有关。皮肤变态反应试验目的检测消毒剂重复接触后，实验动物产生皮肤变态反应的可能性及其强度。实验动物选用皮肤完好的健康白色豚鼠，雌雄各半，体重200g～300g。试验分组将豚鼠随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组，每组动物至少16只。操作程序对实验组豚鼠，给予受试物诱导和激发处理。阳性对照组给予阳性致敏物（如：2，4-二硝基氯苯）诱导和激发处理。阴性对照组仅给以受试物激发处理。诱导处理浓度允许引起皮肤轻度刺激反应。激发浓度可低于诱导浓度，并不得引起原发性刺激反应。如果原液不引起皮肤刺激反应，诱导和激发均使用原液。试验前24h将豚鼠背部左侧3cm×3cm范围内去毛。取诱导浓度的消毒剂溶液（或原液）0.5mL（g），直接涂在2cm×2cm左侧去毛皮肤上或滴于同样大小的2～4层纱布上，再将其敷贴在左侧去毛区。用一层无刺激塑料膜或油纸复盖，再以无刺激胶布固定，持续6h。第7d和第14d以同样方法重复一次。在末次诱导后14d，将激发浓度的消毒剂溶液0.5mL（g）直接涂在2cm×2cm右侧脱毛皮肤上或滴于同样大小的2～4层纱布上，敷贴于豚鼠背部右侧3cm×3cm去毛区。然后，用一层塑料膜或油纸和无刺激胶布固定，6h后将敷贴的受试物洗去。24h和48h后观察皮肤反应，按表14对皮肤反应进行评分。皮肤反应的评分标准皮肤反应评分红斑形成无红斑0轻微红斑1中度红斑2严重红斑3水肿性红斑4水肿形成无水肿0轻度水肿1中度水肿2严重水肿3实验室开展皮肤变态反应试验初期，或使用新的动物种属或品系时，需同时设阳性对照组，阳性对照物可使用2，4-二硝基氯代苯。为保证试验方法的可靠性，在进行该类试验时，每隔半年应使用阳性对照物检查一次。若检测报告中需用非本次阳性对照组的实验数据时，应注明其实验日期。阳性对照组的操作程序同实验组，以阳性致敏物替代受试物。阴性对照组，仅对动物给予受试物的激发处理，每次试验必须设置。评价规定化学物质引起的过敏性接触性皮炎，属迟发型变态反应。对于动物，仅见皮肤红斑和水肿。根据表14标准，将出现皮肤反应（评分≥1）的动物数除以该组实验动物数，求得致敏率（%），按表15评定致敏强度。致敏强度分级标准a致敏率/%致敏强度0～8极轻度9～28轻度29～64中度65～80强度81～100极强度致敏率为0%时，可判为未见皮肤变态反应。亚急性经口毒性试验目的检测消毒剂多次接触对实验动物的蓄积毒性作用及其靶器官，并确定其最大未观察到有害作用剂量和最小观察到有害作用剂量。为亚慢性、慢性毒性或致癌试验的剂量设计提供依据。实验动物一般用啮齿类动物，首选大鼠，所用大鼠应为6～8周龄，每组至少10只，雌雄各半。试验分组将实验动物随机分为4组（3个剂量组和1个对照组）。选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，但不引起死亡，如果出现动物死亡应不超过10%；中间剂量组应可观察到轻微的毒性效应；低剂量组应不引起任何毒性效应（属未观察到有害作用剂量）。至于具体的剂量设计，可考虑高剂量为LD50的1/5～1/10，高、中、低3个剂量间的组距以3～5倍为宜，最低不小于2倍。对于LD50≥5000mg/kg体重的消毒剂，高剂量应用1000mg/kg体重。另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性（溶剂）对照组。操作程序采用灌胃方式经口染毒。灌胃法每天灌胃一次，每周称体重，并按体重调整受试物的给予量。试验期为28d，末次染毒后24h处死实验动物，检测各项观察指标。观察指标临床检查观察动物中毒表现，每周称量体重一次。血液学检查包括血红蛋白含量、红细胞计数、白细胞计数及其分类计数等。血液生化检查例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇等。必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其他一些生化指标。脏器重量测量肝、肾等重要脏器的重量，并计算其脏器重量系数。病理学检查实验结束时，处死所有动物，进行全面的肉眼尸检，并将尸检发现的异常组织和主要脏器和组织（如心、肺、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢和胃肠等）固定保存。当各剂量组动物尸检未发现明显病变，先进行高剂量组和阴性对照组动物的肝、肾、胃肠和其他可能受损的脏器的组织病理学检查。如大体解剖发现异常或高剂量组动物组织病理学检查发现病变，还应对中、低剂量组动物相应的器官进行组织病理学检查。评价规定将各实验组动物观察指标与阴性对照组加以比较，并进行统计学检验，注意各剂量组间的剂量-反应（效应）关系。评定受试物的最小观察到有害作用剂量和最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。致突变试验L5178Y细胞基因突变试验目的检测消毒剂对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，以作为评价消毒剂致突变性的依据。试剂F10P培养液为完全培养液。以Fischer或RPMI1640培养液，加入马血清10%，丙酮酸钠220μg/mL，青霉素100IU/mL和链霉素100μg/mL配制而成（pH7.2～7.4）。于4℃冰箱中保存备用。F0P培养液为无血清培养液。以Fischer或RPMI1640培养液，加入丙酮酸钠220μg/mL，青霉素100IU/mL和链霉素100μg/mL等配制而成（pH7.2～7.4）。于4℃冰箱中保存备用。马血清将过滤除菌后的马血清，经56℃作用30min灭活补体。分装后，于-20℃保存备用。集落用培养基用Fischer或RPMI1640培养液，加入马血清20%、丙酮酸钠220μg/mL、琼脂0.37%配制而成。无钙镁磷酸盐缓冲液（无钙镁PBS，pH7.2～7.4）磷酸二氢钾（KH2PO4）0.20g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.89g氯化钾（KCl）0.20g氯化钠（NaCl）8.00g双蒸水（压力蒸汽灭菌）1000mL受试物最好能直接溶于F10P与F0P培养液中。否则需先溶于二甲基亚砜（DMSO），而后再加于上述培养液内。所加DMSO的量应低于1%（体积分数）。阳性对照物选用甲基磺酸乙酯（EMS），丝裂霉素C（MMC），甲基硝基亚硝基胍（MNNG），苯并（a）芘（BaP）等。三氟胸苷（TFT）用生理盐水配成100μg/mL溶液，可冻存3个月。肝微粒体酶混合液（S9混合液）取健康的雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g左右，约5～6周龄。将多氯联苯（Aroclor1254），溶于玉米油中，浓度200mg/mL，按500mg/kg体重一次腹腔注射。5d后，断头处死动物，取出肝脏称重后，用预冷的0.15mol/L氯化钾溶液冲洗肝脏数次。每克肝（湿重）加0.15mol/L氯化钾溶液3mL。剪碎肝脏，在冰浴中用玻璃匀浆器制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。将肝匀浆用低温（0℃～4℃）高速离心机，以9000g离心10min。取上清液即为S9，分装于无菌冷冻安瓿中。S9制成后，需进行无菌检查，以及用间接致癌物鉴定其活性。合格者置-80℃或液氮中储存备用，储存期不超过半年。S9混合液应以上述S9液在临用时按无菌要求配制。一般配成含10%S9的混合液。其配方如下：S90.10mL1.65mo1/L氯化钾+0.4mol/L氯化镁0.04mL葡萄糖-6-磷酸.2Na1.8mg氧化型辅酶II（NADP）3.1mg用F0P培养液补足至1.0mL。细胞试验以小鼠淋巴瘤L5178Y细胞[胸苷激酶（TK）座位为杂合子（tk+/tk-）]检测TK基因的突变。为减少细胞的自发突变率，在制备该细胞试验用悬液时，先将其在加有THMG的F10P培养液中培养24h，杀灭培养液中所存在的自发突变细胞（tk-/tk-），然后将细胞悬浮于THG培养液（不含氨甲喋呤的THMG培养液）中培养1d～3d。[THMG含下列4种成分，各成分的终末浓度如下：胸苷5×10-6mol/L次黄嘌呤5×10-5mol/L氨甲喋呤4×10-7mol/L甘氨酸1×10-4mol/L]试验分组一般设4个剂量组。有细胞毒性的受试物，最高剂量组的细胞存活率为10%～20%，无细胞毒性受试物最高剂量不超过10mmol/L或5mg/mL。同时应有阴性（溶剂）对照组、阳性对照组和未处理对照组。阳性与阴性对照组的操作程序同实验组，阳性对照组用阳性对照物代替受试物，阴性（溶剂）对照组用受试物溶剂代替受试物。除未处理对照组外，实验组和其他对照组，还均应包括有加S9混合液和不加S9混合液的两部分。操作程序细胞准备将新清除了自发突变体的细胞群体，用F10P培养液制成悬液。以无菌烧瓶加入细胞悬液和F10P培养液至100mL，细胞终末密度为7×103个/mL～8×103个/mL。培养物以含5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于36℃±1℃进行培养。L5178Y细胞的细胞增殖周期约为10h～11h，在常规培养24h后，细胞数将增加约5倍。用稀释法维持生长，每天将细胞培养物用F10P培养液作4倍稀释（或隔天用F10P培养液作24倍稀释），继续培养。实验前一天用F10P培养液和F0P培养液各50%的对半混合液（马血清终末浓度为5%）稀释。受试物处理用上述F10P和F0P的对半混合液将细胞培养物稀释至1×106个/mL，并分种于50mL有盖试管中，每管6mL，再加S9混合液4mL（总量共10mL）。不加S9混合液管，代之以F0P培养液。在上述试管内加入一定浓度的受试物，并以含5%二氧化碳的空气充气后加盖密闭，于36℃±1℃培养4h。处理结束后，以200g离心10min，除去含受试物的上清液，收集细胞。细胞用Hanks液洗涤，再加入20mLF10P培养液充分混悬（细胞浓度为0.3×l06个/mL），以含5%二氧化碳的空气充气后，加盖密闭，于36℃±1℃振荡培养，开始表达。表达细胞的表现型表达时间为2d。表达开始后24h和48h经计数后将细胞稀释至3×105个/mL。选择和集落化表达结束后，取10mL培养物经离心后除去大部分上清液。并将细胞在留下的约1mLF10P培养基中混悬。将细胞悬液移入含100mL集落培养基的烧瓶中。此时细胞密度为3×l04个/mL。在36℃±1℃振荡培养30min。取出0.5mL后，向余下的细胞悬液中加入1.0mLTFT贮存液，继续振荡培养15min。将样本取出，倒于3个直径10cm平皿中，每平皿33mL，含1×l06个细胞（称为TFT平板），作突变体的选择。将先前取出的0.5mL细胞悬液用集落培养基先作1:100稀释，细胞悬液浓度为3×l02个/mL。振荡培养15min后，取出2.0mL再用集落培养基作1:50稀释（此时细胞悬液浓度为6个/mL）后振荡培养。经15min培养后，倒入3个直径为100mm的平皿中，每平皿33mL，含细胞200个（称为VC平板）。待琼脂凝固后，置二氧化碳培养箱（36℃±1℃）中静置培养10