几株硅酸盐细菌菌株的分离及解钾、解硅活性

几株硅酸盐细菌菌株的分离及解钾、解硅活性摘要：从水稻田和玉米田土样中分别分离适用于水田作物和旱田作物的硅酸盐细菌，对能够在亚历山大罗夫培养基上生长且符合硅酸盐细菌菌落特征的细菌菌株进行菌种鉴定，然后测定在不同供氧条件下菌株的解硅、解钾能力。结果表明，从水稻田土样中分离得到菌株2株，从玉米田土样中分离得到菌株1株，经鉴定均属于硅酸盐细菌的一种——胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillusmucilaginosus）。在不同供氧条件下，这3株菌株均具有一定的解硅、解钾活性，供氧充足的条件下菌株h-5的解硅活性最高，可以使发酵液中水溶性硅含量达到4.5μg/mL以上，菌株s-4解钾活性最高，可以使水溶性钾含量达到46.73mg/L以上。分离自水田的2株菌株在微氧条件下仍能保持较高的解硅、解钾活性，具有作为生物肥料的出发菌株应用于水田作物的较大潜力。　　关键词：硅酸盐细菌；分离；鉴定；解硅活性；解钾活性　　IsolationofSeveralSilicateBacteriaStrainsandDeterminationofTheirActivityofReleasingSiliconandPotassium　　LIJia，ZHANGAi-min，WANGWei，ZHUBao-cheng　　（CollegeofLifeScience，HebeiAgriculturalUniversity，Baoding071001，Hebei，China）　　Abstract：FromthesoilsamplesofpaddyfieldinHunanareaandcornfieldinHebeiarea，severalsilicatebacteriastrainswereisolatedThenthestrainswereidentifiedbymorphologicalandculturefeaturesobservation.Theactivityofreleasingsiliconandpotassiumofthesestrainsondifferentlevelsofoxygendissolutionweredetermined.Theresultsshowedthattwostrainsandonestrainwereobtainedfrompaddysoilandcornfieldsoil，respectively.ThesethreestrainswereallidentifiedasPaenibacillusmucilaginosus，akindofsilicatebacteria.Thesethreestrainshadacertainlevelofactivityofreleasingsiliconandpotassium.Amongthem，strainh-5hadthehighestactivityofreleasingsilicon，thecontentofwatersolublesiliconinitsfermentationbrothcouldreachover4.5μg/mL.Strains-4hadthehighestactivityofreleasingpotassium，thecontentofwatersolublepotassiuminitsbrothwereover46.73mg/L.Theactivityofreleasingsiliconandpotassiumoftwostrainsobtainedfrompaddysoilwerestablerondifferentlevelsofoxygendissolutionthanthatofotherstrain.Ontheconditionoflowoxygendissolution，thetwostrainsobtainedfrompaddysoilcouldstillkeeparelativelyhighactivityofreleasingsiliconandpotassium.　　Keywords：silicatebacteria；isolation；identification；activityofreleasingsilicon；activityofreleasingpotassium　　硅酸盐细菌（Siliconbacteria）是指能分解硅酸盐类矿物的细菌[1]。一般认为，硅酸盐细菌最早是1950年由前苏联学者亚历山大罗夫从黑钙土和灰钙土中分离出来的。目前普遍认为硅酸盐细菌主要有环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans）、胶质芽孢杆菌（Bacillusmucilaginosus）和土壤芽孢杆菌（Bacillusedaphicus）3种，近年有学者报道将胶质芽孢杆菌和土壤芽孢杆菌分别重命名为胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillusmucilaginosus）和土壤类芽孢杆菌（Paenibacillusedaphicus），归入类芽孢杆菌属（Paenibacillus），同时也有学者报道分离出假单胞菌和多粘类芽胞杆菌等硅酸盐细菌，它们均具有较好的解硅、解钾能力[2]。有报道表明，硅酸盐细菌具有分解土壤中的含钾矿物质释放钾元素的能力，也能活化硅、磷等多种营养元素供作物吸收利用，增加作物产量，亦有报道称其具有固氮功能。因此，硅酸盐细菌作为土壤中的一类重要的功能菌，将其开发作为生物肥料的有效成分来转化利用土壤中的硅元素和钾元素等资源，对发展生态、经济农业具有十分重要的意义[3-6]。目前生物肥料在应用中存在一些问题，如生物肥料在使用中肥效的发挥受到许多因素制约，生物肥料菌株在不同作物及土壤环境中植株根系区域的定植、生长、繁殖状态以及与土壤周围环境的相互作用都不尽相同，然而目前报道使用的菌株并没有考虑到这一点。为此，对从湖南地区水稻田土壤和河北地区玉米田土壤中分离得到的3株符合硅酸盐细菌菌落特征的菌株进行了菌种鉴定，并对其在不同供氧条件下的解硅、解钾能力进行初步研究，为其作为生物肥料出发菌株分别用于水田作物和旱田作物提供一定的理论依据。　　1材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 　　1.1试验材料　　1.1.1试验样品供试土样：湖南省涟源地区水稻田土壤；河北省保定地区玉米田土壤。对照菌株：胶冻样类芽孢杆菌菌株AC10012，河北众邦生物技术有限公司、河北巨微生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司提供。　　1.1.2培养基硅酸盐细菌发酵培养基：蔗糖12.0g，CaSO4·7H2O2.0g，CaCO35.0g，淀粉10.0g，硫酸铵3.5g，K2HPO43.0g，酵母粉0.8g，pH7.0，去离子水1000mL。亚历山大罗夫培养基参考《微生物实验指导》[7]的方法配制。生理生化鉴定培养基参考《常见细菌系统鉴定 手册 华为质量管理手册 下载焊接手册下载团建手册下载团建手册下载ld手册下载 》[8]的方法配制。　　1.1.3主要试剂菌种鉴定试剂参见《常见细菌系统鉴定手册》[8]。耗氧剂：密闭培养室每升容积需亚硫酸钠5.0g、碳酸氢钠5.0g、还原性铁粉1.0g、水2.2mL。　　1.2试验方法　　1.2.1土样采集用接种铲取田块中10～15cm深处土样，装于牛皮纸袋中，风干后保存。并记录采样时间、地点等信息。　　1.2.2水稻田土样中菌株的分离纯化取供试土样1.0g，加入到含9.0mL无菌水的试管中，充分振荡摇匀，静置后取上清液1.0mL再加入到另一含9.0mL无菌水的试管中，按10-3～10-8梯度稀释，分别从各级土壤稀释液中各取1.0mL涂布亚历山大罗夫培养基平板，将平板置于放有足量耗氧剂的直径150mm的大平皿中，于28℃恒温培养。5d后分别挑选符合硅酸盐细菌菌落形态的菌株，将选中的菌落轻轻挑起一点穿刺接种到亚历山大罗夫培养基上继续培养，培养5d后置于4℃冰箱保存。同时，将所选菌株转接到亚历山大罗夫培养基上划线验纯。　　1.2.3玉米田土样中菌株的分离纯化按“1.2.2”的方法得到各级土壤稀释液，将其各取0.1mL涂布亚历山大罗夫培养基平板，之后将平板置于28℃恒温箱中培养。培养5d后挑选符合硅酸盐细菌菌落形态的菌株，将选中的菌落轻轻挑起一点转接到亚历山大罗夫培养基上，置于28℃恒温箱中培养5d后再置于4℃冰箱保存。同时，将所选菌株在亚历山大罗夫培养基上划线验纯。　　1.2.4菌落形态观察从活化后的菌株斜面上轻轻刮取少量供试菌株的菌体细胞加到10mL无菌水中混匀，梯度稀释分别得到10-2、10-3、10-4、10-5等各级稀释液。分别取10-4、10-5这两个稀释梯度的稀释液0.2mL涂布亚历山大罗夫培养基平板，然后倒置于培养箱中培养3～5d。待单菌落长出后进行观察。从水稻田土壤中分离得到的菌株置于放有足量耗氧剂的环境中培养。　　1.2.5菌体特征观察挑取在亚历山大罗夫培养基上活化后的菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察其菌体形态，具体染色方法参见《常见细菌系统鉴定手册》[8]。　　1.2.6菌株的生理生化测定根据《常见细菌系统鉴定手册》[8]中有关属、种鉴定的内容和方法，进行了菌株需氧性测定、二乙酰（VP）试验、酪素水解试验、硝酸盐还原试验、卵磷脂酶试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、甲基红试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、淀粉水解试验、过氧化氢酶试验、葡萄糖发酵试验、甘露醇发酵试验、脲酶试验、明胶液化试验等。　　1.2.7基因组DNA的提取及16SrDNA的扩增纯化采用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB法）[9]提取菌株的基因组DNA。以琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。以菌株的基因组DNA为模板测序。　　1.2.816SrDNA序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 及系统发育树的构建利用生物序列的相似性搜索（BLAST）方式将测定的供试菌株的16SrDNA序列与基因库（GenBank）中所有已测定的原核生物的16SrDNA序列进行比较。根据生物序列的相似性搜索（BLAST）比较的结果，从基因库（GenBank）中获得相应菌株16SrDNA序列，构建系统发育树。序列比对利用多重序列比对（CLUSTALX）程序进行，进化距离的计算利用菲利普（Phylip）软件包中的距离计算（DANDIST）程序进行，进化树的构建利用菲利普（Phylip）软件包中的临近距离比对（Neighbor-joing）程序进行，分支模式的重复性利用菲利普（Phylip）软件包中的序列助手（Seqboot）和序列检测（Consense）程序分析，生成的树利用树视图（Treeview）程序重建[10]。　　1.2.9在不同溶氧发酵条件下菌株解钾活性的测定在无钾发酵培养液中加入终浓度为1.0g/mL的钾铝酸盐，接种供试菌株，分别在不同供氧条件下进行发酵，每项3个平行，培养48h，得到发酵液。　　发酵过程分三组：第一组以透气膜封口，摇瓶发酵（180r/min）；第二组以透气膜封口，静置发酵；第三组以不透气的塑料膜封口，加耗氧剂静置发酵。　　取适量发酵液过滤除去菌体和残渣，稀释5倍，利用原子吸收分光光度法测定稀释液中水溶性钾含量，在30min内比浊完毕，同时做空白对照试验[11]。　　以河北众邦生物技术有限公司、河北巨微生物工程有限公司生产的硅酸盐细菌菌株AC10012作为对照菌株同时进行发酵及解钾活性测定。1.2.10在不同溶氧发酵条件下菌株解硅活性的测定将供试菌株接种到含1.0g/L石英砂的发酵培养液中，分别在不同供氧条件下进行发酵，每项3个平行，培养48h，得到发酵液。　　发酵过程分三组：第一组以透气膜封口，摇瓶发酵（180r/min）；第二组以透气膜封口，静置发酵；第三组以不透气的塑料膜封口，加耗氧剂静置发酵。　　精确吸取过滤的发酵液适量于小烧杯中，以硅钼蓝分光光度法[12，13]测定发酵液中水溶性硅的含量。　　以硅酸盐细菌菌株AC10012作为对照菌株同时进行发酵及解硅活性测定。　　2结果与分析　　2.1分离到的硅酸盐细菌菌株　　分别从湖南水稻田土样和河北玉米田土样分离纯化符合硅酸盐细菌菌落形态特征的细菌菌株，从水稻田土样得到菌株2株，分别编号为s-2和s-4，从玉米田土样得到菌株1株，编号为h-5。　　2.2菌落形态　　供试菌株菌落均为圆形凸起、边缘完整、表面湿润光滑、无色透明，玻璃珠状，菌落黏稠，富有弹性，挑起时能拉成很长的丝。符合典型的硅酸盐细菌的单菌落特征，菌落形态见图1。　　2.3菌体特征　　供试菌株经革兰氏染色在显微镜下观察均呈阳性，菌体呈长杆状，两端钝圆，周围有很肥厚的荚膜（图2）。　　2.4菌株的生理生化特性　　菌株的生理生化试验结果见表1。硅酸盐细菌大多数为化能异养细菌，能利用蔗糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇等多种碳源；最适生长温度为25～28℃，最适生长pH7.0～8.5。　　通过对供试菌株的菌落形态、菌体特征的观察以及生理生化特征测定，根据《常见细菌系统鉴定手册》[8]中有关种、属鉴定的内容和方法，初步鉴定这3株供试菌株均属于类芽孢杆菌属。　　2.5基因组DNA的提取纯化及16SrDNA序列的扩增测序结果　　将已测供试菌株的16SrDNA序列与基因库（GenBank）中所有已测定的原核生物的16SrDNA序列进行比较，利用菲利普（Phylip）软件包处理所得数据，得到了供试菌株及相关菌株的进化距离并构建了系统发育树。供试菌株的16SrDNA序列已提交入基因库（GenBank），得到国际基因库序列号，s-2为HM849728，s-4为HM849729，h-5为HM849727。构建的系统发育树见图3。构建系统发育树所用相关菌株的16SrDNA序列登录号及菌株s-2、s-4、h-5与参比菌株的16SrDNA序列相似性列于表2。　　根据系统发育分析结果，结合其形态特征及生理生化特性，初步鉴定以上3株供试菌株均为胶质芽孢杆菌，即近年报道的胶冻样类芽孢杆菌，属于硅酸盐细菌的一种。　　2.6在不同溶氧发酵条件下菌株的解钾活性　　以吸光度为纵坐标，钾 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程■=0.1209x-0.1451，r=0.9896。　　在不同溶氧发酵条件下进行发酵，测定对照菌株AC10012及其他各供试菌株的解钾活性，每项3个平行，取平均值。根据待测液吸光度的平均值，即可从回归方程中算得相应的钾元素含量，结果见图4。从图4可以看出，相对于对照菌株AC10012来说，分离得到的硅酸盐细菌菌株均具有较高的解钾活性，其中第一组试验活性较高的是菌株h-5和菌株s-4，在摇瓶发酵条件下，可以使发酵液中水溶性钾含量分别达到43.65mg/L和46.73mg/L，明显高于对照菌株的解钾活性，具有开发作为生物钾肥有效成分增加作物产量的潜力。另外，在供氧充足的条件下，分离得到的3株供试菌株均表现出较高的解钾活性，当发酵体系中溶氧下降，溶氧浓度相对较低时，对照菌株AC10012及分离自玉米田土壤的菌株解钾能力均受到较大影响，菌株的解钾活性下降了约50%，而从水稻田土壤中分离得到的硅酸盐细菌菌株s-2和s-4的解钾活性相对于对照菌株AC10012和从玉米田土壤中分离得到的菌株h-5来说，受到的影响较小，仍保持较高的解钾活性，甚至高于对照菌株AC10012在供氧充足条件下所表现出的解钾活性。可见，由水田土壤分离得到的硅酸盐细菌菌株在水田等溶氧浓度相对较低的环境下，仍具有较高的溶解环境中不溶性钾元素的能力，使钾元素更易被作物吸收利用，因而具有被开发作为生物钾肥有效成分施用于水田作物的较大潜力。而分离自玉米田土壤的h-5在供氧条件较好的环境中，其解钾活性则相对高于目前市场上常用于生产生物钾肥的生产菌株，因而具有被开发用作旱田作物生物肥料有效成分的潜力。　　2.7在不同溶氧发酵条件下菌株的解硅活性　　以吸光度为纵坐标，硅标准溶液浓度为横坐标，进行标准曲线的绘制，得到其回归方程为■=0.8599x+0.0068，r=0.9998。　　在不同溶氧发酵条件下进行发酵，测定对照菌株AC10012及其他各供试菌株的解硅活性，每项3个平行，取平均值。根据样品液吸光度的平均值，代入回归方程即可得出样品液中的硅含量，结果见图5。根据结果，分离得到的硅酸盐细菌菌株的解硅活性均明显高于对照菌株AC10012，其中活性最高的菌株h-5在摇瓶发酵条件下，其解硅活性比对照菌株高出很多，而且也明显高于其他分离得到的供试菌株的解硅活性，具有作为生物肥料的有效成分同时为作物提供易于吸收利用的钾和硅等营养元素增加作物产量的潜力。另外，供氧条件不同，不同供试菌株也表现出不同程度的解硅能力，其中对照菌株AC10012所受影响最大，第三组试验中，其解硅活性还不足第一组试验时的1/6，分离自玉米田土壤的菌株h-5的解硅能力也受到了较大影响，下降50%以上；在供氧充足的条件下，菌株h-5的解硅能力虽高于菌株s-2和s-4，但在溶氧浓度降低的条件下，菌株s-2和s-4的解硅活性则几乎未受影响（仅下降了5%左右），高于相同条件下菌株h-5的解硅能力。可见，对于溶氧浓度较低的水田环境来说，由水田土壤分离得到的硅酸盐细菌菌株s-2和s-4仍能保持较高的解硅活性，为作物提供易于吸收利用的硅等营养元素，具有作为生物肥有效成分应用从而增加作物产量的潜力。3讨论　　现代农业中，种植农作物时常常需大量施用化肥补充土壤中的钾等营养元素来提高农作物的产量[14]。大量施用化肥造成了诸如土壤结构破坏、有机质含量下降、农产品产量、质量下降、地下水污染严重、江河湖泊的富营养化等一系列严重的生态环境问题[15]。而土壤本身作为一个天然钾库，其每公顷土壤耕作层中含钾量约为26100kg，但是90%～98%以上的钾存在于正长石和云母等矿物中，很稳定，不能直接被植物吸收利用，这就形成了土壤既富含钾又缺钾的现象[16，17]。在化学钾肥污染严重的今天，开辟新的效果好、成本低、又不污染环境的硅酸盐细菌来挖掘土壤中的钾素资源，对发展生态、经济农业具有十分重要的意义。　　硅酸盐细菌又称为钾细菌，是指能分解硅酸盐类矿物的细菌。硅酸盐细菌菌剂作为一种微生物肥料，其功能的有效发挥必须满足两个基本条件：一是菌株的高效性，二是菌株本身对土壤环境的适应性[18，19]。研究以农田土壤为样品，从中分离具有分解硅酸盐类矿物能力的硅酸盐细菌菌株，对农田土壤环境的适应潜力通常较强，作为生物肥料的有效成分用于农作物栽培的可行性较大。并且经测定，分离得到的硅酸盐细菌菌株h-5在供氧充足的条件下具有较强的解硅、解钾能力，作为高效菌株用于生产生物肥料的潜力较大。另外，目前所报道的用于生物肥料的硅酸盐细菌通常是单一利用其解钾或解硅等能力，为作物提供相应肥料，而利用一株硅酸盐细菌的解钾和解硅等多种能力为作物提供复合肥料的报道则较少，而分离筛选得到的菌株h-5在供氧充足条件下的解硅、解钾能力均较强，应具有作为生物肥料出发菌株同时为作物提供钾和硅等复合肥料的能力，具有进一步研究的价值。　　另外，水田和旱田的自然环境是有一定差异的，其中最主要的差异是水田和旱田的溶氧条件不同，一般情况下，水田环境的氧含量明显低于旱田。然而目前关于硅酸盐细菌研究的报道中，还未见有关硅酸盐细菌作为生物肥料的有效成分应用时对水田和旱田不同环境中氧含量需求情况的报道。本试验选取了水田和旱田土壤并以不同的供氧条件分别分离硅酸盐细菌，并且对筛选所得到的硅酸盐细菌菌株在不同溶氧环境下的解硅、解钾能力进行了初步研究，分别得到了在充足供氧和微氧环境下解硅、解钾活性较高的菌株h-5和s-2、s-4，其中菌株h-5具有作为生物肥料有效成分用于旱田作物从而增加作物产量的潜力，而菌株s-2、s-4则有可能作为生物肥料有效成分用于水田作物，为作物提供易于吸收利用的钾、硅等营养元素，以增加作物产量。而菌株h-5和s-2、s-4进入实际生产应用所需的条件及实际应用的可行性则有待进一步研究。　　参考文献：　　[1]孙德四，张强.硅酸盐细菌的选育及其脱硅效果研究[J].西安科技大学学报，2006，26（2）：235-239.　　[2]何琳燕，殷永娴，黄为一.一株硅酸盐细菌的鉴定及其系统发育学分析[J].微生物学报，2003，43（2）：162-168.　　[3]唐亮，张进忠，于萍萍，等.硅酸盐细菌的分离、纯化、鉴定及生物学特性研究[J].山东农业科学，2008（1）：71-73.　　[4]徐大勇，李峰，贺雪丽.硅酸盐细菌的分离及其解钾活性的初步比较[J].淮北煤炭师范学院学报（自然科学版），2007，27（4）：42-44.　　[5]DAIQW，DOMGFQ，DENGJJ.EffectofmineraldustsonthegrowthofsilicatebacteriaS35[J].ActaGeologicaSinica，2008，82（5）：1045-1049.　　[6]LIANB，PRITHIVIRAJB，SOULEIMANOVA，etal.EvidencefortheproductionofchemicalcompoundsanalogoustonodfactorbythesilicatebacteriumBacilluscirculansGY92[J].MicrobiolRes，2001，156：289-292.　　[7]陈金春，陈国强.微生物学实验指导[M].北京：清华大学出版社，2005.　　[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.　　[9]王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术[M].北京：科学出版社，1998.　　[10]THOMPSOMJD，GIBSONTJ，PLEWNIAKF，etal.TheCLUSTAL_Xwindowsinterface：Flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentaidedbyqualityanalysistools[J].NucleicAcidsResearch，1997，25：4876-4882.　　[11]盛下放，黄为一.硅酸盐细菌NBT菌株释钾条件的研究[J].中国农业科学，2002，35（6）：673-677.　　[12]孙德四，陈福山，张强.硅酸盐细菌特性及对硅铝的活化与吸持研究[J].苏州科技学院学报，2005，18（4）：28-31.　　[13]吴丽.煮糖罐积垢主要成分测定的研究[D].南宁：广西大学，2007.　　[14]王平宇，张树华.硅酸盐细菌的分离及生理生化特性的鉴定[J].南昌航空工业学院学报，2001，15（2）：78-82.　　[15]马光庭.生态有机肥与农业可持续发展[J].中国生态农业学报，2004，12（3）：191-193.　　[16]钟冬梅，马光庭.硅酸盐细菌在农业中应用的研究动态[J].广西农学报，2008，23（3）：32-35.　　[17]LINQM，RAOZH，SUNYX，etal.Identificationandpracticalapplicationofsilicate-dissolvingbacteria[J].AgriculturalSciencesinChina，2002，1（1）：81-85.　　[18]LIANB，SMITHDL，FUPQ.Applicationandmechanismofsilicatebacteriainagricultureandindustry[J].GuizhouScience，2000，18（1-2）：43-53.　　[19]何琳燕，盛下放，陆光祥，等.不同土壤中硅酸盐细菌生理生化特征及其解钾活性的研究[J].土壤，2004，36（4）：434-437.