精液的稀释保存

第一章：精液的稀释、保存、运输主要内容明确优质精液采精前的准备精液的检测精液的稀释精液的分装精液的保存精液的运输什么样的精液是优质精液？ 最低成本生产出能配上种并产仔数高的精液称为优质精液指标每瓶精液量：80ml每瓶精液精子数：30亿精子的活力：>70%精子畸形率：<15%为什么？？？一、输精剂量对产仔数的影响 输精剂量在80CC，30亿。二、每瓶精液的密度对繁殖性能的影响 数据来源与PIC猪场，母猪为康贝尔母猪，公猪为PIC402公猪，胎次选取2-5胎的猪为实验，差异不显著。 数据来源丹麦国家人工授精中心 每瓶精液的有效精子数 受胎率 总产仔数 活产仔数 20亿 86.4% 11.7 10.6 40亿 86.3% 11.5 10.4 每瓶精液的有效精子数 受胎率 活产仔数 20亿 91.6% 12 40亿 92.0% 11.7三、精液活力对产仔数的影响差异不显著为什么？精液的稀释、保存与运输为什么要稀释？稀释的目的——保存精子较长的活力稀释的关键因素了解精子生命特性：稀释的关键因素温度：精子对温度相当敏感时间：过快，过慢都会导致死精过度PH值：酸碱度渗透压：水中矿物质杂质：细菌、微生物等了解化验室操作 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 处理卫生检查 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 采精前准备选择采精公猪运输保存清洗仪器稀释液制备分装进入化验室安全检查出生产区合格稀释不合格废弃繁殖场接收检查不合格废弃反馈至公猪站合格输精消毒与烘干备用了解采精前化验室的准备流程图选采精公猪环境温度调控稀释杯准备采精杯准备稀释液制备蒸馏水制备温度计准备密度片校正载、盖玻片升温37-38度精液瓶升温37-38度水是第一位：蒸馏水的制备——PH、渗透压和细菌 提前1天制备：——蒸馏的速度比较慢，1天大约蒸馏20L——不能放置超过3天，与CO2反应生成H2CO3，PH值变小，呈酸性，导致微生物增加。 什么是三级蒸馏？水经过一次蒸馏，不挥发的组分残留在容器中被除去，挥发的组分进入蒸馏水的初始馏分中。一级蒸馏水一级水位器三级蒸馏水二级蒸馏水冷却水三级蒸馏水成品为什么水要经过蒸馏？ 天然水，纯净水，矿泉水都不符合要求——杂质：细菌，微生物等——矿物质：重金属 必须经过3次蒸馏，把（盐类）这些不挥发的组分出去掉。稀释液的配置——选择稀释粉 选择稀释粉：选择一种稀释粉能满足绝大部分猪的稀释粉表1商品稀释剂的pH值和渗透测定结果 稀释剂名称 规格 包装标识保存时间 生产或销售单位 pH值平均值 渗透压均值（mOsm） 韩国Passion 50g/包 3-5d 青岛东晋 6.64 336.0 韩国Prime 50g/包 3-5d 青岛东晋 6.66 334.7 韩国LT 50g/包 5-7d 青岛东晋 7.11 338.0 韩国Harmony 50g/包 3-5d 青岛东晋 6.36 313.7 韩国NAVI 100ml/包 -- NAVI生物科技 6.67 283.3 比利时Cxm-zhl 50g/包 3-5d 济南洛克 6.47 296.3 丹麦Active(洛克) 50g/包 3-5d 济南洛克 6.46 288.3 丹麦Active(富特) 50g/包 3-5d 青岛富特 6.50 305.0 英国Energy 50g/包 3-5d 青岛富特 6.50 278.3 西班牙Diltec 50g/包 5-10d 青岛富特 7.09 338.3 日本力之源长效 50g/包 7-14d 青岛富特 7.06 337.0 日本力之源中效 50g/包 3-5d 青岛富特 7.12 317.7 荷兰MS 50g/包 3-5d 青岛瑞顺通 7.07 311.0 德国米尼图(瑞顺通) 47g/包 -- 青岛瑞顺通 7.04 329.3 德国米尼图长效 60g/包 4d 佛山多乐 7.26 295.3 德国米尼图短效 50g/包 3d 佛山多乐 7.06 315.3 法国卡苏 37g/包 -- 佛山多乐 7.08 322.0 法国BTS 50g/包 -- 佛山多乐 7.11 357.0 美国ESB 25g/包 3-5d 佛山多乐 7.42 295.3 美国多多福 46g/包 短效 上海多福仔 6.45 270.7 美国金多福 50g/包 长效 上海多福仔 7.12 321.3 荷兰银多福 52g/包 中效 上海多福仔 7.07 358.0 北京浩邦 50g/包 3-5d 北京浩邦 7.05 338.7 四川精宫(猪场专用) 52g/包 3-4d 四川莱恩 6.72 302.7 四川精宫(普通型) 52g/包 3-4d 四川莱恩 6.95 293.3 四川精宫(Active) 52g/包 3-5d 四川莱恩 7.15 319.0小结 由表1可知，测定的26种稀释剂中pH最高的为7.42，最低的为6.36，其中20种稀释剂pH值在6.50~7.20，占全部稀释剂74%；11种稀释剂pH值低于7.00，占全部稀释剂的41%。渗透压最高的为357.0mOsm，最低的为270.7mOsm，其中23种稀释剂的渗透压值在280.0~330.0mOsm，占全部稀释剂的85%。表2商品稀释剂对精子活力、精液保存时间及生存指数比较注：表中数字肩部相同字母表示差异不显著(P﹥0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P﹤0.01)，不同小写字母表示差异显著(P﹤0.05)。 稀释剂编号 稀释剂名称 精子活力 保存时间(d) 生存指数 保存0d 保存3d 1 韩国Passion 0.85±0.04 0.82±0.05 4.64±0.27Cc 5.56±0.28Ccd 2 韩国Prime 0.86±0.07 0.70±0.09 3.36±0.26Ffg 3.89±0.31DEef 3 韩国Harmony 0.84±0.06 0.65±0.02 4.08±0.26BCDEde 5.18±0.61Cd 4 比利时CXM-ZHL 0.85±0.05 0.82±0.06 4.35±0.36CDcd 5.91±0.34BCbc 5 丹麦Active(洛克) 0.84±0.08 0.48±0.06 2.48±0.24Gi 3.21±0.06Ef 6 丹麦Active(富特) 0.84±0.04 0.63±0.06 3.11±0.29FGg 3.66±0.35DEf 7 英国Energy 0.84±0.05 0.74±0.03 3.77±0.28DEFef 4.33±0.19De 8 日本力之源中效 0.85±0.03 0.70±0.08 3.50±0.31EFfg 3.25±0.27Ef 9 美国EBS 0.86±0.10 0.81±0.05 6.02±0.30Bb 6.43±0.40ABab 10 法国BTS 0.84±0.07 0.56±0.05 2.58±0.26Ghi 2.37±0.35Fg 11 德国米尼图短效 0.85±0.04 0.72±0.05 4.70±0.19Cc 3.74±0.24DEf 12 荷兰银多福 0.84±0.05 0.70±0.04 7.52±0.32Aa 6.72±0.26Aa 13 荷兰MS 0.84±0.04 0.61±0.04 4.66±0.34Cc 4.23±0.43Def 14 四川精宫(Active) 0.85±0.06 0.63±0.05 3.51±0.54EFfg 5.43±0.37Ccd 15 四川精宫(猪场专用) 0.86±0.04 0.22±0.07 1.25±0.39Hj 1.45±0.43Gh小结 由表2可见，精液保存时间为3d时，除5号、10号和15号稀释剂保存的精液精子活力下降至0.60以下外，其余稀释剂均在0.60以上，其中1号、4号和9号稀释剂精子活力仍维持在0.80以上。15种稀释剂对精液保存时间在1.25~7.52d，生存指数在1.45~6.72。其中12号稀释剂对精液保存时间达到7.52d，生存指数也为最高的6.72，除生存指数与9号稀释剂差异不显著外(P﹥0.05)，极显著高于其他稀释剂(P﹤0.01)；9号稀释剂保存时间为6.02d，除低于12号稀释剂外，极显著高于其他稀释剂(P﹤0.01)。表3商品稀释剂对精子畸形率与精子顶体完整率的比较 稀释剂编号 精子畸形率(%) 精子顶体完整率(%) 保存0d 保存3d 保存0d 保存3d 1 7.10±1.62a 9.25±3.89a 96.25±2.71a 95.22±3.40a 2 5.72±1.50a 7.32±2.83a 98.62±1.43a 98.00±1.16a 3 5.83±2.23a 11.55±3.92a 98.65±1.57a 95.45±2.80a 4 5.95±1.94a 7.67±2.06a 98.52±2.32a 98.18±1.59a 5 5.85±1.35a 7.14±3.12a 98.52±1.77a 97.98±1.53a 6 5.75±2.37a 9.30±1.75a 98.48±2.14a 97.45±1.83a 7 6.71±0.60a 11.39±1.73b 98.43±2.21a 96.08±2.75a 8 6.77±2.57a 11.32±1.94a 97.99±2.37a 95.16±3.28a 9 6.53±2.21a 8.31±2.42a 97.87±2.52a 97.08±1.89a 10 7.52±2.45a 8.27±2.23a 98.39±2.06a 95.08±3.42a 11 6.47±3.12a 8.71±2.59a 98.53±2.17a 97.96±1.90a 12 8.29±0.91a 12.57±2.83b 97.80±2.23a 95.24±4.31a 13 6.53±3.32a 9.33±3.27a 98.62±1.60a 96.44±2.46a 14 7.46±2.41a 10.80±2.08a 95.75±4.23a 93.45±5.34a 15 9.12±0.96a 15.29±2.37b 95.11±4.37a 90.37±2.88a小结 由表3可见，在0d和3d时，15种稀释剂保存精液的精子畸形率分别在5.72%~9.12%和7.35%~15.29%，精子顶体完整率分别在95.11%~98.65%和90.37%~98.18%；7号、12号和15号稀释剂保存精液精子畸形率均差异显著(P﹤0.05)，其余差异均不显著(P﹥0.05)；15种稀释剂保存精液精子精子顶体完整率差异均不显著(P﹥0.05)。精液稀释剂的种类 1、稀释剂分三类：短效稀释剂：一般呈弱碱性，保存1—3天中效稀释剂：一般呈中性，保存3—5天长效稀释剂：一般呈弱酸性，保存5—8天 2、稀释剂原理： 弱酸性环境抑制精子活动，弱碱性环境促进精子活动，所以稀释液要求弱酸性才能抑制精子活动，延长精子寿命（一般稀释剂中常加有酸性物质如柠檬酸等）； 3、正常精液的pH一般为6.8—7.8，呈中性或弱碱性。稀释粉类型 短效稀释剂一般要在3天内使用，如BTS，Kiev（MERCKIII）、修饰Kiev；中效一般可保存4～6天，如VSP，Modena；长效一般可保存7～9天，如Androhep、AndrohepPlus，X-CELl.MR-A，ACROMAX，修饰Modena，VITAL等。无论何种稀释粉配方稀释的精液，应尽快输精，除非迫不得已。不同公猪的精液对稀释液有一定选择性，如果一头公猪精液用某种稀释液保存时，要考虑改变稀释液配方。当然某一固定的稀释液配方应满足多数公猪精液的保存。市场上常见的稀释剂 1、法国卡苏公司（IMV）稀释剂质量最好，但溶解性很差（需磁力搅拌器搅拌或用玻璃棒人工搅拌，也可简单用手不断摇晃）,保存精液可达3—5天； 2、丹麦授权台湾生产的稀释剂质量可以，但溶解性很好，不需搅拌即可溶解,保存精液可达1—3天，在生产实际操作方面，为了保证生产成绩，一般超过2天不再使用； 3、其它国内外生产的稀释剂等。保存稀释剂应注意的事项 稀释剂平时要放在低温冰箱中（5-20度） 配制前提前放到室温（实验室）使其升温到室温（20—25℃）； 尤其是夏季炎热高温，一定要注意稀释剂的存放。稀释液的配置过程提前2小时配置，至少提前1小时配置：稳定要求PH：6.8-7.448小时必须用完。充分溶解——搅拌。使用前30分钟放置37度的恒温水浴锅中按要求准确配置——否则，会遭成渗透压得变化一般情况：1包（50g）配1000毫升去皮重慢慢倒入三级蒸馏水准确称取5000g用前加安多福10ML缓慢加入5包稀释粉放在搅拌器上稀释液的配置流程*精液的稀释主要内容 温度的控制 精液的检查 精液的稀释静置20分钟精液稀释处理的操作流程图称重测密度合格对倍稀释计算稀释头份完全稀释等待3—5分钟保存分装标记品种耳号运输等待3—5分钟检查原精活力检查畸形率检查对倍稀释活力检查稀释后活力检查稀释后活力检查保存后活力温度控制 空气温度的控制：—夏季空调温度25度！35度？１７度？—冬季空调温度28度 设备温度的控制：38度！—温度计、玻璃棒：放到38度恒温箱预热半小时—调整恒温载物台38度，预热盖玻片、载玻片—稀释杯：套上稀释袋，放到38度恒温箱中预热—精液瓶：冬季放到38度恒温箱预热。 稀释液温度：放到38度恒温水槽中 恒温载物台37-38度载玻片盖玻片37-38度采精杯和输精瓶温度控制37-38度精液的检测 观察有无异常：颜色、味道… 精液量：毫升 精子密度：密度仪 精子活力：显微镜 精子畸形率：显微镜计算精液量 原精称重：要求以电子天平称量精液，按1g=1ml计算。 按照水的密度估测精液重量置零或去皮提起精液检测密度 矫正仪器 准确测定 读数矫正密度仪 用红色专用矫正片矫正密度仪 显示数据：误差不能超过基本数字+5 如果超过+5，重新矫正密度仪 一般一个月矫正一次即可。1、认识矫正密度片3、读取数据，不能超过基本数据+52、插入黑色槽中5秒中矫正密度片 把干净的、未滴精液度片插入黑槽中。 读数：<60可用，否则废弃。 每次测密度前，矫正密度片是否合格。测定密度缓慢把精液搅拌均匀，开始测定。用玻璃棒滴满精液密度片口，保证不能有气泡。如果精液过多，用一次性纱布檫掉溢出部分。密度仪稳定后（显示———）时，缓慢推进密度片。等候5秒钟，显示数据后，X106即是此头猪的密度。如果密度<100，废弃！取密度片用温度计从下往上滴原精轻轻放入卡槽中精液密度读数值×106检查原精液活力 载玻片、盖玻片的温度保持在38度 滴一滴精液在载玻片中，45度角轻轻盖上盖玻片。 坚决不允许有气泡。 用100倍镜头观察视野中直线运动的数目占总精子数的比例，<70%丢弃，>70%对倍稀释。精液稀释——对倍稀释：1、温度计矫正：选取两根读数（38度）的温度计。2、同时测量精液的温度和稀释液的温度，两者相差不能超过1度。3、如果两者相差超过1度，调节稀释液温度使之相等。4、沿着玻璃棒缓缓倒入相同体积的稀释液与原精中，切勿速度过快，且不可将原精倒入稀释液中，以防精子剧烈运动死亡。5、沿着一个方向搅拌均匀。调稀释液温度温度相等测原精的温度测稀释液温度对倍稀释再次测定精液活力 检查对倍稀释活率，静止3-5分钟后再次检查活率检查畸形率 认识什么样精子是畸形？下图 确定全部死亡（原精5分钟后）用400倍显微镜头观察 畸形率>15%的废弃。尾部近端原生质滴尾部远端原生质滴发夹形尾巴疏松顶体卷曲尾巴精液稀释——计算精液稀释头份 确定采精量 采精密度 对倍稀释后活力 精子畸形率 头份=采精量*精液密度*稀释活力*（1-畸形率）/30 计算需要添加的稀释液：头份*80ml—对倍稀释的精液量精液稀释——完全稀释：1、同对倍稀释2、添加额定数量的稀释液与精液中。调稀释液温度测精液的温度测稀释液温度全部稀释温度相等小杯倒入大杯*精液稀释的关键点 稀释过程在半个小时完成，否则精子死光光！ 精液不能受到阳光的直射，有害气体的污染，飞尘的污染，强烈震动。 操作台一定要泡沫板上，不能在水泥台直接进行。防止应激死亡。精液的分装精液瓶的温度：与精液温度保持一致，冬季要加温！每隔4-6分钟轻轻搅拌均匀再分装，防止精液沉淀降低活力。公猪精液沿着精液壁缓缓流下，以免震动过强，精子死亡。排尽空气：降低精子氧气消耗，降低精子代谢强度，延长保存时间。公猪耳号：一定要标清！！——非常重要不同的品种，使用不同的颜色标记，同一头公猪使用相同的颜色标记。分装前静置3-5分钟检查活率整个过程分装4-6份后要轻轻搅拌均匀输精瓶上标清楚品种耳号分装精液时输精瓶要倾斜45度角排尽空气柠紧瓶盖精液的短期保存—3-4小时的保存 3～4小时内的保存不用降温。放在常温（25℃左右室温）让它自然冷却即可！ 为什么精液要平放？平放能使精子充分的增加精子的漂浮面积，以防精液沉淀堆积死亡，延长保存时间。密封好的精液要平躺摆放用毛巾盖好运输前静置20分钟检查活率精液的长期（<3天）保存——>5小时的保存5小时以上的保存，可将已经自然降温的精液放在15～18℃恒温箱保存。—小于15℃，精子受冷应激，容易休克，引起死亡。—大于18℃，精子缓慢复苏，处于运动状态，消耗能量，缩短保存时间。2、每隔12小时晃动精液一次，中和代谢产物，延长保存时间密封好的精液要平躺摆放用毛巾盖好平躺于17+1℃恒温冰箱减少开冰箱的次数用毛巾盖好间隔12h缓慢晃动一次*精液的运输 双层黑色避光塑料袋。 泡沫箱分装。 表明耳号、份数、精液活力、送往场。用黑色食品袋避光分装好的精液放置于保温泡沫箱用棉被盖好用透明胶布密封箱子*****