分子标记的实验原理及操作流程(精)

一AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性Amplifiedfragmentlengthpolymorphism(AFLP是在随机扩增多态性(RAPD和限制性片段长度多态性(RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术,具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点,不需象RFLP 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 一样必须制备探针,且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征,同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比,AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究,种质资源鉴定方面的研究,构建遗传图谱等。其基本原理是:以PCR(聚合酶链式反应为基础,结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切,然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”,用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增,只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增,再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物,用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA。二、实验设备1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统,2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机,3.美国MJ公司PCR仪,4.安玛西亚电泳仪等。三、实验试剂1.试剂:请使用高质量产品,推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。DNA提取试剂盒;EcoRI酶,MseI酶,T4连接酶试剂盒;Taq酶,dNTP,PCRreactionbuffer;琼脂糖电泳试剂:琼脂糖,无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;超纯水(18.2MΩ·cm2.其他实验需要物品微量移液枪(一套及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品跑胶检测。一般来说,100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。2、EcoR1酶消化(20ul体系/样品EcoR11ul10×Buffer2ul37℃65℃30min终止反应sample(总DNA5ulddH2O12ul3、Mse1酶消化(20ul体系/样品Mse12ul(1U/ul10×Buffer2ulsample(EcoR1酶切产物80℃30min终止反应ddH2O1ul4、T4DNALigase(20ul体系/样品T4DNALigase2ul(1U/ul10×Buffer2ulsample(双酶切产物10ulMse1Adaptor1ul2265℃10min终止反应EcoR1Adaptor1ulddH2O4ul5、预扩增(20ul体系/样品sample4ulPrimer(Mse1/EcoR11ulAFLPCoreMix15ul*AFLPCoreMix配方:ddH2O13.8ulMgCl21.6uldNTPs(2.5mM1.6ulTaq酶(1U/ul1ul10×Buffer2ul预扩增程序:94℃2min94℃56℃72℃2min60℃30min6、选择性扩增(20ul体系/样品sample4ul(预扩增产物稀释20倍Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX1ulAFLPCoreMix15ul选择性扩增程序:94℃2min94℃20s66℃30s每循环降1℃,共10个循环72℃2min94℃20s56℃30s20个循环72℃2min60℃30min7、产物电泳检测上样液:LoadingBuffer20ulSizestandard-6000.2ulSample3ul(稀释10倍四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特(BeckmanCoulter公司CEQ8000遗传分析系统,运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验,扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0、1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据的可靠性。产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行(图1,得到的数据(图2用第三方软件再进一步统计分析。图1AFLP分子指纹图谱图2AFLP“0、1”矩阵图AFLP操作 流程图 破产流程图 免费下载数据库流程图下载数据库流程图下载研究框架流程图下载流程图下载word :酶切Mse1酶切优化数据分析附录1:常用的8对AFLP选择性扩增引物:E-AGG:5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E-ACG:5-GACTGCGTACCAATTCACG-3E-AAC:5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E-ACA:5-GACTGCGTACCAATTCACA-3E-AGC:5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E-ACT:5-GACTGCGTACCAATTCACT-3E-AAG:5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706E-ACC:5-GACTGCGTACCAATTCACC-3M-CAA:5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3M-CAC:5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3M-CAG:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3M-CTA:5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3M-CAT:5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3M-CTC:5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3M-CTG:5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3M-CTT:5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3附录2:AFLP传统垂直板电泳(银染法检测介绍:原理与方法同前,区别:1.选择性扩增引物不带荧光标记;2.电泳方法不同,采用测序胶垂直板电泳;3.电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工化,工作量大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。示例:下图为玉米(maizeDNA的AFLP图谱。PanelA:AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingEcoR1primerE-AGGwitheightMse1primers:M-CAA(1,M-CAC(2,M-CAG(3,M-CAT(4,M-CTA(5,M-CTC(6,M-CTG(7,andM-CTT(8.PanelB:AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingMse1primerM-CAGwitheightEcoR1primers:E-AAC(a,E-AAG(b,E-ACA(c,E-ACT(d,E-ACC(e,E-ACG(f,E-AGC(g,andE-AGG(h.Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706二ISSR分子标记的实验原理及操作流程ISSR(inter-simplesequencerepeat标记是一种类似RAPD,但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 引物,无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列,由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR仪,PCR管或硅化的0.5mleppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。三、试剂1、ISSR引物:购买成品或根据加拿大BritishColumbia大学设计的ISSR引物序列(见附录自己合成。2、Taq酶3、10xPCR缓冲液4、MgCl2:25mmol/L。5、dNTP:2.5mmol/L。四、操作步骤:1.在25ul反应体系中,加入模板DNA1ul(30-50ngISSR引物1ul(约5pmol10xPCRBuffer2.5ulMgCl22uldNTP2ulTaq酶1单位(U加ddH2O至25ul混匀稍离心,加一滴(约20ul矿物油。2.在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:94℃1分钟,45℃-68℃40秒,72℃1-2分钟,共40轮循环。3.循环结束后,72℃10分钟,4℃保存。4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V(电压低带型整齐,分辨率高。5.电泳结束,溴化乙锭染色20分钟。6.用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图:地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706―――――――――――――――――――――――――――――――――――――――Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录UBCPrimerSet#9(Microsatellite引物名称序列引物名称序列801ATATATATATATATATT851GTGTGTGTGTGTGTGTYG802ATATATATATATATATG852TCTCTCTCTCTCTCTCRA803ATATATATATATATATC853TCTCTCTCTCTCTCTCRT804TATATATATATATATAA854TCTCTCTCTCTCTCTCRG805TATATATATATATATAC855ACACACACACACACACYT806TATATATATATATATAG856ACACACACACACACACYA807AGAGAGAGAGAGAGAGT857ACACACACACACACACYG808AGAGAGAGAGAGAGAGC858TGTGTGTGTGTGTGTGRT809AGAGAGAGAGAGAGAGG859TGTGTGTGTGTGTGTGRC810GAGAGAGAGAGAGAGAT860TGTGTGTGTGTGTGTGRA811GAGAGAGAGAGAGAGAC861ACCACCACCACCACCACC812GAGAGAGAGAGAGAGAA862AGCAGCAGCAGCAGCAGC813CTCTCTCTCTCTCTCTT863AGTAGTAGTAGTAGTAGTTel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706814CTCTCTCTCTCTCTCTA864ATGATGATGATGATGATG815CTCTCTCTCTCTCTCTG865CCGCCGCCGCCGCCGCCG816CACACACACACACACAT866CTCCTCCTCCTCCTCCTC817CACACACACACACACAA867GGCGGCGGCGGCGGCGGC818CACACACACACACACAG868GAAGAAGAAGAAGAAGAA819GTGTGTGTGTGTGTGTA869GTTGTTGTTGTTGTTGTT820GTGTGTGTGTGTGTGTC870TGCTGCTGCTGCTGCTGC821GTGTGTGTGTGTGTGTT871TATTATTATTATTATTAT822TCTCTCTCTCTCTCTCA872GATAGATAGATAGATA823TCTCTCTCTCTCTCTCC873GACAGACAGACAGACA824TCTCTCTCTCTCTCTCG874CCCTCCCTCCCTCCCT825ACACACACACACACACT875CTAGCTAGCTAGCTAG826ACACACACACACACACC876GATAGATAGACAGACA827ACACACACACACACACG877TGCATGCATGCATGCA828TGTGTGTGTGTGTGTGA878GGATGGATGGATGGAT829TGTGTGTGTGTGTGTGC879CTTCACTTCACTTCA830TGTGTGTGTGTGTGTGG880GGAGAGGAGAGGAGA831ATATATATATATATATYA881GGGTGGGGTGGGGTG832ATATATATATATATATYC882VBVATATATATATATAT833ATATATATATATATATYG883BVBTATATATATATATA834AGAGAGAGAGAGAGAGYT884HBHAGAGAGAGAGAGAG835AGAGAGAGAGAGAGAGYC885BHBGAGAGAGAGAGAGA836AGAGAGAGAGAGAGAGYA886VDVCTCTCTCTCTCTCT837TATATATATATATATART887DVDTCTCTCTCTCTCTC838TATATATATATATATARC888BDBCACACACACACACA839TATATATATATATATARG889DBDACACACACACACAC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT890VHVGTGTGTGTGTGTGT841GAGAGAGAGAGAGAGAYC891HVHTGTGTGTGTGTGTGTel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706842GAGAGAGAGAGAGAGAYG892TAGATCTGATATCTGAATTCCC843CTCTCTCTCTCTCTCTRA893NNNNNNNNNNNNNNN844CTCTCTCTCTCTCTCTRC894TGGTAGCTCTTGATCANNNNN845CTCTCTCTCTCTCTCTRG895AGAGTTGGTAGCTCTTGATC846CACACACACACACACART896AGGTCGCGGCCGCNNNNNNATG847CACACACACACACACARC897CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG848CACACACACACACACARG898GATCAAGCTTNNNNNNATGTGG849GTGTGTGTGTGTGTGTYA899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA850GTGTGTGTGTGTGTGTYC900ACTTCCCCACAGGTTAACACATel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706三RAPD分子标记的实验原理及操作流程RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,此技术建立于PCR基础之上,使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物,对基因组的DNA全部进行PCR扩增,以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列,因此须对每一随机引物单独进行PCR,单一引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异,经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。一、实验材料不同来源的DNA(30-50ng/ul。二、实验设备PCR仪,PCR管或硅化的0.5mleppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。三、试剂1、RAPD引物:购买成品或根据赛百盛(SBS公司设计的RAPD引物序列(http://www.sbsbio.com/pro11_1.asp合成。2、Taq酶3、10xPCR缓冲液4、MgCl2:25mmol/L。5、dNTP:2.5mmol/L。四、操作步骤:1.在15ul反应体系中,加入模板DNA1ul(30-50ngRAPD引物1ul(约5pmol10xPCRBuffer1.5ulMgCl21uldNTP1ulTaq酶0.5单位(U加ddH2O至15ul混匀稍离心,加一滴(约20ul矿物油。2.在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:94℃1分钟,36℃1分钟,72℃1分钟,共40轮循环。3.循环结束后,72℃10分钟,4℃保存。4.在15ulPCR产物中加2ul上样缓冲液(6x于1.6%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V。5.电泳结束,溴化乙锭染色20分钟。6.用凝胶成像仪观察、拍照。操作流程简图:Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005网站:www.qdhaosail.com地址:山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706青岛昊航科贸有限公司四SSR标记的实验原理及操作流程SSR简单序列重复标记（Simplesequencerepeat,简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。操作程序：取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记1、DNA提取按照Doyle和Dickson(1987CTAB法（`Cetyltriethylammoniumbromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下：①成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存；②加入600ul65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30～60分钟；③取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:1的氯仿异戊醇；④12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中；⑤加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液；⑥干后用100%的洒精清洗，干后加适量TE2、PCR扩增模板DNA的浓度大约25ng/ul，扩增反应体系为20ul。具体如下：SterileddH2OPCRBuffer11ul3ul网站：www.qdhaosail.comTel:+8653280998002Fax:+8653280998005地址：山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706青岛昊航科贸有限公司dNTP-mixPrimer1Primer2TaqpolymeraseDNA1ul1ul0.5ul(2U/μL3ul0.5ulPCR扩增程序为：（2h30min）①预变性：94℃，5分钟；②变③退④延⑤循性：94℃，40秒；火：55℃40秒；伸：72℃，1分钟；环：从2到4共38个循环；⑥72℃下最后延伸5分钟；4℃5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。3、扩增产物的电泳分离制胶→灌胶→上样→电泳扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离，步骤如下：①准备电极液（1×TBE）；②将梳子拨出，并迅速用电极液冲洗胶面；③不预电泳；④点样，电泳220v；⑤拆板，并及时将内板、边条及梳子洗净。4、凝胶染色①固定：10%醋酸，5分钟；②染色：10分钟；③漂洗：dH2O，5～10秒；④Na2S2O31min⑤显色：甲醛-NaOH,直到满意为止；⑥漂洗：dH2O，2分钟。5、自封带封胶，读带标记，数码照相摄像，室温风干。Tel:+8653280998002Fax:+8653280998005地址：山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706网站：www.qdhaosail.com