胶原的抗原性和免疫原性(2011-7-4)

胶原的抗原性和免疫原性2011-7-4 影响免疫原性的因素 人类对牛胶原的免疫原性 市售胶原制品的免疫原性与副反应 其他胶原的免疫原性影响免疫原性的因素 胶原的结构 供体/受体种属特性 提取方式（酶、酸） 纯度 植入部位 交联方法（戊二醛） 其他影响因素1——胶原的结构两个重要概念 抗原性特指胶原与分泌型抗体的结合和作用能力与自身耐受和种间差异密切相关 免疫原性 能够刺激机体产生免疫应答反应的能力 它指的是一个包括形成（和作用于）上述特异性抗体的过程。“抗原决定簇” 抗原决定簇位于抗原分子上（表面或内部）与抗体相互识别和结合的位点（一个表面或空间结构）引起强烈或微弱的免疫应答，或根本不产生免疫应答反应胶原的抗原决定簇被分为三大类：螺旋区[图1（a）]——被抗体三维构象所识别（如一个完整的三螺旋结构）中央区[图1（b）]——定位于原胶原的三螺旋结构内，但与抗体的识别主要依赖于氨基酸序列，而不是三维空间构象末端区[图1（c）]——定位于胶原分子的非螺旋结构的末端区域（末端肽）胶原氨基酸序列的同源性问题 三螺旋结构种属同源性很高与哺乳动物相比，氨基酸序列的同源性高达？ 端肽 大多数学者认为主要抗原决定簇位于端肽区域 部分研究认为除了端肽外，主要抗原位点是位于中央区或三螺旋区的FurthmayrF,StoltzM,BeckerU,BeilW,TimplR.Chickenantibodiestosolubleratcollagen.II.Specificityofthereactionswithindividualpolypeptidechainsandcyanogenbromidepeptidesofcollagen.Immunochemistry1972;9:789-798.NowackH,HahnE,TimplR.SpecificityoftheantibodyresponseininbredmicetobovinetypeIandtypeIIcollagen.Immunology1975;29:621-628影响因素2——供体/受体的种属类别临床结果显示：正常人群约有2-4%对牛I型胶原存在天然的过敏反应；而与金属镍（10-15%）或乳胶（6%）相比，发生率相对比较低。表1对Ⅰ型胶原特异性的抗体应答反应存在种属依赖性 供体种属 受体种属 主要抗原性位点 次要抗原性位点 一般不涉及到的位点 参考文献 小牛 兔 端肽 三螺旋、中央段 —— 30 大鼠 兔 端肽 三螺旋、中央段 —— 29 大鼠 鸡 三螺旋、中央段 —— 端肽 31,32 小牛 大鼠 三螺旋 —— 端肽，中央段 31,35,36 小牛 小鼠 三螺旋 —— 端肽，中央段 33影响因素3——提取方法 酸溶性胶原，端肽结构不完整 胃蛋白酶溶解的胶原，属于端肽缺陷型胶原 酸溶法和酶溶解法制备的胶原，二者在免疫反应这一块有何差异？目前并不清楚 Questions：端肽的去除对于临床判断免疫学反应到底有何价值和意义？ 胶原中的酸溶部分与中性盐溶部分似乎存在共同的抗原决定簇 胶原中的不溶性部分，具有免疫原性，但不会产生一些能与可溶性胶原具有交叉反应性的抗体（？）FormationofCollagen.I.AntigenicityofCollagenFractionsPazetal.Exp.Biol.Med..1963;113:98-100补充 胶原蛋白酶对胶原蛋白的水解主要破坏胶原的螺旋区，使其变成小分子肽链 胃蛋白酶对胶原蛋白的酶解促溶,只是切除胶原蛋白的尾肽,使其变为可溶 酶提取和酸提取的胶原在性质上无显著不同胃蛋白酶切割示意图 端肽的作用参与胶原的交联、纤维形成过程 切除端肽导致胶原三螺旋结构不完整溶解性增加胶原发生不定向重排失去带状纤维排列方式关于端肽因氨基端端肽切除有残余抗原位点被保留，使得处理后的胶原与天然胶原的抗原性往往无法区分开来BeilW,TimplR,FurthmayrF.Conformationdependenceofantigenicdeterminantsonthecollagenmolecule.Immunology1973;24:13-24影响因素4——纯度 非胶原成分是导致胶原止血材料引起免疫反应的最主要因素DeLustroF,CondellRA,NguyenMA,McPhersonJM.Acomparativestudyofthebiologicandimmunologicalresponsetomedicaldevicesderivedfromdentalcollagen.JBiomedMaterRes1986;20:109-120TsudaH,HigashiS,IwanagaS,KubotaT,MoritaT,YanagaK.Developmentofantitissuefactorantibodiesinpatientsafterliversurgery.Blood1993;82:96-102影响因素5——植入位点 材料的植入位点与其免疫反应也有一定的关联性与血液循环系统或淋巴系统距离越远，发生免疫反应的几率越小植入部位可能使材料暴露于免疫系统中，因而被排斥，反之，则呈现“免疫沉默现象”。DahmM,LymanWD,SchwellAB,FactorSM,FraterRW.Immunogenicityofglutaraldehydetannedbovinepericardium.JThoracCardiovascSurg1990;99:1082-1090CourtmanDW,ErrettBF,WilsonGJ.TheRoleofcrosslinkinginmodificationoftheimmuneresponseelicitedagainstxenogenicvascularacellularmatrices.JBiomedMaterRes2001;55:576-586影响因素6——交联处理 戊二醛交联能够有效降低免疫原性，因交联作用重塑或修饰了胶原的主要抗原性位点，减少了其与抗体的结合能力 戊二醛交联导致免疫反应增强，是戊二醛本身的细胞毒性引起？还是戊二醛导致了抗原性位点的暴露？CourtmanDW,ErrettBF,WilsonGJ.TheRoleofcrosslinkinginmodificationoftheimmuneresponseelicitedagainstxenogenicvascularacellularmatrices.JBiomedMaterRes2001;55:576-586SpeerDP,ChvapilM,EskelsonCD,UlreichJ.Biologicaleffectsofresidualglutaraldehydeinglutaraldehyde-tannedCollagenbiomaterials.JBiomedMaterRes1980;14:753-764人类对牛胶原的免疫原性 仅一篇文献提出：对胃蛋白酶处理的牛胶原，其三螺旋区和中央区的抗原决定簇是引起人类免疫应答反应的主要抗原位点（与人体抗血清反应） 目前尚没有证据表明，人类对牛胶原和猪胶原发生免疫反应的的主要抗原性位点是位于端肽内部的。EllingsworthLR,DeLustroF,BrennanJE,SawamuraS,McPhersonJ.Thehumanimmuneresponsetoreconstitutedbovinecollagen.JImmunol1986;136:877-882 在鸡血清中发现针对2种抗原决定簇的抗血清具有同等滴度； 只在兔抗血清中发现具有末端非螺旋区的抗原决定簇特异性的抗体产生； 复性常常伴随着一个明显的血清活性恢复的过程 螺旋型抗原决定簇具有一个不完整的三螺旋结构，能够被大鼠抗血清所识别； 用变性胶原进行免疫，则发现只能针对中央区决定簇产生免疫反应；(Immunology,1973,24,13)+为天然胶原；++为变性胶原ZYDERM胶原植入剂过敏患者的血清学、组织学和免疫学检查ZYDERM抗体不仅与天然牛皮胶原反应，还可以与热变性的牛皮胶原反应具有过敏反应的患者血清中抗胶原（天然胶原或热变性胶原)抗体滴度ELISA分析纯化胶原的a1(I)和a2（I）肽链能与抗血清反应含ZCI抗体的血清与天然/热变性牛Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型胶原的反应性 所有血清中89%含有a1-CB6特异性抗体，77%含有抗a2-CB4特异性抗体，65%抗体能与两种CB片段反应。 除此外，大部分血清（77%）包含特异于两种或更多种主要CB肽特异性的抗体。最少的抗原性片段是a2-CB3,5（8%）。 血清中还含有天然和热变性牛Ⅲ型和Ⅱ型胶原的抗体，几乎没有发现种属间（大鼠或豚鼠）交叉反应的存在（I和Ⅱ型胶原）。 这些血清中并不含有特异于人的I型，Ⅱ型和Ⅲ型胶原的抗体。抗牛间质ZCI胶原的抗血清，与豚鼠和大鼠来源的天然/变性Ⅰ/Ⅱ型胶原间无交叉反应性局部ZCI超敏反应的患者血清，与人Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型胶原间无交叉反应性市售胶原制品及其应用 学科 应用 剂型 商品名 止血 心血管外科，神经外科，皮肤创伤矫形外科，口腔科，普通外科 海绵，粉末，纤维 CoStasis,FloSeal,Hnstat,BioPath,Avitene,其胜 皮肤医学 用于软组织增生的可注射型胶原，胶原类人工皮肤，伤口敷料 膜剂，凝胶 Dermagraft,Graftskin,OrCel，倍菱牌，其胜 心血管外科和心脏病学 血管移植物胶原涂层，人体血管移植物，牛动脉移植物，猪心脏瓣膜，牛心包心脏瓣膜，血管穿刺孔密封装置 液体，管型，复合型 angio-seal,vasoseal,hemashield,intergard 神经外科学 引导周围神经再生，硬脑膜替代材料 膜，管型 duragen 牙周病学和口腔医学 牙周韧带再生的胶原膜，可吸收的口腔组织伤口敷料，牙槽嵴增生的胶原/羟基磷灰石 膜，海绵 bio-patch,vitacuff 眼科学 促进上皮愈合的胶原角膜罩，将药物输送至眼睛的胶原片，角膜移植，玻璃体置换，视网膜重新附着 海绵，膜片 Bio-Cor,collacote 矫形外科 骨修复的胶原和羟基磷灰石，半月板再生的胶原基质，跟腱替代和再生的胶原材料，前交叉韧带重建的重组胶原模板 复合型 collagraft,Healos 泌尿科 治疗尿失禁，肾修复，尿管替换 凝胶，海绵 Contigen 普通外科 疝气修复，粘附阻隔，胶黏剂 凝胶，膜，海绵 食道外科 声带扩增，声带修复 凝胶 其胜 耳科学 鼓膜替代 凝胶，膜 其他应用 药物输送载体，生长因子和生物活性大分子输送载体，组织和器官再生的细胞 复合型，颗粒型 胶原组织工程皮肤 国内仅1个获批产品——安体肤（国食药监械(准)字2007第3461110号） 表皮层由人表皮细胞构成，真皮层由人成纤维细胞和牛胶原蛋白构成。 陕西艾尔肤生物工程有限公司 产品名称 厂家 真皮细胞 上皮成分 Apligraf organogenesis公司 含异体成纤维细胞的胶原蛋白凝胶 异体角化细胞 Biobrame DowHickam/Bertek制药公司 胶原涂层的尼龙网 凝胶层 Integra Integra生命科学公司 胶原/糖胺聚糖膜 硅塑料涂层 Ortel Ortec国际公司 含异体成纤维细胞的胶原蛋白海绵 异体角化细胞 CSS 未标明公司（正在研制） 含自体成纤维细胞的胶原/糖胺聚糖海绵 自体角化细胞市售胶原制品免疫原性及副作用 产品 组成 胶原 有记载的案例 参考文献 类型 提取方法 是否交联 应用 病例数 免疫应答情况 43,44,47 医学美容 Zyderm/ZyplastcollagenCorp,PaloAlto,CA 胶原 牛皮Ⅰ型（95%）Ⅲ型（5%） 胃蛋白酶 无 软组织注射填充 ＞1000000 2%的患者本身对胶原存在过敏反应，1%患者是接触注射物后发生过敏反应1%患者针对胶原主要发生局部炎症反应和肉芽肿形成的副反应 AtelocollagenKoken:TokyoJapan 胶原 牛皮Ⅰ型 胃蛋白酶 无 软组织注射填充 705 3.8%的患者本身对胶原存在过敏反应2.3%患者在接受注射治疗后发生局部炎症反应和肉芽肿 45 皮肤病学领域 IntegraIntegraLifeScienceCorp,Plainsboro,NJ 胶原-GAG/硅酮 牛皮Ⅰ型 酸法提取 Glut,DHT 皮肤替代物；用于创面闭合 159 无副作用，未指明免疫学反应相关数据记录 67,78-81 ApligrafOrganogenesisInc.,Canton,MA 角化细胞/胶原和成纤维细胞 牛皮Ⅰ型 酸法提取 无 皮肤替代物用于创面覆盖 107 3%的患者本身对胶原存在过敏反应在与植入物接触后未见有新的患者出现过敏反应；未见任何与移植物有关的免疫应答反应 46，71 整形外科领域 collagraftZimmerCorporation,Warsaw,IN 胶原/HAP/TCP 牛皮Ⅰ型 胃蛋白酶 无 用于脊柱融合术后的骨填充；骨折固定 303 术后仅1例（0.33%）出现牛胶原过敏反应，无相关并发症 59,60,82 AlveoformCollagenCorporation,PaloAlto,CA 胶原/HAP 牛皮Ⅰ型 未指明 未指明 用于上颌骨填充和下颌骨展开 77 6.5%的患者本身对胶原存在过敏反应另有6.5%的患者在术后出现胶原过敏反应在手术效果方面无副作用 62,63 其他领域 CoStasisCohesionTechnologies,PaloAlto,CA 胶原/凝血酶 牛皮Ⅰ型胶原 胃蛋白酶 无 止血喷雾剂 92 1%的患者本身对胶原存在过敏反应另有8%患者在接触产品后出现过敏反应在手术效果方面无副作用 72 NerveRegenerationConduitNoncommercial,Kyoto,Japan PGA管/胶原填充剂 猪皮Ⅰ型（85%）Ⅲ型（15%） 胃蛋白酶 DHT 用于手指，腓骨神经移植 65 无副作用，未指明有相关的免疫学反应数据记录 83,84牛胶原注射剂临床副反应 超敏反应——最常见的副反应皮试人群3%(偶有高达10%，因产品而异）在注射部位发生（最初72h内）治疗患者中1-2%（偶有高达5%，因产品而异）在注射部位出现随时间延长，被宿主机体吸收，副作用消失在发生超敏反应的人群中，约有90-100%人群血清中证实存在牛胶原抗体这些抗体特异于牛I型胶原，而不会与人类的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原存在交叉反应。 一过性的非炎症反应——24-48h内消失短时肿胀轻微发红略感不适 注射区轻度水肿或瘙痒 肉芽肿（发生率1/万） 急性水疱 亚急性溃疡阴性皮肤试验不代表以后的皮肤试验也是阴性的（？）其他胶原的免疫原性 大鼠胶原（可溶性）兔抗大鼠胶原在大鼠中的组织定位研究发现，抗体会定位于肾小球基底膜或肾小管上及多数器官结缔组织部位。抗体是针对胶原的，还是针对非胶原的蛋白或多糖？人与大鼠I型胶原a1肽链的同源性，Identities=1348/1464(92%)人与大鼠I型胶原a2肽链的同源性，Identities=1348/1464(92%) 其他胶原研究较少医疗器械潜在的免疫毒性体液免疫评价细胞免疫评价医疗器械免疫应答评价指标如何评价胶原材料的免疫原性和毒性？