沙门氏菌脂多糖的提取与制备

沙门氏菌脂多糖的提取与制备 生技 052  张创峰 指导教师  宫  强 摘 要 目的：提取制备出鸡白痢沙门氏菌的脂多糖（Lipopolysaccharides  LPS），并检测出其纯度，免疫动物后检测其诱导机体产生抗体的效价。 方法：对刚接种的沙门氏菌进行37℃培养过夜，此时菌体大致处于对数期。利用热酚水法提取LPS，通过离心、反复冻融对菌体进行破碎，再透析、浓缩进行LPS粗提取，进而通过酶解、加丙酮沉淀等一系列步骤纯化LPS；然后利用紫外光谱法、 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线法和硫酸蒽酮法分别对制备的LPS溶液中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，配制成适合注射的LPS浓度；最后通过皮下注射免疫鸡，对鸡血进行离 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 到血清，保存血清。免疫三次，采血三次，利用间接Elisa法测定抗体的效价。 结果：成功提取了沙门氏菌的LPS，免疫注射浓度为121.5μg/mL。未经酶解的粗制LPS于260nm处有强吸收，经酶解处理分离纯化的LPS，于260nm处吸收值较小。经分光光度计测定，结果为0.324，从标准曲线找出其蛋白含量为 0.59mg/mL。然而所提取的LPS并未使动物产生抗体，免疫动物不成功。 关键词：鸡白痢沙门氏菌，脂多糖（LPS），提取，糖含量，免疫，ELISA Extraction and Preparation of Salmonella Lipopolysaccharide Grade 2005, Class 2, Major of Biotechnology  Chuagfeng Zhang Tutor  Qiang Gong Abstract Objective This study was to extract and prepare Salmonella pullorum’s Lipopolysaccharides (LPS), and test its purity, after immune the animals, we will detect its antibody titer induced by the production. Methods Put the vaccinated Salmonella at just 37℃ overnight train, to ensure the biomass is at logarithmic phase, and then extraction of LPS from biomass with mixture of hot phenol-water, through centrifugation and repeated freezing and thawing the biomass to carry out broken the biomass, and then dialysis, dialysis the solution for the crude LPS extraction, through the zymohydrolysis, adding acetone to precipitate LPS, using the ultraviolet spectroscopy, the BSA standard curve method and anthrone-sulfuric acid method for testing the content of nucleic acids, protein, sugar of the prepared LPS solution. Finally, through the subcutaneous injection to immune chicken, to obtain serum from centrifuged blood, preservation serum, immunization three times, blood three times, select chicken serum antibodies, using an indirect Elisa method to detect the titer of antibody. Results We successfully extracted LPS from the Salmonella, the concentration for immunization is 121.5μg/mL. Without the enzyme in the crude LPS there is strong absorption of 260nm by the enzyme to deal with separation and purification of LPS, in a relatively there is small absorption of 260nm Department. Measured by the spectrophotometer, the results is 0.324, we can find out the protein content is 0.59mg/mL from the standard curve. Nevertheless, the extraction of LPS did not make animals generate antibodies, the immune on animals is unsuccessful. KEY WORDS: Salmonella Pullorum, Lipopolysaccharides(LPS), extracts, sugar content, immunization, ELISA 目 录 前 言    1 第1章 文献综述    2 1.1 鸡白痢简介    2 1.1.1 病原    2 1.1.2 传播流行特点    2 1.1.3 病理变化    2 1.1.4 检测手段    3 1.1.5 研究趋势    4 1.2 LPS研究进展    5 1.2.1 LPS的来源    6 1.2.2 LPS的结构    6 1.2.3 LPS提取方法的研究    6 第2章 实验材料与方法    8 2.1实验材料    8 2.1.1菌株与实验动物    8 2.1.2 试剂    8 2.1.3 主要溶液的配制    8 2.1.4 主要仪器    10 2.2 实验方法    10 2.2.1培养基的配制    10 2.2.2菌体的获得    11 2.2.3 LPS粗品的制备    11 2.2.4 LPS的纯化    12 2.2.5 LPS某些物质含量的测定    12 2.2.6 O-SP制备    13 2.2.7 免疫与采血    13 2.2.8 血清分离    13 2.2.9抗体效价的测定    13 第3章 结果与讨论    15 3.1 结果    15 3.1.1 LPS核酸的检测    15 3.1.2 LPS蛋白含量测定    15 3.1.3 LPS糖含量测定    15 3.1.4提取的LPS免疫原性检测    16 3.2 讨论    17 第4章 结论    19 参考文献    20 致 谢    22 外文资料译文 前 言 禽沙门氏菌病(Salmonellosisavium)，即鸡白痢，是一个概括性术语，指由沙门氏菌属中的任何一个或多个成员所引起禽类的一大群急性或慢性疾病。沙门氏菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，沙门氏菌属包括了2100多个血清型。在自然界中，家禽构成了沙门氏菌最大的单独贮存宿主。 鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡的传染病。本病特征为幼雏感染后常呈急性败血症，发病率和死亡率都高，成年鸡感染后，多呈慢性或隐性带菌，可随粪便排出，因卵巢带菌，严重影响孵化率和雏鸡成活率。本病可经蛋垂直传播，也可水平传播。 目前，预防鸡白痢普遍采用庆大霉素、痢特灵、氯霉素以及新型喹诺酮类药物，但是，用药物预防需要防止长时间使用一种药物，更不更一味加大药物剂量达到防治目的。而且需要有效药物在一定时间内交替、轮换使用，药物剂量要合理。做到这些对于一般的养殖来说是比较困难的。而生物制剂在防治鸡白痢疾病方面有较好效果，具有安全、无毒、不产生副作用，细菌不产生抗药性，价廉等特点。经大批量的实验认为，生物制剂防治鸡白痢病的效果多数情况下相当或优于药物预防的水平。 因此，研发预防鸡白痢的新型疫苗势在必行。而LPS是鸡白痢沙门氏菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。各项研究的进行以及方法的研究都需要对鸡白痢沙门氏菌LPS结构特性及其特异性免疫保护进行研究，因而提取沙门氏菌LPS是各项相关工作的第一步，沙门氏菌LPS本身目前已成为医学和免疫学的研究热点之一。因此提取与制备沙门氏菌LPS更加必要的。本文直接通过提取鸡白痢沙门氏菌LPS制备抗原，对鸡进行免疫，对于研究预防鸡白痢疾病的疫苗也是有其现实意义的。 本文研究了热酚水法提取脂多糖，通过离心、反复冻融，透析、浓缩、酶解一系列步骤进行纯化，然后利用紫外光谱法、标准曲线法和硫酸蒽酮法分别对LPS中核酸、蛋白、糖的含量进行分析测定，最后通过皮下注射免疫兔子，从兔子血清中获得抗体，利用间接Elisa法测定抗体的效价。 第1章 文献综述 1.1 鸡白痢简介 鸡白痢(Salmonellosisavium)是由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡的传染病。是一种古老而且危害严重的禽类传染病，在世界范围内均有发生，是世界性疾病。沙门氏菌属是庞大的肠杆菌科的一个成员，沙门氏菌属包括了2100多个血清型。在自然界中，家禽构成了沙门氏菌最大的单独贮存宿主。在所有动物中，最常报道的沙门氏菌来源于家禽和禽产品。因此鸡白痢已成为严重影响家禽养殖业的问题之一。 1.1.1 病原 鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌所引起鸡的一大群急性或慢性疾病。鸡白痢沙门氏菌具有高度宿主适应性。本菌为两端稍圆的细长杆菌（0.3～0.5um×1～2.5um），对一般碱性苯胺染料着色良好，革兰氏阴性。细菌常单个存在，很少见到两菌以上的长链。在涂片中偶尔可见到丝状和大型细菌。本菌不能运动，不液化明胶，不产生色素，无芽胞，无荚膜，兼性厌氧。分离培养时应尽量避免使用选择性培养基，因为某些菌株特别敏感。沙门氏菌在下列培养基中生长良好，如营养肉汤或琼脂平板。在普通琼脂、麦康凯培养基上生长，形成圆形、光滑、无色呈半透明、露珠样的小菌落[1]。在外界环境中有一定的抵抗力，常用消毒药可将其杀死。 1.1.2 传播流行特点 各种品种的鸡对本病均有易感性，以2～3周龄以内雏鸡的发病率与病死率为最高，呈流行性。随着日龄的增加，鸡的抵抗力也增强。成年鸡感染常呈慢性或隐性经过。火鸡对本病有易感性，但次于鸡。鸭、雏鹅、珠鸡、野鸡、鹌鹑、麻雀、欧洲莺和鸽也有自然发病的 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。芙蓉鸟、红鸠、金丝雀和乌鸦则无易感性。一向存在本病的鸡场，雏鸡的发病率在20％～40％左右，但新传入发病的鸡场，其发病率显著增高，甚至有时高达100％，病死率也比老疫场高。本病可经蛋垂直传播，也可水平传播[2]。 1.1.3 病理变化 雏鸡：在日龄短、发病后很快死亡的雏鸡，病变不明显。肝肿大，充血或有条纹状出血。其他脏器充血。卵黄囊变化不大。病期延长者卵黄吸收不良，其内容物色黄如油脂状或干酪样；有心肌、肺、肝、盲肠、大肠及肌胃肌肉中有坏死灶或结节。有些病例有心外膜炎，肝或有点状出血及坏死点，胆囊肿大，脾有时肿大，肾充血或贫血，输尿管充满尿酸盐而扩张，盲肠中有干酪样物堵塞肠腔，有时还混有血液，肠壁增厚，常有腹膜炎。在上述器官病变中，以肝的病变最为常见，其次为肺、心、肌胃及盲肠的病变。死于几日龄的病雏，见出血性肺炎，稍大的病雏，肺可见有灰黄色结节和灰色肝变[3]。 成年鸡：慢性带菌的母鸡，最常见的病变为卵子变形、变色、质地改变以及卵子呈囊状，有腹膜炎，伴以急性或慢性心包炎。受害的卵子常呈油脂或干酪样，卵黄膜增厚，变性的卵子或仍附在卵巢上，常有长短粗细不一的卵蒂（柄状物）与卵巢相连，脱落的卵子深藏在腹腔的脂肪性组织内[4]。有些卵则自输卵管逆行而坠入腹腔，有些则阻塞在输卵管内，引起广泛的腹膜炎及腹腔脏器粘连。可以发现腹水，特别见于大鸡。心脏变化稍轻，但常有心包炎，其严重程度和病程长短有关。轻者只见心包膜透明度较差，含有微混的心包液。重者心包膜变厚而不透明，逐渐粘连，心包液显著增多，在腹腔脂肪中或肌胃及肠壁上有时发现琥珀色干酪样小囊包。 成年公鸡的病变，常局限于睾丸及输精管。睾丸极度萎缩，同时出现小脓肿。输精管管腔增大，充满稠密的均质渗出物。 1.1.4 检测手段 自19世纪后期，沙门氏菌首次被鉴定为人类的一种病原以来，检测方法学都是建立在采取感染病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。此后的60年间，用于分离沙门氏菌的方法实质上与那些用于临床病料的方法是相同的。随着DNA和抗体技术的发展，近10～15年间发展了无数改进的方法，其中许多可以在48h内检出沙门氏菌，这些方法通称为快速检测。 最初的是传统的培养方法，是选择性增菌步骤，它使沙门氏菌生长而使肉汤中同时存在的微生物数量减少。由于没有任何一种培养基可以全面地保持各种沙门氏菌血清型，所以，较适当的做法就是使用两种培养基平行地进行试验。然后选择性培养物在含一种或多种抑制非沙门氏菌生长制剂的琼脂平板上划线培养，对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并对该菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4～7天，才能得出明确的诊断结果[5]。 然后发展了以抗体为基础的检测方法，利用抗原-抗体反应的显著特异性，来进行细菌的鉴别和血清学定型，已有半个多世纪的历史。已经建立的沙门氏菌免疫学检测方法有许多种，大致可分为以酶标抗体(ELISA)，荧光抗体染色(免疫荧光法)，同位素标记抗体(放射免疫试验)为基础的方法及其它多种以抗体为基础，利用乳胶凝集、免疫传感器、免疫扩散及免疫色谱技术的方法。但常规中最广泛采用的是以双位点ELISA技术即夹心ELISA为基础的方法[6]。此法改进后用有放射活性的同位素替代标记抗体，然后用分光光度法即很容易检测到目标抗原。采用微量滴定板作为固态基质使反应形式标准化，并促成其自动化。 黎兆滚等人首次在国内口岸系统应用微量板ELISA法(Salmonelletest1)对进出口动物产品(鱼粉、肉骨粉等)进行沙门氏菌检测。总的来说，标准的ELISA法样品的制备，约需要经过40～48h的孵育才能完成。黎兆滚等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)样品制备过程分三步，共耗时24h比上述标准的ELISA法样品制备过程缩短了一半的时间。ELISA方法身，则仅需要大约2h而已（其中30min是操作时间，90min是孵育时间[7]）。相比之下，黎兆滚等人的方法可在27h内完成，比上述方法缩短了一半的时间，颇值得推广应用。 近几年则发展了以核酸为基础的方法，细胞核酸DNA和RNA是唯一一类可以携带信息的大分子。由于所有的细胞都含有这种分子，可以利用它作为检测的标靶。标靶通常是一个特异性核酸序列，它可通过以补体核酸分子作为探针来检出。与免疫学方法相似，探针也需要加附适当的标记，如放射性同位素的标识物。Fitts等人检测极限可达108个细菌/mL，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室应用，此方法的优点都被抵消了。为此，以核酸杂交为基础的第二代技术—比色计目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)—核糖体发育过程中储存的核酸成分的检测。由于rRNA为单链(而DNA为双链)，杂交前需要进行预增菌和选择性增菌。rRNA探针法比沙门氏菌ELISA法更耗时，但二者成本相近。聚合酶链反应(PCR)，用该体系可对制备好的样品进行细菌DNA扩增，以便更易于用诸如凝胶电泳法或比色型ELISA法检测。一个完整的以PCR为基础的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵销了其高敏感性的优点[8]。 1.1.5 研究趋势 鸡白痢作为重要的人畜共患病，它的传染和流行不仅严重影响了畜牧业的健康持续发展，而且还威胁着人类的身心健康。 早在20世纪就用青霉素、链霉素、土霉素对其防治，鸡白痢沙门氏菌对抗生素药物的敏感性在不断变化，在不同地区，不同场群的药敏情况可有很大不同，所以应经常分离致病菌株，做药敏试验并研究用药途径，以免盲目用药贻误时机，药物防治可有效地控制商品鸡群鸡白痢病的发生。即往常用于鸡白痢的的土霉素，四环素，磺胺类，青霉素，链霉素等药物在生产实践中的防治作用已很低，甚至完全无效，但庆大霉素，卡那霉素，氯霉素，新霉素肌肉注射，并注意穿梭用药，防治效果非常显著[9]。 但是后来经过大量的试验表明药物防治的区域性太大，所以使人们又希望寻求一种更加高效而又受区域限制小的防治方法。随着分子生物学技术的不断进步，目前研制的特异性主要有减毒活菌苗免疫预防、灭活菌苗免疫预防、脂多糖抗原免疫预防和高免卵黄液被动免疫，这些疫苗应用免疫保护效果比较显著。为了更好地防治鸡白痢和有效地实施根除 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ，需要进一步对鸡白痢的遗传学和分子流行病学、传播该病的生物种类、病原与宿主复杂的相互作用等进行详细研究。 碳水化合物（如乳糖、甘露糖）可减少鸡白痢沙门氏菌在肠道内定居，促进其他肠道菌丛的生长，后者可创造对白痢沙门氏菌不利的生长环境，有人用2.5%的5中糖于出壳时饮水，3日于后攻击白痢沙门氏菌，10天时扑杀检测白痢沙门氏菌的定居数量，结果预防组白痢沙门氏的定居数量明显减少，对照组为100%[10]。乳糖的作用也可能提高肠道的酸性。把鸡沙门氏菌弱毒苗按不用剂量分别往口服和颈部皮下接种1日龄商品带鸡具有良好的安全性和免疫力。陈金顶研究，口服抗生素后对集白痢伤寒沙门氏菌的定植量明显增多，PH值也显著增高，他认为，抗生素可以破坏生态平衡，是病菌定植的几率增高。 芬兰科学家 Nurmi（1973）和Rantala根据他们的研究，首先提出了利用竞争排除方法控制鸡白痢沙门氏菌感染的理论及方法，即生物竞争排斥的理论[11]。一句此理论，近几年为防止鸡白痢，推出了调菌生，调痢生，促菌生，乳康生等各种微生态制剂（活菌生物制剂），对雏鸡口腔滴服的促生长和预防效果显著。他们无药物残留，不污染环境，符合生态规律，应用前景较为广阔，但仅在环境控制，卫生状况良好的情况下表现较好的防治作用。给1日龄的雏鸡喂服获喷雾成年健康鸡肠道内容物悬浮液或者厌氧培养物，有效地提高了雏鸡对白痢沙门氏的抵抗力，这被称为Nurmi概念[11]。 1.2 LPS研究进展 一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌，如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构[12]。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖（LPS）中的类脂A成分。 LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero毒素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要作用。它是鸡白痢沙门氏菌菌体主要的保护性抗原之一，与外膜蛋白在免疫中共同起着重要的作用。 1.2.1 LPS的来源 沙门氏菌菌体裂解后可释放内毒素, 日本和我国学者普遍认为内毒素包含脂多糖和蛋白质两部分, 而英美学者认为内毒素就是脂多糖。脂多糖又称细菌内毒素，对其研究已有60多年的历史，作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero毒素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要作用[13]。1909 年Coley报道革兰阴性菌具有抗肿瘤效果后，后续研究证明革兰阴性菌细胞壁的结构成分细菌脂多糖，具有抗肿瘤及增强免疫功能等作用[14]。 1.2.2 LPS的结构 革兰氏阴性细菌细胞壁较薄，厚约10－15nm,结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成，位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原(O抗原)，有特异性[15]。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctonic acid，KDO)等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分[16]。 1.2.3 LPS提取方法的研究 研究LPS生物活性时，LPS的提取是通过利用有机溶剂分离的经典方法。经典方法提取LPS包括利用热酚水法 (PW)，或使用由苯酚、氯仿、石油醚(PCP)组成的混合溶剂从大量生物体中获得[17]。这两种方法都是基于破坏细菌细胞膜及利用苯酚析出蛋白质，但他们具有不同的选择性。热酚水法提取光滑型(S)和粗糙型(R)的LPS，而为PCP法主要分离粗糙型LPS。 Darveau 和 Hancock采用了更少见的方法，用机械方法破坏细菌的细胞，然后利用酶处理，加入SDS或/和EDTA,对提取LPS两种类型(R和S)同样有效[18]。其他几个可供选择的方法是采用多种有机溶剂，如盐，酸或碱，配合剂或酶，这些都被介绍过[14]。 所介绍的这些方法对于实验室规模是非常有用的，但是扩大提取是很困难的。这么多的步骤十分费劲，它还会残存有机溶剂、制造毒废物，以至最终产品可能被溶剂残留物所污染。目前，LPS制剂有越来越多的市场需求，它们需要不含有毒杂质，例如用作免疫学研究或作为疫苗佐剂一种有价值的源泉。温和的和单步程序制备纯化内部核心抗原决定簇具有特定的免疫决定子粗糙型LPS菌类将是非常重要的，例如脑膜炎球菌。 Jacek Rybka和Pawel Grycko则采用超临界流体二氧化碳（scCO2）进行LPS的提取，scCO2是有害易燃的有机溶剂的安全替代物[19]。通过压力和温度以及添加少量极性的选择性共溶剂来改变scCO2溶剂属性如密度或疏水性是相对简单的。该方法能适应特定的需求，如提取高疏水性或高极性物质。 国内外不论是从不同的取材还是用不同的方法来提取脂多糖，都涉及到热酚水法，因而，热酚水法依然广泛使用于脂多糖的提取，秦敏对热酚水法进行了优化处理，改进后用乙醇分级沉淀冷冻离心法所提取的脂多糖较纯，利于后续研究。周丽蓉用DNase I酶和 RNase 酶作用除去DNA和 RNA ,得到初步纯化的脂多糖，方法简单快速。冷静用westphal 热酚水法对脂多糖进行粗提, 阴离子交换层析法进行纯化[20]。适用于纯化出低相对分子质量高纯度水溶性的成团泛菌脂多糖LPS，为不同分子质量的脂多糖的提纯提供已较好的思路和研究方法。 第2章 实验材料与方法 2.1实验材料 2.1.1菌株与实验动物 沙门氏菌43063号菌株购自中国兽药检查所； 成年家养鸡两只购自菜市场。 2.1.2 试剂 兔抗鸡IgG-HRP购于北京希凯生物科技有限公司； RNaseA购于上海生物工程技术服务有限公司； DNase I购于北京希凯生物科技有限公司； 考马斯亮蓝R-250购于中国医药（基团）上海化学试剂公司； 聚乙二醇6000购于天津市科密欧试剂公司； 牛血清白蛋白购于上海天呈医流有限公司； 蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉等生化试剂购于北京奥博星生物技术有限责任公司； 苯酚、蒽酮、葡萄糖 、氯化钠（NaCl）、冰乙酸、氢氧化钠（NaOH）、乙醇、磷酸等试剂均为国产分析纯。 2.1.3 主要溶液的配制 （1）热酚水法提取脂多糖所需试剂 45%酚水溶液：加55mL去离子水于45mL融化的苯酚溶液中，混匀后室温保存备用。 95%酚水溶液：加5mL去离子水于95mL融化的苯酚溶液中，混匀后室温保存备用。 （2）O-SP制备所需试剂 1.5%醋酸溶液：加1.5mL冰乙酸于98.5mL去离子水中，混匀后室温保存备用。 （3）测脂多糖中某些物质含量所需试剂 标准蛋白质溶液：精确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000mg/mL的原液，混匀后室温保存备用。 考马斯亮蓝G—250试剂：称取25mg考马斯亮蓝G—250，溶于12.5mL95%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到250mL，混匀后室温保存备用。 标准葡萄糖溶液：精确称取50mg葡萄糖，溶于500mL蒸馏水中，即为100mg/L的原液，混匀后室温保存备用。 蒽酮试剂：称取蒽酮0.2g，溶于100mL浓硫酸（AR 95%～98%）, 使其终浓度为 2g/L，混匀后室温保存备用。 （4）ELISA检测测抗体效价所用主要试剂 包被缓冲液：0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS） Na2CO3            l.59g NaHCO3            2.93g 加去离子水水至1000mL，调pH值到9.6。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 磷酸盐缓冲溶液（1×PBS）：0.01 mol/L、pH7.4 NaCl                8.0g KH2PO4            0.2g KCl                0.2g Na2HPO4·12H2O    2.9g 溶于900mL去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 10×PBS：0.2 mol/L、pH7.4 NaCl                80g KH2PO4            2.4g KCl                2.0g Na2HPO4·12H2O    36.05g 或Na2HPO4        14.4g 溶于900mL去离子水后，调节pH至7.4，定容到1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 洗液：含0.05% Tween20的0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBST)。 封闭液：0.5% 聚乙烯醇或5%BSA或脱脂乳或1%的明胶 酶标二抗溶液：用PBST适当稀释辣根过氧化物酶标记二抗。 底物溶液：OPD-H2O2-磷酸盐缓冲液 A液(0.1mol/L柠檬酸)：柠檬酸19.2g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 B液(0.2mol/L Na2HPO4溶液)：Na2HPO4·12H2O 71.6g加去离子水至1L。15磅高压灭菌20min后，室温贮藏。 10ml底物液：取A液2.43m1, B液2.57mL，去离子水5mL，加OPD 4mg充分混匀溶解。加入15μL 30%H2O2后，配好后即刻使用。 终止液(2mol/L H2SO4)：把109mL浓硫酸缓慢加入891mL去离子水中，边加边不断搅拌，以利于散热。 2.1.4 主要仪器 酶标仪                    Stat Fax-2100  Awareness Technology,Inc. 微量高速台式离心机    TG16-W    长沙湘仪离心机仪器有限公司 多管架自动平衡离心机    TDES-WS    长沙湘仪离心机仪器有限公司 高速冷冻离心机    H2050R    长沙湘仪离心机仪器有限公司 单人双面净化工作台    SW-CJ-1F    苏州净化设备有限公司 电热恒温培养箱    HPP-9272    北京东联哈尔仪器制造有限公司 台式恒温振荡器    THZ-320    上海精宏实验设备有限公司 电热恒温干燥箱    202型    北京市永光明医疗仪器厂 紫外可见分光光度计        UV2800      上海尤尼科仪器有限公司 分光光度计    722S    上海精密科学仪器有限公司 电子天平    JA1003    上海上天精密仪器有限公司 万用电炉                  DL-1型      北京中兴伟业仪器有限公司 手提式压力蒸汽消毒器    GMSX-280    北京市永光明医疗仪器厂 恒温水浴锅    HH-S    江苏金坛市亿通电子有限公司 艾科普超纯水制备系统      AWL-1002-U  艾科普仪器有限公司 数控超声波清洗器          KQ-500DE    昆山市超声仪器有限公司 雪花制冰机    FM50    北京长流科学仪器公司 海尔冰箱    BCD-239SK DE  青岛海尔股份有限公司 2.2 实验方法 2.2.1培养基的配制 （1）牛肉膏蛋白胨液体培养基： 牛肉膏          5g 蛋白胨          10g Nacl            5g 以上试剂加入950mL去离子水，定容到1000mL，121℃高压灭菌20 min，室温保存备用。 （2）牛肉膏蛋白胨固体培养基：加琼脂15g于1000mL牛肉高蛋白胨液体培养基中，121℃高压灭菌20 min，冷却至50℃左右，倒平板，37℃无菌检验后，4℃贮存备用。 2.2.2菌体的获得 （1）菌体的活化 在37℃下对保藏菌株活化半小时，然后采用牛肉膏蛋白胨固体培养基划线培养18 h； （2）增菌 用2倍体积无菌水于无菌区小心洗下生长良好的菌苔，然后转接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养（200r/min）18小时。 （3）收获菌体 将所得含菌培养基分装离心(3500r/min，15min)，离心所得沉淀称湿重，收集后置 4 ℃保存。 2.2.3 LPS粗品的制备 （1）菌体破碎 细菌收集物按每 1g 细菌加 3 mL蒸馏水进行充分悬浮。之后将细菌悬浮液放入水浴锅中70℃水浴3min，然后取出菌悬液放入提前制备好的碎冰中冰浴3min。如此反复冻融 4 次。 （2）LPS制备 采用热酚水法制备[20]。按每 250mL 菌液加等量的45%酚水作用 5min。再加等量的95%的酚水混合液，在水浴68℃中不断搅拌，作用 20～30min，取出。在冷水浴中冷却到 10℃左右，然后以5000 r/min离心 45min，离心后溶液分三层，从上到下依次为水层、酚层、不溶层。上层水相含LPS，中层为变性蛋白，下层为沉淀；小心吸取上层水相，下层沉淀重复上述步骤反复提取2 次。 将几次所得水层溶液混在一起装入透析袋，放入烧杯中，自来水流水透析 48h，透析袋中浑浊溶液变透明，然后用蒸馏水静置透析2d，每天换水4次。最后，按每100mL溶液加入聚乙二醇 6000 固体4g，浓缩LPS溶液为原来体积的 1/4，即得粗品LPS。 2.2.4 LPS的纯化 按每1ml溶液精确称取 DNase I和 RNase A各50μg计算，将称好的DNase I和 RNase A加入浓缩后的粗品LPS中，37℃下酶解4h。然后在水浴锅中100℃水浴加热10min，使酶变性，取出冷却至室温后离心(1500r/min，30min)，弃沉淀，保留上清液，于上清中加2倍体积丙酮，过夜沉淀[21]。第二天可见絮状沉淀，小心离心（200 r/min，2min），弃去上清，即可获得纯化 LPS。 2.2.5 LPS某些物质含量的测定 （1）核酸含量检测 紫外光谱(260nm)吸收检测。分别于DNase I和 RNase A酶解前和酶解后测出其中的核酸含量，以便对比即可。 （2）蛋白含量检测 可见光谱（595nm）吸收检测[22]。 ①取 100mg/L 标准蛋白溶液，分别吸取0，0.2，0. 4，0. 8，1.0 mL等，然后用蒸馏水补足到 1mL ，再从所配制各管中吸取0.1mL，分别放入10mL带塞试管中，分别加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 吸光度，以牛血清蛋白为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 ② 测定蛋白含量 吸取0.1mL LPS 加入带塞试管中，加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，放置2min后，以标准曲线1号管伟空白，在595nm波长下比色，记录吸光度。 （3）多糖含量测定 可见光谱（620nm）吸收检测[23]。 ① 取100mg/L 葡萄糖溶液，分别吸取0. 05，0.1，0.2，0.4 和 0.8 mL等，然后用蒸馏水补足到 1mL，再加入 3mL 蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待每只试管均加完后，一起浸入沸水浴中维持10 min，取出，用自来水冲冷，在室温中平衡10min左右，再用 722S 型分光光度计 620nm 测定，然后用蒸馏水为空白进行比色，记录吸光度，绘制标准曲线.； ② 测定糖含量 吸取1mL LPS加入3mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，然后浸入沸水浴中维持 10min，取出用自来水冲冷，在室温中平衡10min 左右，再用722S 型分光光度计620nm测定，用蒸馏水为空白进行比色，记录吸光度。 2.2.6 O-SP制备 将LPS沉淀溶于5mL 1.5%的醋酸溶液中，于水浴锅中100℃水浴30min，离心(1500r/min，10min)，弃沉淀(类脂)，上清置于透析袋中，于4℃下透析24h去酸，最后加入聚乙二醇6000浓缩得O-SP抗原[24]，分装于离心管中备用。 由于免疫鸡所用抗体免疫剂量需要在100μg/mL以上[25]，因此制备O-SP时要注意浓度的配制。本实验将所得溶液浓缩一倍之后所得免疫剂量可用。 2.2.7 免疫与采血 免疫采取颈部四点免疫法。准备好酒精棉球，干棉球及注射器等后可进行免疫。吸取1mL LPS，于鸡颈部分四点进行皮下免疫。一周后进行第二次免疫，免疫方法同上，但免疫之前需要先从鸡翅膀静脉处采血，采集1mL即可。共免疫三次，采血三次。 试验分对照组与试验组，对照组按同样饲养条件饲喂即可，试验组进行LPS免疫。 2.2.8 血清分离 每次采血之后，首先在37℃静置1h，然后置于4℃冰箱中放置2h，再取出血样离心（6000r/min）8min，反复三次，直至出现淡黄色血清。收集保存于-20℃冰箱中备用。 2.2.9抗体效价的测定[26] 用包被液CBS稀释包被抗原至20μg/mL，酶标板中每孔加入50μL，留下三孔分别设阳性、阴性、空白对照。湿盒内室温过夜包被。弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。再在每孔加封闭液（1% BSA）250μL，置于 37℃恒温培养箱中封闭2h。用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。 结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔加50μL，要设立阴性对照，置于37℃恒温培养箱中孵育1.5h。洗涤方法同上。结合二抗：每孔加入用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP 50μL，置于37℃恒温培养箱中孵育1.5h。洗涤方法同上。 显色：每孔加底物溶液（OPD）50μL ，置室温暗盒内显色10min。待显色后，每孔加入50μL终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。 最后使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平[27]。 第3章 结果与讨论 3.1 结果 3.1.1 LPS核酸的检测 经分光光度计测定，未经酶解的粗制LPS于260nm处有强吸收，经酶解处理分离纯化的LPS，于260nm处吸收值较小。 3.1.2 LPS蛋白含量测定 经分光光度计测得BSA标准曲线（见图3-1），从标准曲线得出其蛋白含量与吸光度关系式为： y = 1.8832x - 0.0198 而测得LPS的OD值为0.324，因此，LPS蛋白含量为0.59 μg/mL。 图3-1 BSA标准曲线 Fig 3-1 standard curve of BSA 3.1.3 LPS糖含量测定 经分光光度计测得葡萄糖标准曲线（见图3-2），从标准曲线得出其糖含量与吸光度关系式为： y = 85.439x - 1.7919 而测得LPS糖含量吸光度为0.732，因此，LPS糖含量为60.75 μg/mL。 图3-2 葡萄糖标准曲线 Fig 3-2 Standard curve of glucose 3.1.4提取的LPS免疫原性检测 经过酶标仪检测，得出抗体效价数据（表3-1和图3-3）。 组别 对照鸡 试验鸡 492nm OD值 一免 二免 三免 一免 二免 三免 0.367 0.371 0.375 0.365 0.372 0.378               表3-1  酶标仪所测OD值 Table 3-1 The OD value detected by ELISA reader 图3-3 酶标仪所测OD492值 Fig 3-3 The OD value detected by ELISA reader 由表3-1和图3-3可以看出，经三次免疫后实验组鸡和对照组鸡抗体水平均有所上升，但无论是一免、二免还是三免，两组抗体效价均无明显差异，因此本实验制备的LPS可能并未诱导机体产生有效的体液免疫应答。 3.2 讨论 对于菌体脂多糖的纯化制备，凝胶过滤及疏水作用色谱等方法虽有其优越性，但经典的LPS提取方法——热酚水法仍不失为一种简便、快速且易被大多数实验室采用的提取方法。脂多糖上的类脂A部分疏水，O-特异性多糖侧链亲水，故LPS、核酸及一些糖类等溶于水相，而大部分蛋白质由于酚变性沉淀去除，酶解除去核酸，经离心沉淀等步骤后，实现了LPS的分离纯化。本文应用此法提纯的脂多糖抗原，产率较高(约0.5%)，纯度较好。 在测定脂多糖蛋白质和糖含量的过程我们与李肇增等人提取鸡白痢沙门氏菌脂多糖的方法进行了比较，测得其蛋白质含量一致，多糖含量有所差异，笔者认为可能与菌种有关或与检测方法不同有关，还需要进一步证实， 而本方法不需超声波细菌裂解仪等特殊设备，便于基层推广应用。 热酚水法提取过程中核酸的去除，应用超速离心方法实验设备要求高，去除效率低，残留的核酸片断可干扰LPS的免疫原性，而酶解处理能较好地去除溶于水相中的核酸。引入的核酸酶经100℃煮沸10min变性后，离心沉降即可去除。这样提高了LPS的纯度，为下一步建立ELISA 方法准备了条件，排除了检测时的非特异性吸附，不影响检测的结果。 提纯的 LPS液测得含有少量蛋白质，笔者认为不会影响以后建立ELISA方法的检测, 因为在提纯过程中，酚等作用已破坏了其结构，失去了原有的功能，其影响也降到最小程度。 结果表明，经热酚水法提取纯化LPS方法简便、可靠，由此获得的LPS抗原及O-PS抗原，纯度较高。 然而，经三周免疫之后，所测得的对照组与试验组OD值相近，虽然试验组一免、二免、三免均比对照组高，但是均无明显差别，并不能说明试验鸡产生抗体，可能原因如下： 一、免疫鸡在饲养过程中均出现腹泻症状，怀疑大肠杆菌感染，影响了其免疫系统，因此可能没有产生针对沙门氏菌LPS的抗体。 二、试验中96 孔酶标板是作为快速检验的固相载体, 其对包被抗原的吸附性能是ELISA试验的关键之一, 吸附性能的好坏直接影响试验的敏感性。对于酶标板来说，为聚乙烯材料，对于蛋白质具有较好的非极性吸附，而LPS为多糖，属于极性，更加难以吸附，所以很有可能抗原包被不成功，导致测得数据呈现表3-1所示。 经文献查阅，得出了包被的准确方法。在包被过程中，采用LPS和聚赖氨酸作用，使其表面带上一层阳性电荷的分子，增加吸附作用，有望解决其解吸附作用。 三、在制备血清时，由于之前采集血清收集时没有贴壁注入离心管，而离心时由于对转速设置不当，导致溶血发生，血清呈现红色，影响抗体效价的测定。 四、酶标抗体与样品作用时间对试验也有影响，而本次试验并没有设置时间梯度，只是参考经验值进行试验，应当设置时间梯度，加入底物后作用不同时间，观察OD值变化情况，选择使P/N值最大的时间为最佳反应时间。 五、ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。该试验采用手工洗板，孔与孔之间液体易交叉，洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，可能拍板过猛，抗原抗体复合物脱离。 六、显色所用底物是邻苯二胺（OPD）见光分解，配制显色液时于光下称取OPD，且4mg是微量不易称量而使其曝光时间过长；另外配制所用的瓶子是透明的，可能因为底物OPD分解而使试验结果不佳。 第4章 结论 1．采用热酚水法，从鸡白痢沙门氏菌成功提取了LPS，并通过DNase I和RNase A对LPS溶液进行了纯化，最终LPS产率约为0.5%，并通过酸去除了类脂得到O-SP。 2．采用BSA标准曲线法、葡萄糖标准曲线法分别测出了LPS中蛋白含量和多糖含量为0.59 μg/mL和60.75 μg/mL。 3．从数据中不能得出抗体效价，也不能确定试验鸡产生了抗体。 参考文献 [1] 唐桂运, 武华主译. 禽病原分离鉴定实验室手册. 第3版. 北京: 北京农业大学出版社, 1993:154-155. 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Carlson, etc. The type and yield of lipopolysaccharide from symbiotically deficient Rhizobium lipopolysaccharide mutants vary depending on the extraction method.  Glycobiology, 2000 (10), 1013-1023. 致 谢 本论文是在导师宫强老师的悉心指导和严格要求下完成的，从论文的选题、研究方案的制订、试验研究到论文的撰写，每个环节，老师都倾注了大量的心血，使我得以在熟练掌握各项试验技能的基础上顺利地完成毕业设计。导师严谨的治学态度，科学的求实精神，忘我的工作态度将始终影响着我。在此，谨向尊敬的导师致以深深的谢意! 另外在此次毕业设计过程中，我还得到了各方面的支持和帮助。非常感谢食品与生物工程学院生物化学与分子生物学实验室的宗留香老师为我做试验提供的仪器设备。另外，还要感谢学校给了我这次毕业设计的机会，增强了我的动手能力，为我将来进一步深造奠定了基础。 再次向所有关心和帮助过我的老师、同学致以最诚挚的谢意。 外文资料译文 应用超临界二氧化碳提取沙门氏菌亚种PCM 2266脂多糖(LPS) 摘 要 本文提出一种新颖的提取沙门氏菌亚种脂多糖(LPS)的方法。Enterica(PCM2266)。利用交互式部分试验设计对大量细菌中LPS提取工艺进行参数优化，即对温度、CO2流量、压力和共溶剂成分四个参数进行分析。在提取时保持高二氧化碳流量（10g/min）、高温 (90℃)和以纯净水为共溶剂剂，可以达到最佳自然提取量。在所进行的研究范围内，压力没有统计上显著的影响，然而其他因素则与产量关。通过scCO2提取的LPS获取量大约为3.3%的生物量，而经典的提取方法产量小于2%。所有的经典提取方法都以SDS-PAGE， 硫代巴比妥酸反应谱分析，GLC-MS分析为特点。 关键词：脂多糖(LPS)，超临界二氧化碳，沙门氏菌，疫苗 1. 概述　 脂多糖（LPS），也称为类毒素，是革兰氏阴性菌外膜不可分割的组成部分和最丰富的组成成分。两性的LPS分子由亲水的多糖部分和疏水的脂质部分组成。光滑型脂多糖，拥有一条长的多糖链，它存在于大多数野生型革兰氏阴性菌中。对于一些突变菌株，深度粗糙型LPS菌株可以有一个很短的二糖部分[1]。光滑型LPS分子主要可以分为三个区域：脂质A、核心寡糖和O特异性多糖。脂质A是通过ketosidic与3-脱氧基-D-甘露糖-辛酮糖酸(Kdo)残基相连而连接在LPS的糖类部分上。这个O特异性多糖部分是由8个亚单位的单糖残基组成的低聚糖所构成，它是在LPS合成的末期而添加上的。Kdo残基可以有不同的取代基团，例如，Kdo、磷酸盐、根酸、庚糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、乳糖，4-氨基-4-脱氧基-l-阿拉伯糖 和 甘氨酸，这个部位的取代基都是酸不稳定的[1, 2]。研究LPS生物活性时，LPS的提取是通过利用有机溶剂分离的经典方法。经典方法提取LPS包括利用热酚水法 (PW)[3]，或使用由苯酚、氯仿、石油醚(PCP)组成的混合溶剂从大量生物体中获得[4]。这两种方法都是基于破坏细菌细胞膜及利用苯酚析出蛋白质，但他们具有不同的选择性。热酚水法提取光滑型(S)和粗糙型(R)的LPS，而为PCP法主要分离粗糙型LPS。 Darveau 和 Hancock采用了更少见的方法[5]，用机械方法破坏细菌的细胞，然后利用酶处理，加入SDS或/和EDTA，对提取LPS两种类型(R和S)同样有效。其他几个可供选择的方法是采用多种有机溶剂，如盐，酸或碱，配合剂或酶，这些都被介绍过[6, 7]。 所介绍的这些方法对于实验室规模是非常有用的，但是扩大提取是很困难的。这么多的步骤十分费劲，它还会残存有机溶剂、制造毒废物，以至最终产品可能被溶剂残留物所污染。目前，LPS制剂有越来越多的市场需求，它们需要不含有毒杂质，例如用作免疫学研究或作为疫苗佐剂一种有价值的源泉。温和的和单步程序制备纯化内部核心抗原决定簇具有特定的免疫决定子粗糙型LPS菌类将是非常重要的，例如脑膜炎球菌[8]。 超临界流体二氧化碳（scCO2）是有害易燃的有机溶剂的安全替代物。通过压力和温度以及添加少量极性的选择性共溶剂来改变scCO2溶剂属性如密度或疏水性是相对简单的。这种提取方法能适应特定的用户需求，例如提取高疏水性或高极性物质。 文章介绍了一种利用scCO2和水提取LPS新的方法。 2．材料和方法 2.1 化学试剂  2-酮基-3-脱氧基-辛酮糖酸(Kdo)的铵盐，在我们之前的工作中用到[9]，由Rene Roy教授赠送。DNA寡核苷酸(24bp)、Folin-Ciocalteu试剂、溴酚兰， 硫代巴比妥酸(TBA)和鼠伤寒沙门氏菌中的脂多糖(LPS)。所有其他的化学物质均为分析纯。实验所有步骤均使用超纯水。用于提取的CO2(≥99.998%) 为AGA Gas生产。　 2.2 菌株的生长和条件 沙门氏菌亚种菌株 (PCM 2266，Rc-PCM 2263和Ra-PCM 2260)从波兰微生物收藏所(PCM)获得。细菌生长在200mL(E600 = 0.8)在10l烧瓶充满31营养培养基中。培养是在37℃，150rpm旋转搅动24h，通过离心(6000×g，20min，4℃)获得菌体，然后利用磷酸盐缓冲液冲洗两次，最后细菌冻结在液氮中，在Ninola AB设备中冷冻干燥。 2.3 PCP法提取 LPS PCP提取按Galanos和Luederitz[4]的修改进行，如下：向400mg 冻干的菌体中加入由90%的苯酚:氯仿:石油醚(4:10:16，w/v)组成的3mL混合液进行提取，同时要在37℃用力摇动5min。混合液在离心机中离心15min（3000r/pm，室温）。通过离心出现新的相。LPS颗粒被沉淀析出而溶于上层的水相。沉淀物通过离心机在室温下离心（3000r/pm）20min，然后用80%苯酚洗涤两次，用丙酮洗涤三次，最后以冷冻保藏。 2.4 利用scCO2提取LPS 2.4.1 样品前处理 每200mg冻干生物量浸泡在2mL(30mM ) 三磷酸腺苷酸钠 (STPP)，配合和蛋白质的黏合剂室温放置1h使细胞膜进行渗透释放蛋白质和LPS[10]。 2.4.2  scCO2提取LPS　　 利用匹兹堡沉淀技术有限公司(美国)SFE-2X 100F萃取体系。有关这个系统和改进方面的详细信息之前已经叙述[11]。在两层滤纸之间的预处理生物量(2.4.1)被安置在充斥着玻璃棉的提取容器(50毫升)中。按这个方法进行重复提取如表1。收集提取物进行冷冻，等待进一步分析。 表1  PCP法和scCO2法提取LPS对比 方法 冻干物质量/mg LPS/mg LPS回收率[%] scCO2 [0-6h] 200 6.7 3.3 PCP 法 400 7.4 1.8   2.4.3  LPS检测 进行粗制LPS被定量化的TBA， GLC-MS、SDS-PAGE对比试验，。TBA过程是用来量化测定 Kdo及其他脱氧核糖[12]，GLC-MS法专门用于测定Kdo[9]。 LPS提取后进行的研究用SDS-PAGE法，紧随其后的是Tsai 和Frasch [13]的银染色，电泳在恒压(100伏特)下进行2h。 使用5%的叠加和20%的解析凝胶系统模型，利用SDS-PAGE TV100(Sigma–Aldrich)。 3、结果 3.1  经典PCP法提取LPS 根据Galanos和Luederitz[4]的提取方法作为参考资料与目前发展的scCO2提取方法相比较。scCO2萃取法和经典方法结果在表1，利用scCO2萃取法提取LPS的回收率几乎是PCP法的两倍。 3.2 scCO2提取的LPS强度测试。 由细菌体提取LPS在很大程度上依赖于使用的共溶剂的极性。单独的scCO2或与15%甲醇作为共溶剂的scCO2不足以将LPS从细菌中提取出。因此，极性的共溶剂增加了15%的混合水甲醇(9:1)作为共溶剂(图1)。单独用含15%水的 scCO2提取LPS最有效。在设定各因素之前，如提取LPS的温度、提取时间都已经进行优化处理。所需的测试温度是60，75，85 90℃岁， 萃取时间为1 - 2.5h。 图1共溶剂成分的检测 提取时间1.5 h;scCO2流速（10 g/min），温度（900 C）、压力250 bar、和15%共溶剂。 每间隔30分钟进行一次测试，条件为恒压(250bar)和以混合物15%的水:甲醇(9:1)(图2)作为共溶剂。随着温度的升高和提取时间(2.5h)的延长得到了LPS最佳提取量。在耐久性试验中以1.5 h作为萃取时间，温度、压力、二氧化碳流量、共溶剂类型四个因素在其中被交互分析(表2)。我们一直在测试中保持这个提取时间，这在深入研究中也如此(图3)。根据在图2显示的结果设定了这个温度范围。当共溶剂强度试验水平最低时加入纯净水。这个组合参数检测的和LPS的提取量都显示在表2。表3总结了主要的影响因素，置信度以及置信区间[14]. 试验表明，温度和二氧化碳的流量更能影响LPS的提取。温度的重要作用与先前的观察相符合(图2)。增加压力至250 bar对LPS的提取没有显著的影响，然而共溶剂甲醇的存在对其有负面影响。耐久性试验的主要影响因素的计算原理十分简单，用统计数的最高水平(+)减去统计数的最低水平(-)。结果的差异被分为8段，因为有八项测试结果用于两个统计数(15)。 图2. LPS从细菌细胞释放的时间和温度 ScCO2流量，10g/min;压力，250 bar和15%水的共溶剂是恒定的。所有的点都意味着从复制检测。 图3. TBA对LPS提取的长期检测 10 g/min， 共溶剂-15%水，萃取条件:流动的二氧化碳;压力，200 bar; 温度90℃;时间为6h。 表2 LPS的提取量 3.3 在选定的条件下延长萃取的效果 大量细菌LPS提取的时间、温度显示在图2。对于超临界流体萃取技术，你可以看到，这个提取LPS的时间高达2.5h。因此，我们还在提取中测试时间因素，将其延长到6h(图3)。3h之后，获得了3.8mgLPS，即2%的生物量被利用，而6h后则提取了6.7mg LPS (3.3%的生物量，表1).比较在TBA试验中A548 / A534吸收率表明， 1.5 - 3.0h之间收获的LPS较纯，而在这个范围之外则含有其他的杂质，如脱氧核糖。 3.4 分离的表征 通过TBA检测LPS的提取量 [12]，在TBA试验中发色基团与Kdo反应所引起的UV-吸收在548nm最大，而包含脱氧核糖的化合物在534nm有最大吸收值。 如图4所示，利用TBA检测时，PCP法分离的Kdo或LPS拥有几乎相同的光谱，都在548nm由最大吸收，然而由于DNA中脱氧核糖的影响，在1.5 h后由scCO2提取的LPS在520–540nm具有额外的肩峰。提取物中Kdo的存在，也通过使用GLC-MS法证实[9]。GLC-MS法测定的提取物中LPS的含量与TBA检测的结果相同。图5给出了SDS-PAGE银染色分离不同LPS的结果。一个典型的阶梯模式，第一道为沙门伤寒杆菌LPS光滑菌株LPS的特点，这反映了涂片中黑暗的杂质O-抗原[2]的存在。第2 – 6道表示由各种长度的核心低聚糖的粗糙型沙门菌的LPS。对经典的PCP法提取的PCM 2260 RaLPS (第2道)、Re LPS (第3道)、Rc LPS (第5道)和scCO2法提取的PCM 2260Re LPS (第4和6道)进行了比较，结果表明:在3、4、6道的LPS提取来自相同部分(2266)，被PCP法分离的(第3道)和scCO2法分离的(第4道和第6道)， 显示了高度的可变性。 图4.不同物质的光谱监测比较 ( ) 2-脱氧核糖, (3μg); ( ) Kdo 分离物 (6μg); ( ) 利用scCO2 从PCM 2266菌株中分离的 LPS (25μg, 1.5h, Fig. 3); (x) DNA-寡核苷酸 (24μg); ( )利用scCO2 从PCM 2266菌株中分离的 LPS (30μg). 图5. scCO2法与 PCP法提取沙门氏菌的LPS采用SDS-PAGE分析后的比较。 第1道，(6μg) S.typhimurium的光滑菌落;第2道，(0.5μg)PCP法提取S. entericasubsp. enterica Ra PCM 2260的LPS;第3道，(0.5μg) PCP法提取S. entericasubsp. enterica Re PCM 2266;第4道，(15μg)scCO2法提取 S. enter-ica subsp. enterica Re PCM 2266的LPS (1.5 h，图3);第5道， (0.5μg)PCP法提取S. enterica subsp. Rc PCM 22636的LPS，第6道，(15μg)scCO2 法提取Re PCM 2266 的LPS(2.25h，图3)。 第4道为scCO2法分离LPS 1.5 h后的结果，而第6道为2.25 h之后的结果(图3)。PCP法(第3道) 的结果不存在第4道显示的杂质拖尾效应，2.25h后 scCO2萃取法(图5，第6道)标准样品有更少的拖尾效应。 4 讨论 利用LPS在疫苗生产中作为抗原已经被许多作者进行研究。这个要求保持LPS的纯度和完整性。所有的文献中描述的方法步骤为多级提取，通过利用有机溶剂，但会制造有毒废料。使用scCO2法从微生物提取LPS先前没有被报道过。目前这项工作的方法已成功地用于分离的粗糙型沙门氏菌亚种LPS。之前要用STTP螯合剂对PCM 2266菌株进行预处理。 选择粗糙变异株是基于它是所有已知类型LPS中最狂犬病的。螯合剂STPP[10]预处理后，LPS复合物从沙门氏菌细胞壁蛋白质释放，但其中只有少量的LPS从细菌中释放， 与PCP法预处理只获得5%左右的量相应 (2.3部分)。 表3显示的结果表明新型的scCO2法通过延长萃取时间，使LPS的产量较传统方法产量更高[11，16]。SDS–PAGE分析(图5，第3、4和6道)显示两者有相似的分离度。然而，通过scCO2法提取的LPS (1.5 h萃取、图3)银染法第4道(图5)表现出拖尾效应。 在传统方法中提取LPS时所发现的杂质是核酸[17]。经过scCO2的处理，在250 - 260nm核酸具有较高的吸光值。如上面所提到的，由scCO2法提取的LPS经过TBA处理后在532nm有最大吸收(图4)，表明了脱氧核糖 (发现于DNA) 的存在。测试中对样品进行了琼脂电泳染色，用DNA溴代物作为参考。不幸的是，我们还没有发现任何DNA样的分子。为了检查核酸片段的大小，材料Microsep(3.5ml过滤和1kDacut-offrange过滤装置)大多数的化合物吸收250-260nm阴离子荧光素分子的过滤。 在第2个(2.25 h)和第3个小时，萃取过程中产生的发色基团在548/534nm有最大吸收率，说明有低程度的污染(图3)，这部分和SDS-PAGE分析(图5，第6道) 相匹配。在SDS-PAGE，2.25h后scCO2法从样品中提取的LPS(图3)与PCP法(图5，第3和6道)提取的量很相似，回收了大约1.5倍。 由于本方法只使用scCO2和水，因此它是环境友好型的。 Kdo残留物可以有不同的替代品，并且是对酸不稳定的[2]。为了防止由于pH变化引起其属性的变化，在水、scCO2混合液中加入 boronate缓冲液(2525mM，pH 7.4)来检测共溶剂(19)。然而，boronate并未提高产量和纯洁度。 也许，对酸不稳定的替代品的退化将应用单克隆抗体对完整的生物进行免疫检测。这将在未来进行。 本文描述的提取粗糙型菌株的LPS的条件也适用于从沙门氏菌提取半粗糙型LPS，在不久的将来可以直接用于向商业和治疗[20]。 致谢 这项研究是由项目和网络支持合作基金和Visby大学合作，瑞典中央东欧和那里的波兰国家委员会搜索资助科研3号P04A 014 23的资助。作者特别感谢Rene Roy教授 (渥太华大学化学系)所赠送的合成Kdo铵盐和Simon Gough对本稿的斧正。