动物医学本科毕业论文 高牧11-5王乐乐

河南农业职业学院 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 题目：    鹅血清及卵黄中IgG的测定      学生姓名：          王乐乐                   学号：            110580                          专业年级：        高牧11-5          2013年 4月  22日 目  录 鹅血清及卵黄中IgG的测定 学    生：赵冬冬 专    业：畜禽生产教育 2004级 指导教师：郎仲武 摘要：免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，简称IgG）指具有抗体活性的动物蛋白。在禽类，母代可以通过卵子将自身的免疫球蛋白传递给子代，对子代起到保护作用[20]。本试验应用ELISA对102枚吉林白鹅种蛋进行检测，检测项目为鹅胚发育过程卵黄中IgG和鹅胚血清中IgG的含量。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，鹅胚血清中和卵黄中IgG含量是，14.5日龄为0.1717μg/mL和3967.62μg/mL，34.5日龄（出壳3.5天）日龄为1495.6413μg/mL和2821.363μg/mL。 关键词：鹅;免疫球蛋白G;ELISA 1  前  言 卵黄抗体即卵黄免疫球蛋白就是卵黄中的γ—卵黄球蛋白，由于其蛋白质的物理化学性质、免疫学性质等方面与哺乳动物免疫球蛋白存在一定差异[1，2]，所以在免疫学领域把由禽卵黄中获得的抗体称为卵黄免疫球蛋白(Immunoglobulin of Yolk，简称IgY)[3]。IgY的用途是非常广泛、多样的，其中最重要的功能是由母体传递IgY给新生儿提供被动地免疫保护力。IgY普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物IgG，但其许多生物学性质仍未被发现。 免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是指免疫系统受抗原刺激后,B细胞转化为浆细胞而产生的具有抗体活性,能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白,或指化学结构与抗体相似的球蛋白。它广泛存在于机体的血清、体液及粘膜分泌液中,是构成机体体液免疫的主要物质，免疫球蛋白分为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE[4，5]。禽类已确证的免疫球蛋白有三种：即IgG（IgY）、IgM和IgA[6]。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，约占动物血浆丙种球蛋白的70%，分子量约15万，含糖2～3%。IgG具有提高免疫力、增强机体抵抗力等作用。目前国内尚没有定量检测鹅IgG的相关报道。本文应用酶联接免疫吸附剂测定法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，简称ELISA)对鹅血清及卵黄中的IgG含量进行了测定，现将结果报告如下。 2  材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 2.1  试验材料 2.1.1  试验动物 吉林白鹅种蛋购于吉林省某种鹅场 2.1.2  主要试剂 磷酸氢二钠                分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯        北京化工厂 磷酸二氢钠                分析纯        北京化工厂 牛白蛋白（生化试剂）      分析纯        上海新兴生物有限公司 氯化钠                    分析纯        北京化工厂 饱和硫酸氨Sephadex—G200    分析纯      北京鼎国生物有限公司 辣根过氧化物酶            分析纯      北京鼎国生物有限公司 鹅IgG、鼠抗鹅IgG抗体、兔抗鹅IgG酶标抗体为本实验室自制 2.1.3  仪器与设备 恒温箱、电子天平；40孔聚苯乙烯酶标反应板；XYJ80－1台式离心机 ；LD4－2A低速离心机；北京医用离心机厂；磁力搅拌器（78－1型磁力加热搅拌器）分光光度计751C型；酶联免疫检测仪DG—3022型；孵化器；冰箱；酸度计pHS-3C ；ELISA板。 2.2  实验方法 2.2.1  鹅血清IgG的提取 取健康吉林白鹅的混合血清20mL，加生理盐水20mL，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10mL，使成为20％（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30min；3000rpm离心20min，弃沉淀；在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30 mL，使成50％（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30 min；离心20 min，弃去上清；于沉淀中加入20 mL生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10 mL，使成33％（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30 min；3000 rpm离心20 min，弃去上清，以除去白蛋白，重复3次；用10mL生理盐水溶解沉淀，装入透析袋；透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次，直至完全除去SO42﹣或NH4﹢离心去沉淀；离心去沉淀（去除杂质蛋白）上清液即为粗提的IgG；将G200凝胶活化、浮选、装柱，以0.01mol∕L pH 7.4 PBS液洗脱、平衡。并向其中加入上一步中所提取的粗提的IgG样本，以PBS液洗脱，收集第二蛋白洗脱峰，浓缩即为精提IgG。 2.2.2  鹅血清及卵黄参考阴性与参考阳性的选择及制备 2.2.2.1  鹅血清参考阴性的制备 取吉林白鹅血清5份充分混合（4ml/份），取此混合液20mL，加生理盐水20mL，充分混合，逐滴加入35％饱和硫酸铵，边加边搅拌，混合均匀后静置30分钟，然后3000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀，上清装入透析袋，常水流水透析12小时，然后生理盐水透析24小时，其间换液数次。最后将提取液浓缩至原体积，重复3次。分装冻存于－20℃冰箱。 2.2.2.2  鹅血清参考阳性的制备 取吉林白鹅血清5分，混合（该血清取自制备参考阴性血清的吉林白鹅），分装冻存于－20℃冰箱。 2.2.2.3  鹅卵黄参考阴性的制备 无菌取卵黄5份，充分混合，取此混合液20mL，蒸馏水10倍稀释，用稀酸调节至PH5.2，8 000转/分钟离心。蒸馏水稀释沉淀至卵黄原体积，将卵黄、生理盐水、氯仿按1:2:2混合，混匀后置室温2h，2 000克离心力离心20min，分成三相，油相、水相、固相，弃去水相，然后将油相与固相充分混合，室温下挥发掉氯仿，蒸馏水稀释至原体积。蒸馏水稀释7倍，分装冻存与-20℃冰箱中[8]。 2.2.2.4  鹅卵黄参考阳性的制备 无菌取卵黄5份，充分混合，蒸馏水7倍稀释（该卵黄取自制备参考阴性卵黄的种蛋），分装冻存于－20℃冰箱中。 2.2.3  双抗体夹心ELISA试验各反应条件的确定 2.2.3.1  包被抗体工作浓度确定 用0.01mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液将小鼠抗鹅IgG稀释成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL分别包被酶标反应板，对鹅血清100倍稀释进行ELISA检测。 2.2.3.2  被检鹅血清的最佳稀释倍数的确定 按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后将混合鹅血清，分别用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作40、50、60、70、80、90、100、200、400倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅血清的稀释倍数作为被检鹅血清的最佳稀释倍数。 2.2.3.3  待检鹅卵黄最佳稀释倍数的确定  按包被抗原的工作浓度将抗原稀释，包被酶标板，然后将混合鹅卵黄，分别用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作4、8、10、16、20、32、64、100倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅卵黄的稀释倍数作为被检鹅血清的最佳稀释倍数。 2.2.3.4  按包被抗原的工作浓度 将抗原稀释，包被酶标板，然后分别将五份卵黄混合，分别用0.1％牛血清白蛋白的PBST液作1、2、4、8、10、16、20、32、64、100倍稀释，每个稀释度加五孔，进行ELISA检测并计算出每个稀释度的平均OD值（490nm）。选择OD值最接近于1时被检鹅卵黄的稀释倍数作为被检卵黄的最佳稀释倍数。 2.2.3.5  最适抗原包被时间的确定 分别将小鼠抗鹅IgG包被后于37℃ 3h、4℃过夜、37℃ 3h后4℃过夜，进行测定，观察结果。 2.2.3.6  最适抗原抗体反应时间的确定 将抗原抗体分别作用37℃ 60min、90 min、120min，进行测定。 2.2.3.7  最适酶标抗体作用时间的确定 酶标抗体作用时间分别为37℃ 60min、90 min、120min，进行测定。 2.2.3.8  最适底物作用时间的确定 底物反应时间分别为37℃15min、30min、45min，进行测定，观察结果。 2.2.4  阳性判定值的确定 ELISA检测方法在结果判断上是定性测定，对受检标本分别用“阳性”、“阴性”表示。根据国家流行病学调查要求，阳性OD值应为阴性4倍。 2.2.5  ELISA检测方法的检验 2.2.5.1  敏感性试验  将5份成年鹅血清的混合液以0.1％牛血清白蛋白的PBST液作50、60、70、80、90、100、200、400倍稀释，按照已建立的ELISA进行检测，测定OD值，确定鹅血清的敏感反应滴度。 2.2.5.2  重复性试验 选取数份鹅血清及鹅卵黄，按建立的ELISA进行五次检测，测定其OD值变化，观察结果。 2.2.5.3  特异性试验 以小鼠抗鹅血清包被反应板，成年鹅血清20份，与未用鹅IgG免疫的小鼠血清包被反应板对比，检测其OD值。 3  结果 3.1  鹅IgG及其抗体制备结果 鹅IgG经饱和硫酸铵法粗提后，进行Sephadex-G200层析，所获得的收集液体，用751分光光度计计算蛋白含量，根据所得的OD值（280nm）绘制曲线如下图所示： 图1 Sephodex-G200纯化鹅IgG Fig 1. Purification of goose’s IgG with SephodexG200 经Sephadex－G200纯化鹅IgG所获得的曲线图可知，第一峰和第二峰出现的间隔很小，所以在收集洗脱液时，只从第二峰左侧收集蛋白OD值大于0.25的洗脱液至第二峰右侧OD值大于0.2的洗脱液。然后将此收集液浓缩，并计算蛋白含量[9，10]。 用751分光光度计测得OD280和OD260值并按下式计算蛋白浓度，蛋白浓度(mg/mL)=(OD280×1.45-OD260×0.74) ×稀释倍数。计算鹅IgG蛋白蛋白含量为10.7318mg/mL。 3.2  双抗体夹心ELISA检测方法的建立 3.2.1  被检鹅血清参考阳性与鹅卵黄参考阴性的最佳稀释倍数的确定 表 4 被检血清的最佳稀释倍数的确定 Table 4 Determination of serum dilution 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 稀释倍数 4 8 10 16 20 32 64 100 血清平均OD值 1.31 1.26 1.27 1.26 1.24 1.16 1.10 0.98 血清参考阴性平均OD值 0.31 0.29 0.29 0.28 0.24 0.24 0.21 0.19                   由以上表可知，将血清100倍稀释时，其OD值最接近1.0，参考阴性为0.19，符合P/N＞4，因此，在检测时将血清100倍稀释。