楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112662641A(43)申请公布日2021.04.16(21)申请号202110033949.1C12P19/60(2006.01)(22)申请日2021.01.11(71)申请人山东大学地址250061山东省济南市历下区文化西路44号(72)发明人程爱霞　袁菁聪　朱婷婷　娄红祥　(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人宋海海(51)Int.Cl.C12N9/10(2006.01)C12N15/54(2006.01)C12N5/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 1页说明书14页序列表4页附图6页(54)发明名称楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用(57)摘要本发明提供一种楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用，属于基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 和酶工程技术领域。本发明利用PCR技术从cDNA获得了基因的全长序列，通过构建pET32a蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导、纯化得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明MemUGT1底物特异性强，只能够催化黄酮醇类化合物，且其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚、异鼠李素、杨梅素)类化合物的催化效率较高，产物较为专一，可用于生物合成这些化合物的3‑O糖基化产物，具有较高的经济价值和广阔的应用前景。CN112662641ACN112662641A权　利　要　求　书1/1页1.一种蛋白质MemUGT1，其特征在于，所述蛋白质MemUGT1是如下(a1)或(a2)：(a1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述MemUGT1的基因。3.如权利要求2所述基因，其特征在于，所述基因具有(b1)‑(b3)中任一所述核苷酸序列：(b1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；(b2)与(b1)互补的核苷酸序列；(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、转化细胞和/或转基因植物。5.如权利要求4所述重组表达载体、转化细胞和/或转基因植物，其特征在于，所述重组表达载体通过通过权利要求2或3所述编码基因有效地连接到表达载体上获得；所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；进一步优选为质粒；所述质粒包括pET32a和pGWB5；所述转化细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞中的任意一种或多种；其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种；进一步优选的，所述细菌细胞为大肠杆菌(包括BL21(DE3))、根癌农杆菌(包括GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌；所述真菌细胞包括酵母菌；所述转基因植物包括拟南芥植株、玉米植株、高粱植株、马铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油菜植株、油菜籽植株、大豆植株、稻植株、大麦植株或烟草植株。6.权利要求1所述蛋白质MemUGT1作为糖基转移酶的应用。7.权利要求2或3所述基因、权利要求4或5所述重组表达载体、转化细胞和/或转基因植物在制备蛋白质MemUGT1中的应用。8.扩增权利要求2或3所述基因的引物，其特征在于，所述引物核苷酸序列包括SEQ ID No.3‑SEQ ID No.8所示序列。9.权利要求1所述蛋白质MemUGT1具有如下(c1)或(c2)中的应用：(c1)催化黄酮醇类化合物3‑O糖苷化；(c2)制备黄酮醇糖苷类化合物。10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述黄酮醇类化合物包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素和杨梅素。2CN112662641A说　明　书1/14页楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用技术领域[0001]本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用。背景技术[0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。[0003]黄酮类化合物是一种广泛分布于植物界，其在植物体内通常与糖结合，小部分以游离态的形式存在，它在植物的生长、发育、开花、结果等方面起着重要的作用。黄酮类化合物也是药用植物的主要活性成分之一，现代研究表明，黄酮类天然产物具有广泛的药理功能，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及抗HIV病毒活性等。对植物来说，糖基化可以改变黄酮类化合物的生理特性和化学性质，比如提高类黄酮化合物的水溶性、生物活性、稳定性等。类黄酮化合物糖基化在植物体内是由糖基转移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)催化的，其可将糖基从活化的糖基供体转移到糖基受体化合物，并形成糖苷键。[0004]目前，黄酮糖苷类天然产物大多是从植物中分离得到，但由于提取工艺复杂，提取效率低，植物生长周期较长、成本昂贵等因素，糖苷类化合物的大规模制备受到限制，且由于糖苷化涉及区域选择性和立体选择性等原因，糖苷的化学合成产率较低。酶法合成黄酮糖苷类化合物由于糖基供体价格昂贵，也不利于大规模工业化生产。近年来随着代谢工程和合成生物学技术的发展，利用分子生物学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，构建工程微生物细胞工厂(比如大肠杆菌、酵母)，以生物质为原料进行体内糖基化可以较为经济的获得大量的UDP糖分子供体。近年来已经通过该方法合成各种类型的黄酮糖苷，拟南芥中的AtUGT73B3和AtUGT84B1在大肠杆菌中过表达，可合成槲皮素3‑O‑葡萄糖苷和槲皮素7‑O‑葡萄糖苷。筛选具有3‑O糖基化功能的UGT，并阐明它的生化性质，将其用于黄酮糖苷的合成生物学研究具有重要的意义。[0005]楔瓣地钱(Marchantia emarginata)为地钱科(Macrhantineae)苔类植物的叶状体，属于苔藓植物，多生于阴暗潮湿的地方，在世界各地均有广泛分布。我国苔藓植物资源十分丰富，已报道的约有3000多种。但迄今为止，对于楔瓣地钱这种植物资源的研究还相对较少，已有的研究多集中于楔瓣地钱中类黄酮化合物的分离提取与纯化，对催化类黄酮糖苷生成的糖基转移酶(GTs)的研究尚未报道。发明内容[0006]基于上述现有技术的不足，本发明提供一种楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用。本发明得到的来自于苔类植物楔瓣地钱的糖基转移酶，经研究发现，该酶是能够高效催化黄酮3位羟基糖基化的糖基转移酶，可用于大肠杆菌生物合成黄酮类化合物3‑O糖苷，因此具有较高的经济价值。[0007]为实现上述技术目的，本发明采用技术 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 如下：3CN112662641A说　明　书2/14页[0008]本发明的第一个方面，提供一种名为MemUGT1的蛋白质，所述名为MemUGT1的蛋白质来源于楔瓣地钱(Marchantia emarginata)。经试验验证，其具有具有催化黄酮3位羟基糖基化的功能，可用于大肠杆菌生物合成黄酮醇类化合物3‑O糖苷。[0009]其中，所述MemUGT1是如下(a1)或(a2)：[0010](a1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0011](a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同糖基转移酶功能的由其衍生的蛋白质。[0012]SEQ ID No.1由488个氨基酸残基组成。[0013]本发明的第二个方面，提供一种编码所述MemUGT1的基因。[0014]其中，所述基因具有(b1)‑(b3)中任一所述核苷酸序列：[0015](b1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；[0016](b2)与(b1)互补的核苷酸序列；[0017](b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。[0018]SEQ ID No.2由1467个核苷酸组成，其中第1‑1464为编码序列，第1465‑1467位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。[0019]本发明的第三个方面，基于上述编码基因所 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的扩增引物、含有上述编码基因的重组表达载体和/或含有上述编码基因的转化细胞、转基因植物亦在本发明的保护范围之内。[0020]其中，所述扩增引物包括SEQ ID No.3‑SEQ ID No.8所示序列。[0021]所述重组表达载体通过上述基因有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；进一步优选为质粒；所述质粒包括pET32a和pGWB5；[0022]所述转化细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞中的任意一种或多种；[0023]其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种；[0024]更具体的，所述细菌细胞为大肠杆菌(如BL21(DE3))、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。[0025]所述真菌细胞包括酵母菌。[0026]所述转基因植物包括拟南芥植株、玉米植株、高粱植株、马铃薯植株、番茄植株、小麦植株、油菜植株、油菜籽植株、大豆植株、稻植株、大麦植株或烟草植株。[0027]本发明的第四个方面，所述蛋白质MemUGT1作为糖基转移酶的应用也应在本发明的保护范围之内。[0028]本发明的第五个方面，所述编码基因、重组表达载体、转化细胞或转基因植物在制备MemUGT1中的应用也在本发明的保护范围之内。[0029]本发明的第六个方面，提供所述蛋白质MemUGT1具有如下(c1)或(c2)中的应用：4CN112662641A说　明　书3/14页[0030](c1)催化黄酮醇类化合物3‑O糖苷化；[0031](c2)制备黄酮醇糖苷类化合物。[0032]其中，所述黄酮醇类化合物包括但不限于槲皮素、山奈酚、异鼠李素和杨梅素。[0033]上述一个或多个技术方案的有益效果：[0034]上述技术方案提供的MemUGT1基因是楔瓣地钱中能够催化类黄酮类化合物糖基化的糖基转移酶，上述技术方案利用PCR技术从cDNA获得了基因的全长序列，通过构建pET32a蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导、纯化得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明MemUGT1底物特异性强，只能够催化黄酮醇类化合物，且其对黄酮醇(槲皮素、山奈酚、异鼠李素、杨梅素)类化合物的催化效率较高，产物较为专一，可用于生物合成这些化合物的3‑O糖基化产物，具有较高的经济价值和广阔的应用前景。附图说明[0035]构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。[0036]图1：目的基因MemUGT1的ORF扩增产物的电泳图。[0037]图2：MemUGT1蛋白SDS‑PAGE电泳图；[0038]其中：M:蛋白分子质量标准[0039]泳道1：MemUGT1蛋白上清；[0040]泳道2：MemUGT1蛋白纯化；[0041]图3：UDP‑葡萄糖为糖供体的条件下，重组蛋白MemUGT1的底物特异性研究。[0042]其中：Que：槲皮素；Kae：山奈酚；Myr：杨梅素；Iso：异鼠李素；Api：芹菜素；Nar：柚皮素；Lut：木犀草素；Chr：金圣草素；Gen：染料木素；Aca：金合欢素；Esc：秦皮乙素；Dai：大豆苷元；Scu：野黄芩素；其中，A为底物相对活性图；B为相关底物结构式。[0043]图4：MemUGT1酶活催化反应的HPLC图谱。反应底物分别为槲皮素、山柰酚、异鼠李素、杨梅素、芹菜素、木樨草素、金圣草素和柚皮素。其中：Q‑3‑G：槲皮素‑3‑O‑葡萄糖苷；K‑3‑G：山柰酚‑3‑O‑葡萄糖苷；M‑3‑G：杨梅素‑3‑O‑葡萄糖苷；I‑3‑G：异鼠李素‑3‑O‑葡萄糖苷。[0044]图5：MemUGT1酶活催化反应的最适pH和最适温度。以UDP‑葡萄糖作为糖基供体，杨梅素、山柰酚和槲皮素为糖基受体。其中，A中糖基受体为杨梅素，B中糖基受体为山柰酚，C中糖基受体为槲皮素。[0045]图6：在大肠杆菌U1饲喂过程中培养基种类对糖苷产量的影响。分别以槲皮素、山柰酚为底物进行大肠杆菌U1的体内饲喂，培养基种类为LB培养基、TB培养基和M9培养基。[0046]图7：在大肠杆菌U1饲喂过程中诱导剂浓度浓度对糖苷产量的影响。分别以槲皮素、山柰酚为底物进行大肠杆菌U1的体内饲喂，底物浓度梯度设定为25μM、50μM、100μM、500μM、1000μM、2000μM；其中，A中底物为山柰酚，B中底物为槲皮素。[0047]图8：在大肠杆菌U1饲喂过程中底物浓度对糖苷产量的影响。分别以槲皮素、山柰酚为底物进行大肠杆菌U1的体内饲喂，底物浓度梯度设定为50μM、75μM、100μM、125μM、150μM、400μM；其中，A中底物为山柰酚，B中底物为槲皮素。[0048]图9：MemUGT1基因在拟南芥中的过表达及转基因拟南芥中黄酮醇糖苷含量分析。5CN112662641A说　明　书4/14页[0049]A：RT‑PCR分析表明，MemUGT1在选定的转基因品系中转录；AtActin被用作参考序列。B：通过HPLC分析在拟南芥幼苗的甲醇提取物中山奈酚糖苷的含量。C：HPLC‑MS图谱。具体实施方式[0050]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。[0051]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人《，分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0052]为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。[0053]实施例1.表达基因MemUGT1的克隆[0054]1.1 CTAB‑PVP法提取楔瓣地钱的总RNA[0055](1)取温室中生长两个月的楔瓣地钱的植物叶状体，清洗干净后用液氮速冻，之后置于研钵中研磨至材料成粉末状。[0056](2)取适量植物粉末至提前预冷的2mL进口离心管中，加800μl 65℃预热的CTAB‑PVP提取液，上下颠倒混匀。[0057]上述CTAB‑PVP提取缓冲液配制方法如下：[0058]100mM Tris·HCl(pH 8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；溶液配置用DEPC处理过的ddH2O，高压灭菌后备用。[0059](3)65℃水浴30min，每隔6‑10min颠倒混匀一次。[0060](4)冷却后加入600μl氯仿，混匀；4℃13,000rpm离心10min。[0061](5)取上清水相转至新1.5mL的离心管，加入800μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。[0062](6)重复上步(即用氯仿抽提三次)。[0063](7)吸取上清转至已预冷好的新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，‑20℃静置3h以上(或4℃静置过夜，若发现结冰现象，需要补加8M的LiCl)。[0064](8)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。[0065](9)加入700μl 75％乙醇洗涤沉淀2‑3次。离心弃上清后挥干剩余乙醇。[0066](10)加入30μl Proteinase K处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量。[0067]1.2 MemUGT1基因全长扩增6CN112662641A说　明　书5/14页[0068]1.2.1引物设计[0069]利用软件Bioxm 2.6找出MemUGT1的ORF(Open Reading Frame)。在ORF两侧的非编码区设计全长引物MemUGT1‑F/R对基因进行扩增；[0070]全长引物：[0071]MemUGT1‑F:GTATGTCCGTCAATCTGCTG；(SEQ ID No.3)[0072]MemUGT1‑R:TCTTCTCTACAGGGGATAAT；(SEQ ID No.4)[0073]1.2.2 cDNA合成[0074]以提取的楔瓣地钱的总RNA为模板，以PrimerScript RT Master Mix逆转录体系通过PCR技术获得cDNA模板链。[0075]逆转录体系及逆转录程序如下：[0076](1)除基因组DNA[0077][0078]将上述各组分加入进口PCR管中，轻轻混匀后于42℃水浴5min。[0079](2)逆转录PCR[0080][0081][0082]在PCR仪中的逆转录程序为：37℃,15min；85℃变性15s，4℃保温。[0083]逆转录产物保存于‑20℃，使用前稀释10倍。[0084]1.2.3目的基因扩增[0085]以稀释的逆转录的楔瓣地钱cDNA为模板，以MemUGT1‑F/R分别为引物进行扩增。[0086]扩增体系及扩增程序如下：[0087][0088]将以上组分加入200μL的PCR管中混合均匀，PCR按以下程序进行扩增：94℃预变性7CN112662641A说　明　书6/14页3min；94℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。[0089]将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将目的大小条带切胶回收，方法如下。[0090]将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1.4％，W/V，g/100ml)，并用TIANGEN胶回收试剂盒回收目的片段。步骤如下：[0091](1)将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，经溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色5min，于紫外灯下快速切下含有目的大小条带的胶块，放入1.5mL离心管回收待用。[0092](2)加入200μL溶液PC，于55℃水浴溶解胶块。期间每隔2‑3min颠倒震荡离心管使之充分溶解。[0093](3)将吸附柱CB2置于2mL的收集管中，将上述溶胶液转移至吸附柱CB2，12,000rpm离心1min，弃掉收集管中的滤液。[0094](4)向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW。12,000rpm离心1min，弃掉滤液。[0095](5)重复操作步骤(4)。[0096](6)弃掉滤液，将吸附柱CB2室温12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。[0097](7)将吸附柱CB2置于新的1.5mL离心管中，开盖放置至乙醇挥干。在柱子膜中央加入30μL ddH2O，室温静置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液立即使用或‑20℃保存。[0098]1.3目的片段平端载体连接[0099]将上述胶回收产物片段按照以下反应体系连接到平端载体pTOPO：[0100][0101]将上述反应体系混匀放于PCR仪中25℃反应5分钟后，将最终产物进行大肠杆菌DH5α转化。[0102]1.4转化[0103]将上述5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。转化方法如下：‑80℃保存的大肠杆菌DH5α感受态细胞(50μL)取出后置于冰上解冻，加入5μL连接产物，轻轻吹打混匀，冰上静置30min；42℃水浴中热击90s后迅速置于冰上2min，加入600μL无抗LB培养基后于37℃培养箱振荡培养1h迅速繁殖，取200μL转化液涂于LB固体培养基(含100μg/mL氨苄抗性)上，37℃静置培养12h。[0104]LB培养基组分(1L)：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g，加水溶解后定容至1L。固体培养基加入琼脂(12g/L)后，高压蒸汽灭菌。[0105]1.5重组子阳性克隆鉴定[0106]随机挑选5个单克隆于200μL LB培养基，37℃振荡培养4h。以M13F/R为引物，菌液为模板进行菌落PCR。体系如下：8CN112662641A说　明　书7/14页[0107][0108]扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环；72℃延伸10min；[0109]菌落PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，能扩增出目的大小条带的为阳性单克隆，将条带大小合适的阳性克隆送测序。测序成功的阳性克隆存菌：930μL菌液加70μL DMSO，混合均匀后于‑80℃保存。[0110]实施例2.基因蛋白表达及酶活功能分析[0111]2.1提取MemUGT1‑pTOPO质粒[0112]用质粒小量提取试剂盒(TIANGEN)提取质粒：[0113](1)将所存菌株MemUGT1‑pTOPO‑DH5α分别划LB板(含100μg/mL Amp)，37℃，12h后长出单克隆，挑取单克隆于4mL含Amp抗性的培养基中，37℃，110rpm培养10h。[0114](2)取菌液室温12,000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，尽可能倒掉上清。[0115](3)向留有菌体沉淀的离心管中加入150μL溶液P1，涡旋振荡至菌体完全悬浮。[0116](4)向离心管中加入150μL溶液P2，温和的上下翻转6‑8次使菌体充分裂解。[0117](5)向离心管中加入350μL溶液P5，立即快速的上下颠倒混匀，此时将出现絮状沉淀。静置2min后，12,000rpm离心5min。[0118](6)将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3(吸附柱放入收集管中)。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。[0119](7)向吸附柱CP3中加入300μL漂洗液PWT，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。[0120](8)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。[0121](9)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，挥干乙醇后，向吸附膜的中间部分悬空滴加30‑50μL蒸馏水，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。[0122]2.2扩增MemUGT1的ORF[0123]以构建的阳性单克隆质粒为模板，分别用带限制性内切酶酶切位点的引物对MemUGT1‑pET32a‑F/R及PrimerSTAR Max DNA聚合酶扩增MemUGT1的ORF。[0124]MemUGT1‑pET32a‑F:CGGGATCCATGGAGGGAGAAGTTGCAGG；(SEQ ID No.5)[0125]MemUGT1‑pET32a‑R:ACGCGTCGACCTATGTACAGTTCATATCCT；(SEQ ID No.6)[0126]以MemUGT1‑pTOPO质粒为模板，用上述引物扩增其ORF，扩增程序为：94℃预变性9CN112662641A说　明　书8/14页3min；94℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸10min。[0127]PCR产物经凝胶电泳分离后，按胶回收试剂盒对片段进行胶回收。(结果见图1)[0128]2.3酶切[0129]载体pET32a及MemUGT1胶回收片段分别用BamHI与SalI进行酶切，酶切体系如下：[0130][0131]酶切在37℃水浴进行，反应3h。酶切产物加10×Loading buffer终止反应后进行琼脂糖凝胶电泳并选择合适的条带进行胶回收，胶回收方法同上。[0132]2.4连接、转化及阳性验证[0133]酶切后的目的片段与酶切后的载体pET32a(购自Novagen公司)用T4 DNA Ligase(购自Takara公司)连接，体系如下：[0134][0135]将上述组分充分混匀后，16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。转化方法同上。挑取单克隆验证阳性并送测序，取测序正确的单克隆存菌并提取MemUGT1‑pET32a质粒。将构建好的原核表达载体质粒热击法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化、筛选与鉴定方法同上。[0136]2.5 MemUGT1重组蛋白原核表达[0137]2.5.1重组蛋白诱导纯化[0138](1)分别挑取菌株MemUGT1‑pET32a‑BL21阳性克隆接种于4mL含Amp抗性的LB培养基中，37℃，200rpm恒温摇床震荡培养过夜。[0139](2)将培养好的菌液按1:100的比例接于200mL含Amp抗性的培养基中，相同条件下培养至OD600为0.4‑0.6。在菌液中加诱导剂IPTG使其终浓度为0.5mM，16℃，110rpm摇床里培养18h诱导目的蛋白表达。[0140](3)将菌液离心5000rpm,5min后弃上清，收集菌体。[0141](4)按照菌体质量向离心管中加入适量的Binding buffer洗涤液，涡旋菌体使之重悬，5,000rpm，离心5min，收集菌体，洗涤两次后加15～20mL Binding buffer重悬菌体。[0142](5)将菌液置于冰水混合物中，超声裂解菌体，4℃12,000rpm，离心20min后收集上清进行过柱纯化，留部分上清液和沉淀准备SDS‑PAGE，以观察蛋白表达情况。[0143](6)将整合的上清加入Ni‑NTA柱子中，待上清流完，加入一柱体积的洗脱液(含有10CN112662641A说　明　书9/14页20mM咪唑)洗掉杂蛋白，然后用5mL Elution buffer(含咪唑浓度为250mM)收集目的重组蛋白。将洗脱下的蛋白液置于蛋白分子为30,000Da规格的超滤管中，加入Binding buffer进行换液并浓缩目的蛋白。[0144](7)将浓缩液吸取至1.5mL收集管中，测定蛋白浓度，并留样电泳。[0145](8)蛋白加10％甘油后，保存至‑80℃冰箱备用。[0146]Binding buffer：分别称取2.42g Tris‑HCl、29.22g NaCl、0.34g imidazole，加水溶解，调pH8.0，定容至1000mL，灭菌后加入70μLβ‑巯基乙醇，4℃保存。[0147]Elution buffer：分别称取2.42g Tris‑HCl、29.22g NaCl、34g imidazole，加水溶解，调pH8.0，定容至1000mL，灭菌后加入70μLβ‑巯基乙醇，4℃保存。[0148]2.5.2蛋白的浓度测定[0149]采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。[0150](1)完全溶解蛋白标准品BSA，取10μL用0.9％NaCl稀释至100μL，使其终浓度为0.5mg/mL作为标准品。[0151](2)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μL加到96孔板中，加0.9％NaCl补足到20μL。各做三个平行。[0152](3)用0.9％NaCl适当稀释留取的蛋白样品，同样加20μL。各做3个平行。[0153](4)各孔加入200μL G250染色液，室温放置3‑5min。[0154](5)用酶标仪测定595nm处的吸光值(A595)，根据标准品蛋白浓度和对应的吸光度绘制标准曲线，根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。[0155]2.5.3蛋白SDS‑PAGE电泳[0156]目的蛋白的表达及分离纯化情况用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS‑PAGE)进行检测。[0157](1)组装电泳装置，将玻璃板固定于胶架上。[0158](2)配制12％分离胶，加入到电泳仪中，加水液封，静置直至分离胶凝固。[0159](3)配制5％浓缩胶，倒掉上层水。将配制好的5％的浓缩胶混匀后立即倒入，将孔梳插入到玻璃板间(避免气泡的产生)，待胶凝固后拔出梳子。[0160](4)在蛋白上清液和纯化的蛋白中分别加入适量loading buffer，在沸水中煮5min 13,000rpm离心10min，取上清10μL点样，同时吸取蛋白Marker 3μL点样。[0161](5)向电泳槽中加适量电泳缓冲液，先90V恒压进行电泳，待样品电泳到分离胶时改为160V恒压电泳，直至溴酚蓝至胶的下沿，停止电泳。[0162](6)取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝R‑250染色液中浸泡染色，室温下轻摇染色4h。[0163](7)用蒸馏水冲洗掉蛋白胶表面的染色液，冲洗2～3次后置于脱色液中脱色2h，脱色过程中更换脱色液数次，直至蛋白胶背景洗干净。[0164](8)观察结果，蛋白电泳结果如图2。[0165]SDS‑PAGE分离胶和浓缩胶的配制溶液及比例如下：11CN112662641A说　明　书10/14页[0166][0167]2.6蛋白体外酶活功能鉴定[0168]2.6.1体外酶活分析[0169]MemUGT1进行体外酶活功能鉴定，以加入pET32a蛋白的反应体系为对照组。底物有槲皮素；山奈酚；杨梅素；异鼠李素；芹菜素；柚皮素；木犀草素；金圣草素；染料木素；金合欢素；秦皮乙素；大豆苷元；野黄芩素。[0170]酶活反应体系如下：[0171][0172][0173]混匀上述组分，置于30℃反应30min后加等体积乙酸乙酯终止反应，等体积乙酸乙酯萃取两次后，合并有机相，挥干溶剂。用100μL的甲醇重溶，采用HPLC进行酶活反应分析。实验结果见图3和图4。[0174]2.6.2酶活产物分析[0175]为了验证MemUGT1的体外酶活功能，HPLC被用于检测上述酶活反应的产物(图3和图4)。分析采用ZORBAX SB‑C18，5μm，4.6×150mm(Agilent)色谱柱，检测波长254nm,280nm,320nm和346nm，流速1.0mL/min，进样量为20μL。液相分析条件如下：[0176]HPLC分析条件为：12CN112662641A说　明　书11/14页[0177][0178]使用标准品的保留时间进行酶活产物鉴定。[0179]2.6.3最适pH和最适温度的测定[0180]为了确定重组MemUGT1蛋白催化活性的最佳pH，在pH 5.0到9.5和0.5pH增量下进行测定。通过MES缓冲液(pH 5.0‑6.5)，Tris‑HCl缓冲液(pH 7.0‑8.5)和NaHCO3‑Na2CO3缓冲液(pH 9.0‑9.5)控制pH。此外，在pH 7.5的Tris‑HCl缓冲液中，酶活反应30分钟确定温度对催化活性的影响。实验结果如图5。[0181]2.6.4酶学动力学参数测定[0182]Tris‑HCl(pH 7.5)缓冲液中，最适温度条件下，进行MemUGT1的酶学动力学分析，将底物浓度分别设为10、20、40、50、80、100、200、400μM。反应在酶加入时开始计时，反应5min，加等体积乙腈终止反应，平行实验3次。实验结果见表1。[0183]表1[0184][0185]实施例3.MemUGT1生物合成黄酮醇3‑O‑葡萄糖苷[0186]3.1利用大肠杆菌MemUGT1‑pET32a‑BL21(U1)生产化合物[0187]为了研究培养基类型，底物浓度以及体内饲喂培养时间对糖苷产物的影响，我们分别以底物槲皮素、山柰酚进行重组菌株U1的体内饲喂实验，具体实验操作如下：[0188](1)在37℃恒温培养箱中活化菌株，挑取单克隆接种至4mL LB液体培养基、TB液体培养基和M9液体培养基中(含Amp 100μg/mL)中，37℃培养箱继续培养7h；[0189](2)按照1:100的比例将目的菌株和对照菌株接种到50mL的抗性LB培养基、TB培养13CN112662641A说　明　书12/14页基和M9培养基中，37℃，200rpm摇床中培养至OD600＝0.4‑0.6，加IPTG使其终浓度为0.5mM，20℃恒温培养5‑7h；[0190](3)向菌液中加入DMSO溶解的底物(槲皮素和山柰酚)，底物浓度为100μM，放入20℃继续培养一段时间；[0191](4)每隔12h取出500μL菌液，加入等体积的乙酸乙酯萃取2‑3次，合并有机相，吹干样品，加入150μL甲醇重溶，用HPLC分析产物。培养基种类对糖苷产物的影响结果如图6。[0192](5)之后在使用最适培养基的条件下，以25μM‑2000μM的IPTG浓度梯度按上述操作方法对重组菌株U1进行饲喂实验，实验结果如图7。[0193](6)之后在使用最适培养基和最适IPTG浓度的条件下，我们以50μM‑175μM的底物浓度梯度按上述操作方法对重组菌株U1进行饲喂实验，实验结果如图8。[0194](7)经过条件优化以后的最大转化率见表2。[0195]表2[0196][0197][0198]3.2目的基因过表达载体的构建[0199]根据目的基因MemUGT1设计gateway引物[0200]attB1‑MemUGT1‑F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAACCATGGAGGGAGAAGTTGCAGG；(SEQ ID No.7)[0201]attB1‑MemUGT1‑R[0202]GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTATGTACAGTTCATATCCT；(SEQ ID No.8)[0203]以MemUGT1‑pET32a质粒为模板进行扩增，扩增的体系和条件同上。[0204](1)BP反应体系如下：[0205][0206](a)取出BP ClonaseTM mix试剂放置冰上2min，按照如上反应体系依次将各组分加入EP管中，用枪尖吹打混匀。[0207](b)将混合物置于25℃，孵育4‑6h。[0208](c)反应结束后，加入0.5μL Proteinase K solution轻轻混匀，置于37℃水浴10min。[0209](d)将最终反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂(含有gent抗性)的LB平板，37℃培养。连接转化及阳性单克隆的鉴定方法同上。[0210](2)将测序成功的质粒(MemUGT1‑pDONR207)按以下操作体系进行LR反应：14CN112662641A说　明　书13/14页[0211][0212](a)将上述混合液放置于25℃，反应6h左右，之后加入0.5μL Proteinase K solution，轻轻混匀，37℃反应10min，终止反应；[0213](b)反应结束后，将最终反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂(含有Kan抗性)的LB平板，37℃培养。连接转化及阳性单克隆的鉴定方法同上。测序成功得到最终阳性质粒MemUGT1‑pGWB5。[0214]3.3冻融法转化农杆菌[0215](1)‑80℃超低温冰箱中取出农杆菌感受态细胞GV3101，冰上融化，取出2μL的质粒MemUGT1‑pGWB5和pGWB5空载体质粒，分别加入到GV3101感受态细胞中并轻柔混匀，之后于冰上放置25min；[0216](2)用液氮迅速复冻1min，然后于37℃中水浴3min；[0217](3)向其中加入500μL无抗YEP液体培养基，30℃振荡培养3‑5h；[0218](4)取200μL菌液涂于YEP固体培养基(含50mg/mL Kan，100mg/mL Rif)上。30℃静置培养36h；[0219](5)挑取单克隆进行小量振荡培养，菌落PCR鉴定其阳性，取阳性克隆存菌，备用.[0220]YEP培养基组分(1L)：酵母提取物10g、胰蛋白胨10g、NaCl 5g，加水溶解并定容[0221]固体培养基加入琼脂(12g/L)后，高压蒸汽灭菌。[0222]3.4农杆菌花序浸染法转化拟南芥[0223]采用花序侵染法，将含有MemUGT1‑pGWB5过表达载体的农杆菌转化到拟南芥中，方法如下：[0224](1)转化植株栽培：提前一天泡好土，将己经在4℃春化三天的拟南芥Col‑0种子点种在花盆中，每盆四棵，置于培养箱中培养；拟南芥植株刚刚开花时，去掉主支顶端来促进侧枝的生长，挑选生长状态良好、无角果(有角果的话要先剪掉，以免影响阳性率)、花卉未成熟的植株用于转化，侵染前可将植株多浇些水。[0225](2)农杆菌活化：将构建好的含植物过表达载体的农杆菌在YEP固体培养基上划线活化，挑单克隆于2mL YEP液体培养基(含50μg/mL Kan+100μg/mL Rif)中小摇，再按1：100接种至100mL YEP液体培养基中摇菌，测OD600≈1.0‑1.2；离心弃培养基，收集菌体，用适量侵染液重悬，调整菌浓度使OD600≈0.8。[0226](3)侵染：将活化好的侵染菌液置于大烧杯中，将花盆倾斜，把植株花序浸入菌液中2min，期间轻轻转动花盆，保证花序完全被农杆菌侵染。侵染结束后，用黑色的袋子套好，暗培养24h后再正常培养，侵染需要2‑3次。之后，正常光照培养至角果成熟开裂，收集种子。[0227]3.5转基因拟南芥的筛选及鉴定[0228]经过花序侵染法得到转基因拟南芥的种子需要经过含抗生素的培养基筛选并验证阳性，具体方法如下：[0229](1)收取的种子经过75％乙醇5min，无水乙醇3min消毒后在含25mg/L潮霉素的1/15CN112662641A说　明　书14/14页2MS的选择培养基上进行培养，培养条件温度22℃，光周期16h/8h；[0230](2)观察培养基上种子的生长状况，一些种子萌发正常，根叶都正常生长，一些种子即使能萌发但不能长根，没有真叶长出。正常生长的为阳性克隆，非阳性克隆的种子不能在培养基上正常生长，将得到的阳性幼苗移植到土壤中种植；[0231](3)取阳性植株的叶片少许用CTAB‑DNA方法提DNA进行PCR阳性验证，分别以MemUGT1‑RT‑F/MemUGT1‑RT‑R和AtActin‑RT‑F/AtActin‑RT‑R两对引物扩增，确定含目的基因的阳性植株，并收集阳性植株的种子；[0232](4)收取T1代转基因植株种子在选择培养基上再筛选，选择阳性幼苗单株种植得到T2代种子；[0233](5)筛选不出现分离比的T2代种子，得到纯合的转基因株系，用于分析目的基因的体内功能。[0234]3.6转基因拟南芥基因表达分析[0235](1)通过CTAB‑PVP法分别提取转基因纯合子和野生型幼苗的RNA，提取方法见前；[0236](2)以MemUGT1‑RT‑F/MemUGT1‑RT‑R和内参引物AtActin‑RT‑F/AtActin‑RT‑R,通过RT‑PCR分别检测转基因植株中MemUGT1的转录情况，证明外源基因MemUGT1己成功整合到拟南芥基因组中。[0237]3.7转基因拟南芥的化学成分分析[0238](1)收集新鲜的转基因拟南芥幼苗，用混合溶剂(80％甲醇：20％水)提取代谢产物，4℃，超声1h，之后1,4000rpm，离心15min,取上清，过滤膜后，取20μL进HPLC/LC‑MS分析。[0239](2)HPLC被用于分析转基因拟南芥提取物中的代谢物。检测波长280～350nm，分析采用Luna 5u C18，5μm，4.6×250mm(Agilent)色谱柱，检测波长254nm,280nm,320nm和346nm，流速0.8mL/min，进样量为20μL。液相分析条件如下：[0240]HPLC分析条件为：[0241][0242]LC‑MS用于提取物鉴定。分析方法和分析柱同上。检测结果如图9。[0243]上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。16CN112662641A序　列　表1/4页SEQUENCE LISTING<110> 山东大学<120> 楔瓣地钱黄酮类化合物糖基转移酶及其编码基因与应用<130><160> 8<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 488<212> PRT<213> MemUGT1蛋白<400> 1Met Glu Gly Glu Val Ala Gly Leu Arg Ile Ser Thr Asp Asp Leu Lys1 5 10 15Asn Ile Gln Thr Lys His Val His Leu Leu Val Ile Pro Leu Cys Ile20 25 30Lys Ala Ile Ser His Val Ser Ala Cys Phe Leu Leu Ala Val Lys Leu35 40 45Ala Lys Gln Gly Ile Thr Val Thr Phe Leu Thr Val Glu Asp Thr Leu50 55 60Ser Tyr Ile His Ser Gln Arg Ser Pro Glu Glu Leu Gln Ser Leu Gly65 70 75 80Ile Arg Leu Ala Ile Val Glu Tyr Asp Glu Ser Leu Leu Leu Gln His85 90 95Pro Glu Trp Ser Pro Pro Val Arg Leu Ser Trp Val Leu Glu Arg Ala100 105 110Val Gln Pro Tyr Phe Lys Lys Phe Ala Leu Asp Arg Ala Ser Gly Val115 120 125Ala Asp Gln Pro Thr Cys Ile Met Ala Asp Phe Phe Cys Tyr Trp Ala130 135 140Gln Thr Arg Ala Glu Glu Leu Asn Leu Pro Asn Tyr Val Phe Tyr Pro145 150 155 160Ser Gly Ala Asn Leu Ala Arg Leu His Ala Ala Phe Pro Thr Leu Val165 170 175Ser Glu Gly Lys Val Glu Val Ser Ala Asp Asp Lys Val Ile Val Thr180 185 190Asn Ala Ile Val Ser Val Pro Gly Leu Pro Pro Leu Pro Ser Gly Glu195 200 205Leu Pro Lys Ser Leu Arg Gln Gly Pro Val Ser Glu Ala Leu Asn Leu17CN112662641A序　列　表2/4页210 215 220Ala His Glu Leu Val Lys Ala Thr Gly Ile Ile Ile Asn Thr Phe Tyr225 230 235 240Glu Phe Glu Tyr Thr Ala Ile Glu Pro Phe Met Ala Ala Cys Asp Ser245 250 255Lys Met Lys Val Pro Lys Leu Phe Pro Ile Gly Pro Leu Ala Ser Ala260 265 270Gln Thr Val Thr Val Pro Thr Gly Arg Gln Thr Glu Glu Cys Met Glu275 280 285Trp Leu Asp Ser Gln Pro Ala Ser Ser Val Ile Tyr Ile Cys Phe Gly290 295 300Ser Lys Ser Asn Trp Thr Ala Gln Ile Val His Glu Leu Ala Leu Ala305 310 315 320Leu Glu Ala Ser Asn Tyr Arg Phe Leu Trp Val Leu Asn Gln Lys Gly325 330 335Phe Asp Phe Thr Ser Leu Ala Glu Val Leu Pro Ala Gln Phe Gln Ala340 345 350Arg Val Gly Glu Arg Gly Arg Ile Ala Thr Phe Trp Val Pro Gln Val355 360 365Lys Val Leu Leu His Arg Ala Val Ser Cys Phe Met Ser His Cys Gly370 375 380Trp Asn Ser Ile Met Glu Ser Val Thr Ser Gly Val Pro Met Leu Cys385 390 395 400Trp Pro Arg Gln Ala Glu Gln His Leu Asn Cys Arg His Ile Val Asp405 410 415Met Val Gln Ala Gly Val Gln Ile Ile Val Gly Asp Asp Gly Ala Ala420 425 430Lys Gln Gln Glu Ile Glu Arg Ala Leu Ser Ile Met Met Asp Glu Glu435 440 445Asp Gly Lys Ser Ile Arg Lys Arg Met Gln Asp Leu Lys Met Lys Ala450 455 460Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ser Ser Ser Leu Ala Phe Gln Asp465 470 475 480Leu Val Glu Asp Met Asn Cys Thr485<210> 2<211> 1467<212> DNA<213> MemUGT1编码基因18CN112662641A序　列　表3/4页<400> 2atggagggag aagttgcagg cctccgcatt tcgactgacg atctcaagaa catccaaacg 60aagcatgtcc acctgctggt aatcccattg tgtataaagg ccatttctca cgtttctgcg 120tgttttttgc tggctgtgaa gctcgcaaag cagggcatca ccgtcacctt cctcacggtg 180gaagatactc tgtcgtacat ccactcgcag cgttcacccg aagagctgca aagcctgggc 240atccgtttgg ccattgtgga atacgatgaa tctctgctac tgcaacatcc tgaatggtcc 300ccgccagttc gtctctcgtg ggtgctggag cgagctgtcc aaccgtactt caaaaagttt 360gctctcgacc gagcttcagg agttgccgat caacccacat gcatcatggc agatttcttc 420tgttattggg cccagacacg agccgaggag ttgaatctac caaactatgt attttatccc 480agtggtgcaa atctggcccg tcttcatgca gcg