细菌的简单染色和革兰氏染色
微生物学实验中南民族大学工商学院环境与生物工程实验教学中心 实验四细菌的简单染色和 革兰氏染色 一、实验目的 二、实验
内容
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三、实验材料 四、实验步骤 五、实验结果 六、 思考
题
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一、实验目的 1.了解细菌的涂片及染色在微生物学实验中 的重要性。 2.学会细菌染色的基本操作技术，从而掌握 微生物的一般染色法和革兰氏染色法。 二、实验内容(一) 细菌的简单染色 实验原理 continued 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的 一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、 碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷， 而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电 荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合 使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜 明的对比，在显微镜下更易于识别。 实验原理 continued 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。 利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌 体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察 到其形态和结构。 常用作简单染色的染料有:美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 实验材料1、菌种 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌2、染色剂 吕氏碱性美蓝染液 齐氏石碳酸复红染液实验步骤 无菌操作 涂片 涂片 水洗 水洗 干燥 干燥 固定 固定 干燥 干燥 染色 染色 镜检 镜检操作步骤(continued) 操作步骤(continued) 1、涂片 取两块载玻片，各滴一小滴(或用接种环沾取) 生理盐水(或无菌水)于玻片中央，用接种环以无 菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑 取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2 环直接涂于载玻片上。 注意(Notes):1) 载玻片要洁净无油迹2)滴生理盐水和取菌不宜过多3)涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 操作步骤(continued)2、干燥 室温自然干燥3、固定 固定的目的: 1)使细胞质凝固，以固定细胞形态; 2)并使菌体牢固地附着在载玻片上。固定方法:热固定:涂面朝上，通过火焰数次注意:温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态 操作步骤4、染色 (continued)? 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。? 美蓝染色1-2min;石碳酸复红染色约1min。5、水洗 倒去染液，用洗瓶(内装自来水)轻轻冲洗， 直至涂片上流下来的水无色为止;染色废液收 集在废液缸中。 Note: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水 从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂 片薄膜脱落。 6、干燥 操作步骤(continued)自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。7、镜检细菌个体微小，一般使用油镜观察细菌个体形态。 Notes):注意(1 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油2 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干 净，否则可能损害镜头3)擦油镜镜头方法:分三步 A)先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B)从双层瓶的下层沾少许二甲苯(乙醚酒精)滴在另一片擦镜纸上 ，擦拭镜头; C)再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的二甲苯(乙醚酒精) 。 (二)革兰氏染色 实验原理 continued G,肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质， 故用乙醇等有机溶剂脱色时溶解了类脂质， 增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘 的复合物易于渗出，经番红复染呈红色。 G，细胞壁结构致密，用乙醇脱色处理后，肽 聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保 留初染时的紫色。 实验材料、试剂、器皿 实验材料: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 试剂: 草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、95乙醇、 番红染液 器皿: 显微镜、接种环、
载玻片、酒精灯 实验步骤 革兰氏染色的步骤 1. 涂片 2. 初染:在做好的涂面上滴 加草酸铵结晶紫染液，染1分 钟，倾去染液，流水冲洗至 无紫色。 3. 媒染:先用新配的路哥氏 碘液冲去残水，而后用其覆 盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色:除去残水后，滴加 95酒精进行脱色约20,30 秒，后立即用流水冲洗。 5. 复染:滴加番红染色液， 染3,5分钟，水洗后用吸水 纸吸干。 6. 镜检:观察染色结果并绘 图。 7.显微镜用毕处理。 注意事项 载玻片要洁净无油迹，滴生理盐水和取菌不宜过 多，涂片要均匀，不宜过厚。 热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形 态。 水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急，以免涂 片薄膜脱落。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是关键环节， 脱色不足，阴性菌误染成阳性菌;脱色过度，阳性 菌误染成阴性菌。脱色时间一般约20,30sFigure 1 - A Gram stain Figure 2 - Gram
stain ofof Gram Gram –Staphylococcus cells(金黄色葡萄球菌菌) E. coli cells(大肠杆菌) 实验报告1.结果 列表简述三株细菌观察结果，说明各菌株的形 状、颜色和革兰氏反应并绘图2、思考题 1)制备细菌染色标本时应注意哪些环节, 2)如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问 题, 如果加热温度过高、时间过长，又会怎样, 3)为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观 察, 4)涂片为何要固定,固定加热时间过长会怎样, 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操 作,哪一步是关键,Why
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