砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析

砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 园 艺 学 报 2014，41(7):1379–1390 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com 砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 李 鹤1，郭世荣1,2，束 胜1，徐 扬1，孙 锦1,2,* (1南京农业大学园艺学院，农业部南方蔬菜遗传改良重点开放实验室，江苏省现代设施农业技术与装备工程实验室， 南京 210095;2南京农业大学(宿迁)设施园艺研究院，江苏宿迁 223800) 摘 要:搜集了设施黄瓜嫁接栽培中常用的47份砧用南瓜种质资源，利用63个形态标记和40对南 瓜SSR标记，对其进行遗传多样性及亲缘关系鉴定。结果表明，砧用南瓜的8个质量性状(嫩瓜皮色、 瓜形、主蔓色、瓜面斑纹、叶面白斑、叶形、嫩瓜斑纹和嫩瓜斑纹色)和23个数量性状的多样性指数大 于1.00;SSR标记共检测到167个等位变异，平均每个SSR位点的等位基因数为4.18个，变幅2 ~ 8个， 平均多样性指数为0.62，变化范围0.16 ~ 1.18。非加权算术平均法(UPGMA)聚类分析表明，砧用南瓜 63个形态学性状将47份种质划分为4个类群，大部分品种集中于一个类群中;40对多态性SSR标记将 所有种质划分为3个类群，大部分品种的分子标记与形态学标记的聚类结果相似。已搜集的47份砧用南 瓜种质资源遗传多样性并不丰富，亲缘关系较近;SSR标记CMTm11具有极高的多态性，可用于砧用南 瓜种质分子标记辅助选择;嫩瓜皮色等8个质量性状和大部分数量性状都可以作为形态标记辅助种质资 源评价及新品种选育。 关键词:南瓜;砧木;形态学;SSR 中图分类号:S 642. 1 文献标志码:A 文章编号:0513-353X(2014)07-1379-12 Germplasm Resources Analysis of Rootstock-used Pumpkins by Phenotype and SSR LI He1，GUO Shi-rong1,2，SHU Sheng1，XU Yang1，and SUN Jin1,2,* College of Horticulture Nanjing Agricultural University Key Laboratory of Southern Vegetables Genetic Improvement (1 ， ， of Ministry of Agriculture Nanjing China Facility Horticulture Institute Nanjing Agricultural University Suqian ， 210095， ;2 ， ， ， Jiangsu China 223800， ) Abstract:Forty-seven accessions of rootstock-used pumpkin were collected in this research. Analyses of genetic diversity and relationships were done with 63 phenotypes and 40 SSR markers. It was observed that H ’> 1.00 with eight qualitative characters(tender gourd skin color，fruit shape，main vine color， skin speckle，foliage white spotting，leaf shape，tender gourd speckle and color)and 23 quantitative characters. One hundred and sixty-seven polymorphic bands were generated. An average of 4.18 H’ranged from polymorphic bands were detected from one pair SSR primers，and they ranged from 2 to 8. 0.16 to 1.18，and its average was 0.62. Forty-seven germplasms were divided into four groups by 63 morphological traits，and most of the germplasms were clustered into one group. Three groups were divided by 40 higher polymorphic SSR primers，similar to the result of our previous morphological study. 收稿日期:2014–02–26;修回日期:2014–06–13 基金项目:国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-25-C-03);江苏省农业三新工程项目(SXGC[2012]391) * 通信作者 Author for correspondence(E-mail:jinsun@njau.edu.cn) 1380 园 艺 学 报 41卷 The genetic diversity of collected rootstock-used pumpkin germplasms was low，and the genetic relationship was close. SSR marker CMTm11，with a high polymorphism，could be used in molecular marker assisted selection. Eight quality traits and most of the quantitative traits could be used as morphological markers， as an auxiliary means of rootstock-used pumpkin germplasms evaluation and breeding of new varieties. Key words:pumpkin;rootstock;phenotype;SSR Cucurbita 研究表明，南瓜( L.)砧木的选择对于嫁接黄瓜栽培中抵抗土传病害和土壤盐渍化危 害十分重要(曾义安 等，2005;李萍萍，2011)。南瓜目前在世界各地广泛栽培(林德佩，2000)。 Cucurbita moschata C. maxima C. pepo C. mixta 中国南瓜( )、印度南瓜( )、美洲南瓜( )、灰籽南瓜( ) C. ficifolia 和黑籽南瓜( )是中国常见的5个栽培种，每一个栽培种又有许多的类型和品种(王鸣， 2002)，使南瓜成为生物多样性最为丰富的植物(Esquinas-Alcázar & Gulick，1983)。然而，生产中 能够应用于黄瓜嫁接的南瓜砧木品种并不多，并且砧木品种选育的基础研究也较薄弱(李国强 等， 2008)。种质资源是进行育种工作的基础，狭窄的遗传基础难以培育出突破性品种(赖勇 等，2013)。 因此，开展砧用南瓜种质资源评价研究，对优良砧木的选择利用和新品种选育具有重要意义。 袁建民等(2012)对国内外37份南瓜种质通过调查30个变异系数较大的形态学性状进行遗传 多样性分析，发现不同性状在不同的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 之间表现出不同程度的形态学多样性。Ahamed等(2012) 对20份南瓜种质的评价中发现，有7个品种可用于今后的育种工作，并提出不同基因型南瓜的叶片 长、叶片厚度、分枝数、单瓜质量、果皮色、果肉色等具有显著差异。杜晓华等(2010)调查的8 个性状(叶长、叶宽、叶面积、蔓长、蔓粗、节间长、第一雄花节位和第一雌花节位)在50份南瓜 自交系间差异显著。 Ferriol等(2004)通过SRAP和AFLP标记对来自中美洲、南美洲及西班牙地区的47份南瓜资 源进行了分子多样性分析，将不同种质分成2个类群。Gwanama等(2000)通过RAPD技术，将非 洲的31份基因型的南瓜分为3类。然而，相对于RAPD、AFLP、RFLP等分子标记技术，SSR标 记具有技术简单、多态性高、重复性好等特点，已逐渐成为研究遗传多样性的理想工具(赵庆勇 等， 2010)。Gong等(2012)利用134对SSR引物分析了104个美洲南瓜品种的亲缘关系，在20个连 锁群中共检测到418对等位基因。 值得关注的是，Liu等(2013)认为，基于形态学特征与分子标记的亲缘关系分析将提高籽用 南瓜种质资源分类的准确性，并且二者的聚类分析结果具有显著相关性(刘超，2012)。而且，目前 对南瓜种质资源的研究大多集中在食用南瓜、观赏南瓜和籽用南瓜上，关于砧用南瓜种质资源遗传 多样性的研究鲜有报道。本研究中通过对中国生产和市场进行调研，搜集了设施黄瓜嫁接栽培中常 用的47份砧用南瓜种质资源，利用63个形态标记和已公开发表的144对南瓜SSR标记，共同进行 遗传多样性分析，较全面地评价了砧用南瓜种质资源，将有利于了解生产中常用的砧用南瓜之间的 亲缘关系，为砧用南瓜种质资源创新和品种选育提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料及其形态学性状调查 供试材料为中国设施黄瓜嫁接栽培中常用的砧用南瓜种质，共47份(表1)，种子均购自砧木 繁育单位。幼苗期试验于2013年3—4月在南京农业大学牌楼试验基地的塑料大棚内进行。种子经 浸种、催芽后，播于15孔穴盘中基质育苗，每穴1粒，每个品种播种2盘共30株。育苗基质为蔬 7期 李 鹤等:砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 1381 菜专用育苗基质，由镇江培蕾基质科技发展有限公司提供。成熟期试验于2013年4—9月在南京农 业大学江浦试验基地进行。将幼苗定植于江浦农场的塑料大棚内，随机区组设计，双行定植，小区 面积18.0 m2，每小区种植10株，株距0.9 m，行距2.0 m，2次重复，吊蔓栽培，常规管理。 共测定63个形态学性状，其中质量性状40个(表2)，数量性状23个(表3)。所有形态学性 状参照《南瓜种质资源描述 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 和数据 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 》(李锡香，2007)及相关标准进行统计。质量性状按照 表2的标准赋值，以0 ~ 12级进行记录;数量性状用直尺或游标卡尺测量长度、电子秤测量质量。 表1 材料名称及来源 Table 1 Origins and names of materials 编号 品种 产地 植物学分类 Accession Cultivar Origin Botanical classification 1 宝尔砧木 Baoer 中国北京 Beijing，China 中国南瓜 Cucurbita maxima C. moschata × C. maxima 2 昌砧铁龙 Changzhen Tielong 中国山东 Shandong，China 白籽南瓜 C. maxima 3 大维10号 Dawei 10 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima 4 大维17号 Dawei 17 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 5 大维3号 Dawei 3 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima C. maxima 6 大佐台木 Dazuo 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. moschata × C. maxima 7 东方正大旗舰 Dongfang Zhengda Qijian 中国甘肃 Gansu，China 白籽南瓜 8 东洋神力 Dongyang Shenli 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. maxima C. maxima 9 丰亿真亮 Fengyi Zhenliang 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima 10 奉煌一号 Fenghuang 1 印尼 Indonesia 中国南瓜 C. maxima 11 荷兰速腾 Helan Suteng 荷兰 Holland 中国南瓜 12 黑南瓜籽 Heinanguazi 中国山东 Shandong，China 黑籽南瓜 C. ficifolia C. maxima 13 佳合台木 Jiahe Taimu 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima 14 金刚1号 Jingang 1 中国北京 Beijing，China 中国南瓜 15 金优台木 Jinyou Taimu 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. maxima C. maxima 16 京欣砧5号 Jingxin 5 中国甘肃 Gansu，China 中国南瓜 C. maxima 17 昆仑 Kunlun 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima 18 力王台木 Liwang Taimu 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 19 亮光黄瓜专用砧木 Great 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima C. maxima 20 强力冠军 Qiangli Guanjun 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima 21 强力一闪 Qiangli Yishan 日本 Japan 中国南瓜 22 强势台木 Qiangshi Taimu 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. maxima C. maxima 23 日本根力神 Genlishen 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. maxima 24 日本金秀台木 Jinxiu 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima 25 日本井田台木 Jingtian 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 26 日本绿霸 Lüba 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima C. maxima 27 日本强力士 Qianglishi 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima 28 日本青藤台木 Qingteng 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 29 日本秀丽 Xiuli 日本 Japan 中国南瓜 C. maxima C. moschata × C. maxima 30 日本雪松 Xuesong 日本 Japan 白籽南瓜 C. maxima 31 日本砧木王 Zhenmuwang 日本 Japan 中国南瓜 32 神力1号 Shenli 1 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. maxima 33 神砧 Shenzhen 中国河北 Hebei，China 中国南瓜 C. maxima C. moschata × C. maxima 34 胜利(黄)Victory(yellow) 日本 Japan 白籽南瓜 C. maxima 35 胜利(白)Victory(white) 日本 Japan 中国南瓜 36 台丈夫F1 Taizhangfu F1 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima C. maxima 37 卧底龙 Wodilong 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima 38 一辉F1(强力土佐)Yihui F1 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 39 战神砧木F1 Zhanshen F1 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 C. maxima 40 正大魔力 Zhengda Moli 印尼 Indonesia 中国南瓜 C. maxima C. maxima 41 子木川秀 Zimu Chuanxiu 中国山东 Shandong，China 中国南瓜 C. maxima 42 中原冬生 Zhongyuan Dongsheng 中国新疆 Xinjiang，China 中国南瓜 43 中原强生 Zhongyuan Qiangsheng 中国新疆 Xinjiang，China 中国南瓜 C. maxima C. moschata × C. maxima 44 中原共生新一代 Zhongyuan Gongsheng 中国新疆 Xinjiang，China 白籽南瓜 C. maxima 45 JAP魔根砧木F1 Mogen F1 中国辽宁 Liaoning，China 中国南瓜 46 鸳鸯藤 Yuanyangteng 印尼 Indonesia 中国南瓜 C. maxima C. ficifolia 47 黑籽南瓜 Heizi Nangua 中国山东 Shandong，China 黑籽南瓜 1382 园 艺 学 报 41卷 1.2 植物基因组DNA的提取与PCR扩增 2013年9月，在南京农业大学生科楼的塑料拱棚内进行穴盘基质育苗，每个品种30株。幼苗 一叶一心时取第一片真叶，每品种取样10株。样品液氮速冻后，贮存于–80 ?冰箱内待用。 采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305-03(天根生化科技有限公司)提取叶片总DNA。1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，epporf Bio Photometer plus核酸分析仪测定样品DNA浓度，稀释 至50 ng ? µL-1备用。 选取144对SSR引物(由Oligo公司合成)进行特异性引物筛选(Gong et al.，2008;王冬杰， 2013)，选用5个差异较大品种的DNA作模板。选择条带清晰、有差异带和重复性好的引物，用于 全部砧用南瓜 样本 保单样本pdf木马病毒样本下载上虞风机样本下载直线导轨样本下载电脑病毒样本下载 的分析。 Taq PCR反应体系为20 µL，包括:50 ng ? µL-1 DNA模板1.0 µL，10 × Ex Buffer(Mg2+ free) 2.0 µL，25 mmol ? L-1 MgCl2 1.5 µL，2.5 mmol ? L-1 dNTP Mixture 1.6 µL，10 µmol ? L-1正反向引物各 Taq 1.0 µL，2.5 U ? µL-1的r 0.2 µL，以及ddH2O 11.6 µL。溶液分装在eppendorf epMotion 5070移液 工作站上进行。PCR扩增在Biorer Life Express PCR仪内进行，程序为:95 ?预变性5 min，94 ? 变性1 min，退火(温度随引物的不同而改变)1 min，72 ?延伸1 min，38个循环，72 ?延伸10 min 后立即置于冰水混合物中，冷却后置于4 ?冰箱中保存待测。采用JY-JX7垂直电泳槽(北京君意 东方电泳设备有限公司制造)，在8%非变性聚丙乙烯酰胺凝胶中对扩增产物进行电泳分离。电泳结 束后银染，用GE Image Scanner ? 图像扫描系统(德国)观察并照相记录。 1.3 谱带统计及数据分析 记录易于辨认的多态性位点。扩增产物按同一迁移位置上条带在各个材料中的有(记为1)、无 (记为0)进行统计(不具多态性的条带不予统计)，建立数据矩阵。SSR标记的变异的多样性指数 H H ( ’)，是根据所有材料中等位基因出现的频率计算的(刘超，2012): ’=–ΣPi lnPi。其中，Pi 表示第i个等位基因出现的频率。利用NTSYS-pc 2.11软件，计算材料间的遗传相似性系数，根据 非加权算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，构建系统进化树。 X δ 形态学性状的数据分析参照尚建立等(2012)的方法，数量性状根据平均值( )和标准差( ) X –2 δ X + 2δ δ 分为10级，1级 < ，10级 ? ，中间每级相差0.5 。各性状的遗传多样性采用Shannon’s H H 信息指数( ’)进行评价: ’=–ΣPi lnPi，Pi表示第i种变异类型出现频率，用所有相应的各个性 H 状 ’的平均值表示一组或所有种质的遗传多样性程度。采用Excel计算各性状的最大值、最小值、 平均值、极差和变异系数，采用SPSS 20.0进行方差分析和显著性测验，采用NTSYS-pc 2.11软件 进行UPGMA聚类。 2 结果与分析 2.1 形态学性状遗传多样性分析 47份砧用南瓜种质资源质量性状分布及多样性情况见表2，多样性指数的变化范围为0.18 ~ 1.45，平均值0.79。其中，多样性指数最高的质量性状为嫩瓜皮色，主要以浅绿色(频率31.91%)、 绿色(21.28%)、深绿色(19.15%)为主。共有8个质量性状的多样性指数大于1.00，包括嫩瓜皮 色、瓜形、主蔓色、瓜面斑纹、叶面白斑、叶形、嫩瓜斑纹、嫩瓜斑纹色。瓜形的多样性指数为1.44， 主要为扁圆形(19.79%)、近圆形(25.53%)和梨形(17.02%)。40.43%的种质的主蔓颜色为深绿色。 瓜面斑纹以块状为主，占所有种质的48.94%。50%以上种质(51.06%)没有叶面白斑。大部分种质 7期 李 鹤等:砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 1383 (63.83%)的叶片为掌状五角形。子叶色为多样性指数最低(0.18)的质量性状，95.74%种质的子 叶色为深绿色。 表2 砧用南瓜种质资源质量性状分布及多样性 Table 2 Frequency distribution and diversity index of rootstock-used pumpkin germplasms on qualitative characters 赋值标准 频率/% Frequency 性状 H’ Trait Criteria 0 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 种皮色 1白White;3黄白Yellowish- 10.64 85.11 4.26 0.51 Seed color white;7黑Black 85.11 14.89 0.42 种皮光泽 0无Mat; Seed luster 1有Glossy 14.8985.11 0.42 种缘表面特征 1平滑Smooth; Seed surface 2粗糙Rough 10.64 85.114.26 0.51 种子周缘 0无隆起Flat;1隆起Ridgy; Seed margin 2狭边Narrow 2.1310.6487.23 0.44 种子周缘色 1浅Light;2与种皮相近 Seed margin Similar to seed coat; color 3深Dark 29.7955.3214.89 0.97 种喙特征 1圆钝，不倾斜Obtuse; Seed beak 2平直，不倾斜Flat; characters 3平直，倾斜Flat & tilt 子叶色 2绿Green; 4.26 95.74 0.18 Cotyledon color 3深绿Dark green 花冠色 1浅黄Light Yellow; 12.7772.3410.64 0.74 Corolla color 2黄Yellow; 3橙黄Orange-yellow 87.236.382.13 0.38 花筒形状 1钟形Bell-shaped;2圆筒形 Floral tube shape Cylindrical ;3广平开杈Open 82.988.514.26 0.50 花瓣先端形状 1锐角Acute;2钝角Obtuse; Petal shape 3圆形Round 花萼片 1小、细Small & thin; 70.2125.53 0.60 Sepals 2大、常呈叶状Big & leafy 花梗刺毛 0无Without; 44.68 51.06 0.70 Pedicel bristle 1有With 10.6421.2827.6640.43 1.29 主蔓色 1黄绿Yellow-green; Main vine color 2浅绿Light green; 3绿Green;4深绿Dark green 40.4348.9410.64 0.95 主蔓刺毛 1少Less; Main vine bristle 2中More;3多Most 主蔓横切面形状 1 五棱形Five prismatic; 4.2695.74 0.18 Main vine 2圆形Round section shape 6.3863.834.268.5117.02 1.11 叶形 1掌状Palmate; Leaf shape 2掌状五角Palmate & pentagonal; 3心脏形Heart shaped; 4心脏五角Heart shaped & pentagonal;5近圆Near round 叶色 1浅绿Light green;2绿Green; 19.1565.9614.89 0.87 Leaf color 3深绿Dark green 36.1757.456.38 0.86 叶缘 1全缘Entire;2波状Wave; Leaf margin 3锯齿Jagged 29.79 63.832.134.26 0.86 叶裂刻 0无None;1浅Light; Type of lobed leaf 2中Deeper;3深Deepest 51.06 19.1525.534.26 1.14 叶面白斑 0无None;1少Less; Foliage white 2中More;3多Most spotting 叶背刺毛 1硬Hard; 68.0931.91 0.63 Blade back bristle 2软Soft 2.13 6.3829.7948.94 0.97 瓜梗基部 0无变化Straight; Stalk basal 1基部稍膨大Slightly enlarged; 2基部膨大Base enlarged; 3均匀膨大Enlarged 1384 园 艺 学 报 41卷 续表2 赋值标准 频率/% Frequency 性状 H’ Trait Criteria 0 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 12 瓜梗基部膨大 1五角形Pentagonal; 57.4529.79 0.68 形状Stalk basal 2圆弧状Arc shaped enlargement shape 53.1931.912.13 0.78 瓜梗横切面形状 1圆形Round; Stalk transverse 2五棱形Five prismatic; section shape 3椭圆形Oval 嫩瓜皮色 1白White;5浅黄Light 6.38 4.26 31.91 21.28 19.151.45 Tender gourd skin green;10浅绿Light green; color 11绿Green;12深绿Dark green;13墨绿Mossy green 嫩瓜斑纹Tender 2条Strip;3块Massive; 27.6634.0425.53 1.07 gourd speckle 4网Mesh 48.94 19.1517.022.13 1.05 嫩瓜斑纹色 1浅绿Light green;4橙黄 Tender gourd Orange-yellow;5橙Orange; speckle color 7橙红Orange-red 瓜面特征Gourd 1平滑Flat;3皱缩Shrinking; 12. 77 6.3868.09 0.70 skin characters 4瘤突Bulged 棱沟深浅 0无Without;1浅Shallow; 6.38 59.5717.024.26 0.92 Edge and ditch 2中Deeper;3深Deepest 2.13 70.2114.89 0.61 瓜瘤大小 0小Smallest;1较小 Gourd tumor size Smaller;2中Middle 72.3412.772.13 0.58 瓜瘤多少Gourd 1少Less;2中More; tumor quantity 3多Most 2.13 57.4527.66 0.76 瓜面蜡粉Gourd 0无None;1少Less; skin wax powders 2中More 31.9151.064.26 0.84 近瓜蒂瓜面形状 1凹Concave;2平Flat; Shape of skin near 3凸Convex pedicel 25.5357.454.26 0.80 瓜顶形状Shape of 1 凹Concave;2平Flat; the top of gourd 3凸Convex 8.5129.7925.534.26 2.13 17.02 1.44 瓜形 1盘形Disc;2扁圆Oval; Fruit shape 3近圆Near round;4椭圆 Elliptical;7长筒Barrel- shaped;8梨形Pear-shaped 2.13 63.8314.892.13 2.132.13 0.90 皮色 2红Red;3橙红Orange-red; Skin color 4橙黄Orange-yellow; 5黄Yellow;8深绿Dark green;9墨绿Mossy green 6.38 10.646.38 48.9414.89 1.22 瓜面斑纹 0无None;1点Dot;2条Strip; Skin speckle 3块Massive;4网Mesh 63.83 2.13 19.15 2.13 0.77 斑纹色 1浅红Light red;3深红Dark Speckle color red;4浅黄Light yellow; 7浅绿Light green 31.9144.68 10.64 0.96 瓜肉色 1浅黄Light yellow;2黄 Flesh color Yellow;4橙黄 Orang-yellow 12.77 68.096.38 0.70 横切面形状 1圆形Round;3有均匀的 Transverse section 凹陷Uniform hollow;4不 shape 规则形状Irregular 砧用南瓜种质资源数量性状的多样性指数均大于1.00(表3)，变化范围为1.14 ~ 1.91，平均值 1.64，显著高于质量性状的多样性指数，说明数量性状更丰富。各数量性状的变异系数变化范围为 6.20% ~ 96.04%。其中，种子活力指数的最大值为294.66，最小值为0，即没有发芽，变异系数为 96.04%。单瓜质量、壮苗指数、种子百粒质量的变异系数均大于40%，分别为57.64%、40.29%、 40.27%。在所有性状中，幼苗期(种子萌发到三叶一心时)的多样性指数和变异系数是最小的，分 别为1.14和6.20%。种子活力指数和壮苗指数与南瓜作为砧木的要求比较密切，在47份砧木资源 中种子活力指数的最大的是13号品种‘佳合台木’，壮苗指数最大的是25号品种‘日本井田台木’。 7期 李 鹤等:砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 1385 表3 砧用南瓜种质资源数量性状变异统计 Table 3 Variation analysis of quantitative characters for rootstock-used pumpkin germplasms 性状 均值 标准差 极小值 极大值 极差 变异系数/% 多样性指数 Trait Mean SD Minimum Maximum Range CV H’ 种子长度/ cm Seed length 1.63 0.19 1.20 2.10 0.90 11.81 1.76 种子宽度/ cm Seed width 0.85 0.13 0.60 1.20 0.60 14.72 1.68 种子厚度/ cm Seed thickness 0.25 0.06 0.16 0.52 0.36 26.35 1.48 种子百粒质量/ g Hundred seed weight 10.67 4.30 6.10 24.20 18.10 40.27 1.45 发芽率/% Germination rate 71 27 0 100 100 37.69 1.79 种子活力指数 Seed vigor index 48.63 46.71 0 294.66 294.66 96.04 1.74 子叶长/ cm Cotyledon length 4.82 0.63 3.70 6.60 2.90 13.05 1.78 子叶宽/ cm Cotyledon width 3.38 0.42 2.40 4.90 2.50 12.47 1.83 出苗率/% Emergence rate 81 20 19 100 81 24.72 1.28 幼苗期/ d Seedling stage 20.75 1.29 16.00 24.00 8.00 6.20 1.14 壮苗指数 Seedling index 0.38 0.15 0.08 0.89 0.81 40.29 1.91 首雄花节位 First male flower position 4.28 1.60 2.00 8.00 6.00 37.45 1.74 主蔓粗/ mm Main stem width 9.51 1.77 5.21 15.35 10.14 18.61 1.78 叶片长/ cm Leaf length 32.32 4.52 23.40 47.40 24.00 13.98 1.76 叶片宽/ cm Leaf width 32.18 4.52 20.80 45.70 24.90 14.04 1.86 叶柄长/ cm Petiole length 29.30 5.46 18.90 45.50 26.60 18.65 1.81 叶柄粗/ mm Petiole width 10.86 2.07 7.12 18.09 10.97 19.04 1.71 瓜梗长/ cm Stalk length 10.21 2.18 4.20 15.50 11.30 21.34 1.69 瓜梗横径/ mm Stalk width 12.07 2.05 8.53 24.00 15.47 17.00 1.54 瓜肉厚/ cm Flesh thickness 2.53 0.69 1.00 4.50 3.50 27.09 1.69 老瓜纵径/ cm Fruit vertical diameter 11.80 3.59 6.90 35.20 28.30 30.40 1.24 老瓜横径/ cm Fruit longitudinal diameter 14.10 2.85 8.00 21.90 13.90 20.18 1.66 单瓜质量/ g Single fruit weight 1.35 0.78 0.41 5.46 5.05 57.64 1.33 2.2 SSR标记分析 以144对SSR引物对5份差异较大的砧用南瓜材料进行扩增，发现有40对引物能够得到清晰、 稳定、具有多态性的扩增条带。40对多态性SSR标记共检测到167个等位变异(表4)，变幅2 ~ 8 个，平均每个标记4.18个。其中标记CMTp148、CMTm11、CMTm63检测到的标记最多，标记 CMTp107、CMTp125、CMTp177、CMTp191、CMTp224、CMTm181、CMTm181、CMTm221、CMTmC30 检测到的标记最少。多态性SSR标记的多样性指数的变化范围为0.16 ~ 1.18，平均值0.62。其中多 样性指数最低的SSR标记为CMTp177，最高的为CMTm11(图1)。图1中共有8条多态性条带， 其中12、47号种质具有两条其他种质都没有的条带，同时又缺失两条其他种质共有的条带。 表4 多态性SSR标记的基本信息 Table 4 Basic information of polymorphic SSR primers SSR引物 序列 Sequence 编号 多态带数 多样性指数 No. Polymorphic fragments H ’ SSR primer 正向引物 Forward primer(5′–3′) 反向引物 Reverse primer(5′–3′) 1 CMTp47 AAACGGTTGAGGAGGATGAC AGGTCATTTGGCGTGATAACT 4 0.95 2 CMTp53 ACAACCATCACAACGCTTTC TTGGAATCAGTTCCAGTTCG 3 0.62 3 CMTp55 GCATTTCACTCCCGATTCTC GTCTCGGAAATCCAATCCAC 6 0.86 4 CMTp62 GTGCCCGTCAGTCGGAAT TGTCGACGAAGATAGCAATAGCA 4 0.43 5 CMTp91 TTTGGATTGAGTGTTCATCG CGGACAACATACCCAAAATAG 3 0.61 6 CMTp97 CCACACACCAATCGTTGAAG CGCAGAATCTCGAAACACAA 7 0.74 7 CMTp107 CGATGATGAACAGGAAGACG TCACATCCATTCCCCTCTCT 2 0.28 8 CMTp125 CTTGTTCCGCAGCATCAG AGTGAGAGGGAGACGCAAAG 2 0.38 9 CMTp130 GCCCATTTCTGGAGAGATAGTA GAGGAGAGATGCAGAGCAAC 4 0.55 10 CMTp138 AAAGGTTTCCACATCCTTG GAAAAGGAAAAAGTGTTCAAAG 4 0.46 11 CMTp148 TGAAGACAGCAAGCAGGAAG GCTTGGTTGGTTTCTTTGCT 8 1.15 12 CMTpl69 TGCAGTGAATGGAAACCTGT TCCGGCATTATAATCAGAACC 4 0.63 13 CMTpl77 AGCCAAACCAGCATCGAAAT CGACGATGTCAAACCTCCAC 2 0.16 14 CMTp191 AAAGGGTACCTCGCTGTGTG TTTGCAGTACGCTGCAGAAC 2 0.52 15 CMTp201 AGGAGTGGTGGGCTAATACG TGAAATTGAGGGAGGGAGAG 6 0.89 16 CMTp224 CACCGACGACTCCATCATC CTTCTTGTCCCCAAAATCACA 2 0.24 1386 园 艺 学 报 41卷 续表4 SSR引物 序列 Sequence 编号 多态带数 多样性指数 No. Polymorphic fragments H ’ SSR primer 正向引物 Forward primer(5′–3′) 反向引物 Reverse primer(5′–3′) 17 CMTp263 CAGGCTATTCGCACCCTCTA CCTCATGCATTTTGCGTGTA 5 0.56 18 CMTm5 TTTCTCGAGCCTCAC ATGGACAATTTGGATATTA 5 0.95 19 CMTm11 TGGAAGGATTCTCCCACAGT TACAATTTGACGTCCGCAAG 8 1.18 20 CMTm19 GCATGGGAGATGAAGGTTAG ATTTCCTGGTGGTATGAGATTC 5 0.72 21 CMTm20 GTGGGCCATATCGATTCACT CGAAAGTCGCAGAGAACACA 5 0.79 22 CMTm50 CAGTGTTCCTCTCCCCATTC TCGGACTCTGAACTTGACCA 3 0.43 23 CMTm62 AGTGAGGGAGGCGACAACT GAACGTGTCCATGTCATTGC 3 0.32 24 CMTm63 GCAGAAGATACCGTCGGAGT AAGGTGAACGGGAATGTGAG 8 0.63 25 CMTm66 ACGCGTTGTTGTTAGTGTGG GGGGATTTATGAACCCAACAT 3 0.51 26 CMTm90 TGAAGCATTAAAAATGGGTGTG ACACATTGCCCACTAATTCTAGG 5 0.84 27 CMTm121 CCCAAATTCAAAAGAAAATC CCAGTTAAATCAGACCGAAT 3 0.44 28 CMTm133 CGACGTATGATCGAGCCTCT TGCTAAGCCGTTGTCATCTCT 4 0.60 29 CMTm144 ACATGGGCATACCTCGAATC CACCTGGCTGTTTTGTCTGA 3 0.29 30 CMTm158 CCCAGCTATGAAGGTCTCTG AAAAGCACAAAAGAAACACCA 5 0.82 31 CMTm165 TTCCAGACCCAATTCCCTTA TCCATGGAGATGGGAGGTAG 5 0.97 32 CMTm170 TCAGACCCACTCCCATGAAC AGCGAACACGTGAAAACGTC 5 0.97 33 CMTm181 CCCTTAAGGTCTCGCAGCTT TATTAGGCGGACGGACAGG 2 0.60 34 CMTm183 CTTTGCATTGCCACTCTTCT TGAGGGAAATTGAATGTGGT 4 0.68 35 CMTm209 ATTAGAATCCCTTGGAGAACG GCAATCGTTTTTCTGTTGGT 6 0.59 36 CMTm214 TGCTTTGATCAGTGAGCAGT GGATGTACTCTCCGGACTTTC 4 0.56 37 CMTm221 CAATAAGATAGCTCTCACGTTGC TGCCTAGTTATCGCGACTTC 2 0.43 38 CMTm248 TGATCATGAAAGGGGGAGAG CCACTTCAAGCTTGCCTTCT 4 0.34 39 CMTmC1 AACGTCCTTACTGGCACACC TTCCACAAGTTGTTTTGGTCAC 5 0.85 40 CMTmC30 TCAAACACTTTCTTTGGAAGGA TTTCATTGAACTGGGTCAAGCG 2 0.24 图1 引物CMTm11在47份砧用南瓜材料上的PCR扩增图 Fig. 1 PCR amplification profile in 47 varieties by primer CMTm11 in rootstock-used pumpkins 2.3 聚类分析 依据欧式距离，对47份砧用南瓜种质资源的所有形态学性状进行UPGMA聚类分析，绘制聚 类树状图(图2)。当阈值为1.02时，47份材料划分为4个类群。其中，第?类群中包含了大部分 的品种，共有40份种质，占85.11%;类群?只有1个品种(34号);第?类群中有4个品种，分 别为2、7、30、44号材料;类群?中为12和47号材料。类群?全部为中国南瓜，类群?和?为白 籽南瓜，类群?为黑籽南瓜。在4个类群中，根据对形态性状的测量和观察(具体数据未列出)，类 群?种子均无光泽、多数质量较轻，能结实，植株长势中等;类群?种子白色、有光泽，能结实， 植株长势较强;类群?种子均为白色、有光泽，雄蕊败育，未结实，植株长势较强;类群?少雌花， 结实率极低，植株长势前期强后期弱。在3个类型的南瓜中，白籽南瓜(类群?、?)的植株长势 7期 李 鹤等:砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 1387 最强，暗示其作为砧木嫁接，可能会增强嫁接苗的长势。 当阈值为0.90时，第?类群还可以划分为3个亚类群:亚类群?-i包括37个品种，亚类群?-ii 中有2份材料(23、24号)，亚类群?-iii中只有25号材料。第?类群又划分为两个亚类群:亚类群 ?-i中包括2号和7号材料，亚类群?-ii中有30号和44号材料。类群?和?没有划分出亚类群。 图2 砧用南瓜种质形态学性状聚类树状图 Fig. 2 Dendrogram by cluster analysis based on phenotype of rootstock-used pumpkin germplasms 利用SSR标记，将47份砧用南瓜种质的遗传相似系数按UPGMA法进行聚类分析，得到聚类 树状图(图3)。在GS = 0.83水平上聚为3类。类群?同样包含40个品种(与形态学性状聚类结果 相同)，类群?中有5个品种(包括了图1中的类群?和?)，类群?中含有2个品种(同图1中的 类群?)。类群?、?、?分别为中国南瓜、白籽南瓜和黑籽南瓜。当GS = 0.90时，类群?分为两 个亚类群:亚类群?-i包括39个品种，亚类群?-ii中只有8号1份材料;类群?分为4个亚类群: 亚类群?-i中有2个品种(2号和30号)，44、34、7号分别归属于亚类群?-ii、iii、iv;类群?分 为两个亚类群，亚类群?-i(12号)和?-ii(47号)。在统计的167个条带中，类群?、?分别有 30、42个特异性条带，占总条带数的18.0%和25.1%。 中国南瓜的分类中，形态标记将23、24号分为一类，25号分为一类，其他的37个品种分为一 类;分子标记将8号分为一类，其他的39个品种分为一类。白籽南瓜的分类中，形态标记将34号 分为一类，2、7号分为一类;30、44号分为一类;分子标记将2、30号分为一类，44号、34号、7 号各成一类。黑籽南瓜的分类中，形态标记仍将12、47号分为一类，而分子标记将这两个品种分成 两类。可以看出，对于中国南瓜来说，分子标记比形态标记少划分出3个品种;对于白籽及黑籽南 瓜来说，分子标记比形态标记都多划分出1个品种。也许是因为选用的SSR标记对于黑籽及白籽南 1388 园 艺 学 报 41卷 瓜比中国南瓜具有更强的分辨能力。总之，形态标记与分子标记的聚类结果对于大部分品种是一致 的，只有个别品种的聚类结果不同。 图3 砧用南瓜种质SSR标记聚类树状图 Fig. 3 Dendrogram by cluster analysis based on SSR markers of rootstock-used pumpkin germplasms 3 讨论 形态性状的鉴定和描述是种质资源研究最基本的方法和途径，是种以上或种内分类不可缺少的 重要依据之一(Horejsi & Staub，1999)。南瓜具有极其丰富的多样性(王鸣，2002;张岩 等，2010)。 本研究中，数量性状的变异系数变化范围为6.20% ~ 96.04%，变异系数大于40%的性状有种子活力 指数、单瓜质量、壮苗指数和种子百粒质量。质量性状多样性指数的变化范围为0.18 ~ 1.45，其中， 嫩瓜皮色、瓜形、主蔓色、瓜面斑纹、叶面白斑、叶形、嫩瓜斑纹、嫩瓜斑纹色的多样性指数大于 1.00。可以看出，在诸多质量性状中，果实相关性状的变异幅度较大，这与刘超(2012)的结论一 致。63个形态学性状多样性指数变异范围为0.18 ~ 1.14，平均1.10，数量性状的多样性指数普遍高 于质量性状，前人关于黄瓜(Szamosi et al.，2010)及甜瓜(胡建斌 等，2013)的报道中也有类似 的结论。由于嫁接是在砧木苗期完成的，因此在形态学性状中更加关注的是种子活力指数、壮苗指 数、幼苗期、发芽率、出苗率等与种子发芽和幼苗生长有关的性状，但幼苗期、发芽率、出苗率的 变异系数较小，在实际砧木筛选利用中难以用来区分品种优劣，而种子活力指数、壮苗指数的变异 系数大于40%，可作为砧木筛选利用的参考指标。种子活力指数高表明种子发芽能力强，砧木壮苗 指数大表明幼苗健壮，是嫁接苗健壮生长的保障。本试验中种子活力指数最大的是13号品种，壮苗 指数最大的是25号品种，但还不能判定这2个品种就是适于黄瓜嫁接中优良的砧木品种，还要考察 其与黄瓜的亲和性以及嫁接后对植株生长、产量、品质的影响等。 本研究从144对SSR引物中筛选出40对多态性引物，每对引物平均扩增出4.18条多态性条带， 7期 李 鹤等:砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析 1389 高于刘超(2012)及向成钢等(2013)在南瓜亲缘关系分析中检测到的平均每个位点2.48个及3.4 个等位基因。类群?、?分别有18.0%和25.1%的特异性条带，可见类群?、?与类群?亲缘关系 较远。8号种质有8条不同于类群?中其他种质的特异性条带，所以8号种质与类群?中的其他39 份种质被划分成两个亚类群。 前人根据不同作物的特点，对资源多样性评价和分类研究时发现，从形态和分子水平对资源划 分类别不尽相同(Lahoz et al.，2011)。然而，以往从分子水平与形态水平对南瓜资源进行分析，发 现形态水平与分子水平对资源的分类虽然并不完全相同，但都具有极高的相关性(刘超，2012)。本 研究中也发现，在形态学标记与SSR标记进行大类划分时，其结果几乎没有差别(只有1个品种有 差别)，即黑籽南瓜、白籽南瓜和中国南瓜都被归入不同类群;当进一步进行分类时，差别才逐步显 现。此外，根据前期试验结果，对非生物胁迫(高温、低温、盐碱)抗性较强的砧用南瓜品种在各 大类群中均有分布，在亚类群中的分布并未发现规律。 从形态学性状和SSR标记分析的结果综合来看，本研究中收集的砧用南瓜种质的遗传基础相对 狭窄，主要集中在同一个大的类群(中国南瓜)中，亲缘关系较近，遗传多样性较低。也许是因为 在育种过程中不同栽培品种因其共同的育种目标，多样性逐渐降低(Montilla et al.，2013)，今后应 扩大种质资源的收集范围。不过，仍有一小部分品种与大部分品种亲缘关系较远或具有独特、优秀 的性状，可进行有针对性的保存和利用。同时本研究中发现SSR标记CMTm11具有极高的多态性， 可用于今后砧用南瓜种质分子标记辅助选择;并发现嫩瓜皮色等8个质量性状和大部分数量性状都 可以作为形态标记，辅助砧用南瓜的种质评价及新品种的选育。 References Cucurbita Ahamed K U，Akhter B，Islam M R，Ara N，Humanuan M R. 2012. 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