盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存

盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存 () 植 物 学 报 2000 , 42 4:399 - 402 Acta B ota nica Si nica 盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存 王起华 张恩栋 李大鹏 程爱华 ( )辽宁师范大学生物系 , 大连 116029 ( () ) ( 摘要 : 采用两步法冷冻技术超低温保存盐生杜氏藻 Dunaliella salina DunalTeod. 和青岛大扁藻 Platymonas hel2 ) () golandica Kylin var. tsingtaoensis。当二甲基亚砜 DMSO浓度分别为 5 %和 20 % ,平衡时间均为 30 min ;预冻温度及 保持时间分别为 - 40 ?,60 min 和 - 30 ?,30 min ;化冻后分别在 0 ?和室温下采用慢速稀释法去除 DMSO 时 ,盐生 杜氏藻和青岛大扁藻都达到了最高存活率 ,分别为 6815 %和 7813 % 。 () 关键词 : 盐生杜氏藻 ; 青岛大扁藻 ; 超低温保存 液氮 () 文章编号 : 057727496 20000420399204 中图分类号 : Q33 文献标识码 : A Cryopreservation of D u naliella s ali na and Platymonas helgola ndica var . tsi ngta oe nsis WANG Qi- Hua , ZHANG En- Dong , L I Da- Peng , CHENG Ai- Hua ( )Department of Biology , Liaoning Normal University , Dalian 116029 , China ( ) Dunaliella salina Dunal Teod. and Platymonas helgolandica Kylin var . tsingtaoensis were Abstract : cryopreserved in liquid nitrogen with a two- step cryopreservation method. With 5 % and 20 % dimethyl2 () sulphoxyde DMSOconcentration respectively through 30 min equilibrium time , and under - 40 ?, 60 min and - 30 ?, 30 min respectively as prefreezing temperature and sustained time , and by using slow dilution method to remove DMSO from the sample at 0 ?and room temperature respectively after sample thawing , D . salina and P. helgolandica var . tsingtaoensis gained the highest survival rates that were 68 . 5 % and 78 . 3 % respectively. ()Key words : Dunaliella salina ; Platymonas helgolandica ; cryopreservation liquid nitrogen 13 ,18 近 50 年来 , 由于超低温保存技术的建立和发 剂时 ,存活率很低。本文对盐藻的两步法超低展 ,已有多种植物的细胞 、组织和器官实现了超低温 温保存技术作了进一步探讨 ,在 DMSO 毒性实验基 (冰冻保存 。已有研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明 ,在超低温 通常指液氮温 础上优选出适用于冷冻保存的最适 DMSO 浓度和平 ) 衡时间 ,并对保护剂的去除方法及预冻温度和预冻 度 , - 196 ?条件下 , 细胞的全部代谢活动近于完 时间作了优化 ,以探讨用较简便的操作方法获得较 全停止 ,因而可以保持种质的遗传稳定性 ,达到长期 1 - 10 高存活率的各种可能途径 。同时 ,本文还报道了大 保存的目的。近年来随着微藻在海产养殖中 扁藻的冷冻保存方法 。 的广泛应用 ,采用超低温技术保存海洋饵料微藻也 11 - 14 日益受到关注。盐藻和青岛大扁藻都是重要 1 材料和方法 的饵料微藻 。对盐藻冰冻保存的研究表明 ,采用高 1 . 1 材料及其培养 盐培养基培养和经过冷驯化后 ,使用高浓度甘油作 ( () ) 盐生杜氏藻 Dunaliella salina DunalTeod. 和15 ,16 保护剂时可获得较高的存活率,但该方法既费 ( 青岛大扁藻 Platymonas helgolandica Kylin var . tsing2 16 时又费 力 , 操 作 过 程 十 分 繁 琐。而 二 甲 基 亚 砜 ) taoensis藻种由中国科学院海洋研究所提供。 实验 14 () DMSO由于其穿透能力大大高于甘油 ,因此在操作 材料培养条件参见王起华等。取静止初期的培 上要简便得多 ,并已证明对多种海藻有良好的保护 养材料用于冰冻保存 。12 ,17 - 19 。但已有研究表明 ,DMSO 对藻类有一 效果 1 . 2 DMSO 毒性实验 19 ,20 () 定的毒性,而且将 DMSO 用做盐藻的冰冻保护实验在室温 17 ?2?下进行 ,参照 Canavate 及 收稿日期 : 1999205227 接受日期 : 1999211205 () () 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 39470065。Foundation item : The National Natural Science Foundation of China 39470065. 20 时间的影响相对要小得多 。 Lubian 方法。 1 . 3 两步法冷冻 () 表 1 二甲基亚砜 DMSO浓度和处理时间对藻类生长的影 11311 DMSO 的加入和冷冻 在室温下离心收获 3 响 藻类 ,用新鲜培养基再悬浮至所需密度 ,取 1 mL 藻 () Ta ble 1 Effect of dimethylsulphoxyde DMSOconcentrations and 3treatment time on the algae growth 液于 2 mL 冻干管中 ,再加入 1 mL 预先配制的为所 DMSO 需浓度 2 倍的 DMSO 溶液 ,混匀 ,平衡不同时间后 , ()Treatment time min concen2 Algae ( ) 移入 KF- 4 型低温浴槽 辽阳恒温仪器厂制,以 016 tration 10 40 70 ( )% ?/ min 速率降温至 - 30 , 停留 15 min ,移入液氮 ?0 100 中 。 5 9219 ?11713 ?316 11 ?019 8786Dunaliella salina 11312 化冻和 DMSO 的去除 将在液氮中保存 248812 ?9126914 ?6176213 ?21810 20 3019 ?211 2014 ?417 1918 ?015 h 的冻干管取出 ,立即放入 40 ?恒温水浴中迅速摇 0 100 Platy2 动 ,直到最后一个冰晶消失后分别移入室温和 0 ? 5 9814 ?1109111 ?718 15 ?015 89monas hel2 冰水浴中 ,如表 3 所述 ,按不同方式用培养基稀释样 10 89788611 ?61112 ?41711 ?711golandica var . tsing 20 7912 ?1147218 ?1136910 ?211 品 。taoensis 30 31292412 ?41810 ?41812 ?412 11313 预冻温度和预冻时间 预冻温度分别设置( ) 3 Data are average ?SE standard errorof the survival rates , using dilution ( ) method A see Table 3at room temperature . - 30 ?和 - 40 ?。预冻时间为在所需预冻温度下 停留的时间 ,分别为 0 、15 、30 和 60 min 。 2 . 2 DMSO 浓度和平衡时间对存活率的影响 12 11314 存活率的测定 参照 Canavate 及 LubianDMSO 加入后 , 通常需要一定的平衡时间使其 的方法 ,将稀释后的经过冰冻保存处理的藻细胞样 渗透 到 细 胞 内 , 在 室 温 下 常 用 时 间 为 15 , 30 11 ,17 ,18 品与未冰冻的对照藻细胞样品进行再培养 。盐生杜 min,因此 ,我们比较了 15 和 30 min 的处理效 氏藻再培养 4 d ,青岛大扁藻再培养 7 d 后测细胞密 果 。结果如表 2 所示 , 使用 5 % DMSO 平衡 30 min 度 。根据预先完成的不同接种密度的未经冰冻处理 时 ,盐 生 杜 氏 藻 可 获 得 最 大 存 活 率 , 为 23 % , 这 和 18 的藻细胞的生长曲线可以推算出上述冰冻样品和对 Ben-Amotz 及 Gilboa 在相似条件下所得到的存活 照样品在再培养开始时所具有的活细胞密度 。二者 率相近 。在同样条件下保存 Platymonas suecica 时 , 的百分 比 值 即 为 冰 冻 保 存 的 存 活 率 , 详 见 王 起 华 Ben-Amotz 报道了 20 %的存活率 。目前尚未见冷冻 14 等。 保存 青 岛 大 扁 藻 的 报 道 。我 们 的 结 果 表 明 , 使 用 上述实验至少重复 2 次 ,每次实验设置 3 个平20 % DMSO 平衡 30 min 时 ,青岛大扁藻的存活率可 行样品 ,除特殊说明外 ,文中数据为 6 个平行样品的 达到 42 % 。 平均值及 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差 。 () 表 2 二甲基亚砜 DMSO浓度和平衡时间对冰冻保存存活 2 结果和讨论 率的影响 () Ta ble 2 Effect of dimethylsulphoxyde DMSOconcentrations and 2 . 1 DMSO 毒性实验 their equilibrium time on the cryopreservation survival rates DMSO 浓度和处理时间对盐生杜氏藻和青岛大 DMSO ()Equilibrium time min Algae concentration 扁藻的生长的影响表明 ,DMSO 对两种藻都有一定 15 30 ( ) % ( ) 0 - 13 ?219 9的毒性 ,毒性大小随 DMSO 浓度的增加和 或作用 Dunaliella 231810 ?21110 ?2195 时间的延长而加大 。而且盐生杜氏藻比青岛大扁藻 salina 10 1518 ?013 1116 ?213 19 ( ) 对 DMSO 更敏感 表 1。这一结果与闫立强等、 0 - ?113 9 . 6 Platymonas hel2 20 19 Canavate 及 Lubian的 结 果 相 似 。闫 立 强 等发 10 1214 ?2171518 ?213golandica var . tsingtaoensis 20 2313 ?3124210 ?218现 ,DMSO 对两种蓝藻的毒性大小既与藻类种类有 Data are the average ?SE of the survival rate , with the sample not added 20 关 ,也与 DMSO 浓度有关 。Canavate 及 Lubian对 6 ( DMSO in and not cryopreserved as the control , using dilution method A see ) Table 3at room temperature . 种分类系统不同的海洋微藻的深入研究进一步表 2 . 3 DMSO 去除方法对存活率的影响明 ,DMSO 毒性大小还与其作用时间有关 。我们的 我们 比 较 了 不 同 稀 释 温 度 和 稀 释 速 率 去 除实验结果指出 ,DMSO 的使用浓度对盐生杜氏藻不 ( ) 能超过 10 % ,对青岛大扁藻应在 20 %以内 。而处理 DMSO对两种藻冰冻保存存活率的影响 表 3 ;图 1。 401 4 期 王起华等 : 盐生杜氏藻和青岛大扁藻的超低温保存 结果表明 ,稀释温度对存活率的影响极大 ,青岛大扁 选择 ,而稀释温度和稀释速率可能是影响存活率的 藻在室温下稀释效果较好 ,而盐生杜氏藻需要在 0主要因素之一 。 ?下稀释才有较高的存活率 。稀释速率对存活率也 214 预冻温度和预冻时间对存活率的影响 有一定的影响 。在适宜的稀释温度下 ,分步慢速稀 在藻类两步法冰冻保存中 ,常用的预冻温度为 释要优于一步快速稀释 。 - 25 ?, - 50 ?, 常 用 的 预 冻 时 间 为 0 , 60 11 ,16 ,18 ,22 min。我们的实验结果表明 ,预冻温度和预 ()表 3 用稀释法去除二甲基亚砜 DMSO ( )dimethylsulphoxyde DMSO Ta ble 3 Removal of by dilution 冻时间均影响两种藻的存活率 ,其中预冻时间影响 method 极大 。盐生杜氏藻在 - 40 ?下预冻 60 min 时可达 Dilution method Operation protocol 到最 高 存 活 率 。而 青 岛 大 扁 藻 在 - 30 ?预 冻 30 ( )A rapidly 012 ?2016 15 ( ) ( )() ( ) 012 ?014 5?018 5?116 ?5?516 ?5 () min 时存活率较高 表 4。Levy 及 Zamir 用甘油作 ()B gradually ?2016 保护剂保存盐藻时 , 曾在 - 80 ?预冻 18 h 下获得( ) ( ) ( ) 012 ?014 10 ?018 ?10 ?116 10 ?516 () 10?2016 ()C gradually 50 %,100 %的存活率 。我们的实验结果也表明 ,采 Diluting at 0 ?or room temperature . The numerals before the brackets stand 用较低的预冻温度和较长的预冻时间对保存盐生杜 () for the dilution volume mL,and those in the brackets stand for the sustained () 氏藻是有利的 。time min. 微藻的冰冻保存目前普遍采用两步冷冻法 。这 是由于两步法操作较简单 ,不需要贵重的程序降温 设备 ,而且在优化条件下同样可以获得较高的存活 18 ,2222 率。Leeson 等曾指出 ,影响两步法冰冻保存 效果的主要外部因素包括预冻温度 、预冻时间 、降温 速率 、化冻速率和抗冻保护剂的种类 、浓度和使用方 法等 。如前所述 ,我们用 DMSO 做保护剂 ,采用优化 的两步法冷冻技术冰冻保存盐生杜氏藻和青岛大扁 藻都获得了高达 50 %以上的存活率 ,已达到长期保 15 存所 要 求 的 指 标 。与 Levy 和 Zamir和 Mortain- 16 Bertrand 等保存盐藻的方法相比 , 我们不需对盐 生杜氏藻进行高盐培养和冷驯化 ,也避免了使用高图 1. 稀释温度和稀释速率对冰冻保存存活率的影响 。 浓度甘油做保护剂所带来的操作上的繁琐和不便 。 Fig. 1. Effect of dilution temperature and dilution rate on the cry2 opreservation survival rate . 而关于青岛大扁藻的超低温保存 ,本文首次作了报 () For Dunaliella salina using 5 % dimethylsulphoxyde DMSO, for Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis using 20 % DMSO , the 道 。我们还证实了在去除 DMSO 时 ,稀释温度和稀 equilibrium time is 30 min for both of them. A , B , C mean dilution 释速率对存活率有很大的影响 ,这是藻类超低温保 ( ) method see Table 3. Others are the same as in Table 2. 存研究中一个值得进一步探讨的问题 。 在藻类冷冻保存中使用 DMSO 作保护剂时 ,对 表 4 预冻温度和预冻时间对存活率的影响 11 ,12 ,17 ,18 其使用浓度的研究较多,而对其去除方法 Ta ble 4 Effect of prefreezing temperature and sustained time on the survival rate 的 研 究 很 少 , 通 常 都 采 用 室 温 下 一 步 快 速 稀 释 11 ,12 ,17 法,关于稀释温度和稀释速率对存活率的影 Prefreezing ()Sustained time min Organ2 temperature isms 响尚未见报道 。在高等植物细胞的冷冻保存研究 0 15 30 60 ( ) ? 中 ,DMSO 等保护剂的去除通常在接近 0 ?的较低 - 30 - - 4813 ?511 - Dunaliella salina 温度下进行 ,认为低温可以降低细胞代谢活动并减 - 40 2913 ?018 5215 ?517 5710 ?215 6815 ?515 少保护剂毒性从而提高细胞稳定性 。但 Finkle 及Platymonas - 30 1117 ?012 4914 ?313 7813 ?1013 7117 ?516 21 helgolandica Ulrich却发现甘蔗和水稻细胞在 0 ?下去除保护 var . () 剂是有害的 ,而在室温 22 ?下可获得较高的存活 - - - 14 ?612 44- 40 tsingtaoensis 率 。这说明不同的实验材料对保护剂的去除方法有 () For Dunaliella salina using 5 % dimethylsulphoxyde DMSOusing method B ( ) see Table 3for dilution at 0 ?; for Platymonas helgolandica var . tsing2 不同的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 。我们的实验表明 ,在藻类细胞冰冻保 ( ) taoensis using 20 % DMSO , diluting by method C see Table 3at room tem2 perature. The equilibrium time is 30 min for both of them. Others are the 存中 ,DMSO 的去除方法应根据藻类材料的特点来 same as in Table 2 . )Chinese 参考文献 : 11 ] Fenwick C , Day J D. Cryopreservation of Tetraselmis Kartha K K. Cryopreservation of Plant Cells and Organs. 1 ] suecica cultured under different nutrients regimes. J Appl Boca Raton , Florida : CRC Press Inc ,1985. Phycol , 1992 ,4 :105 - 109. ( ) Jian L- C 简令成. The Cryopreservation of Germplasms.2 ] 12 ] Canavate J P ,Lubian L M. Some aspects on the cryopreser2 () ( ) Chen W-L 陈维伦, Tao G- Q 陶国清. Plant Biotech2 vation of microalgae used as food for marine species. 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