动物实验方法学

动物实验方法学 2、我国动物实验研究方面的概况 动物实验方法学课件 3、我国动物实验研究方面目前存在的问题 (1)研究人员缺乏必要的动物实验知识和训练 (2)用于实验的动物品种品系少 绪论 (3)用于实验的动物质量和笼器具质量有待提高 (4)动物使用率低 动物实验是根据研究目的，恰当地选用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的符合实验 (5)动物实验技术人员缺乏 要求的实验动物，在设计的条件下，进行各种科学实验、(二)动物实验的发展趋势 观察、记录动物的反应过程或反应结果，以探讨或检验 1、使用动物数量不断下降 生命科学中未知因素的专门活动。 2、使用动物的质量不断提高 动物实验是人类生存和发展的必要手段。 3、使用动物的种系不断增加 动物实验方法是进行动物实验时的各种实验手段、技术、 4、动物实验模型走向商品化 方法和标准化操作程序。同时也探讨实验动物科学中的 5、注重动物福利:减少、替代和优化研究不断深减少、替代、优化问题。 化和发展 一、从生物医学的发展历程看动物实验的重要性 (一)Replacement: 替代(三个系统) 动物实验是生物医学研究和教学的基本手段之一。 1.、生命系统 生物医学的每一次重大发展与进步，都与动物实验相关。 2、非生命系统 动物实验是现代生物医学研究的主要手段。许多医学新 3、电脑模拟实验动物与动物实验 知识的获得、医疗新技术方法的应用都得益于动物实验。 (二)Reduction:减少 动物实验已成为人类征服自然、保护自己的重要手 1、提高动物质量 段之一。通过动物实验，人类在不断探索防御疾病的一 2、改进统计学设计 切可能途径。通过一项项动物实验，一个个生物与人体 3、使用低等动物，代替高等动物 秘密被揭开，一种种疾病的病因和转归被弄清，防治办 4、使用高质量动物 法被找到。 (三)Refinement:优化 实验动物——功不可没 1、改良仪器设备 动物实验——永载史册 2、减少对动物的侵扰。 二、动物实验技术发展史 3、进一步控制疼痛 动物实验技术发展的四个时期: 4、改进保定动物技术 1、活体解剖期:公元前4世纪至公元3世纪 Aristotle Erasistratus Galen 第一章 有关实验动物的基本知识 2、停滞期:公元3世纪至16世纪初 3、辉煌时期:16世纪初至19世纪末 第一节 实验动物的品种品系介绍 4、突飞猛进期:20世纪初至今 小鼠 三个里程碑 大鼠 近交系动物 豚鼠 无菌动物 兔 转基因动物 犬 1980年度诺贝尔医学奖:组织相容性基因发现 第二节 实验动物的分类和培育 1984年度诺贝尔医学奖:单克隆抗体的发现 一、实验动物的遗传学分类 1996年度诺贝尔医学奖:T淋巴细胞识别入侵微生物的二、实验动物的微生物学分类 发现 第三节 实验动物主要脏器和腺体的位置与形态特征 动物保护运动兴起 一、主要脏器的位置与形态特征 1975年澳大利亚哲学家Peter singer 《动物解放》 1、肺:肺是呼吸系统的重要器官，是血液与外界气体三、动物实验研究的现状及发展趋势 交换的场所。 (一)动物实验研究的现状 肺的一般结构:浆膜，肺实质，肺间质 1、国外动物实验研究方面的现状 肺内导气部:小支气管、细支气管及终末支气 管 家兔回肠和盲肠相连处有一膨大的圆囊，称圆小囊(淋 肺的呼吸部:细支气管、肺泡管、肺泡囊和肺巴球囊)，是兔特有的。盲肠发达。 泡 5、胰腺 大鼠:右肺分四叶，即尖叶、心叶、膈叶和副叶。 胰是动物体内较大的腺体，呈不规则三角型。表左肺仅一叶，左右胸腔以纵隔膜分开。 面被以少量结缔组织构成的被膜。结缔组织伸入实质， 豚鼠:右肺比左肺大，由尖叶、心叶、副叶将其分为许多叶和小叶。胰腺有内分泌部(胰岛)和外 和膈叶组成。左肺分三叶:尖叶、心叶和膈叶。豚分泌部(腺泡和导管)。 鼠肺部的淋巴组织丰富。 6、脾 兔:右肺比左肺大，分叶左三右四。右肺的副叶位豚鼠:胰头的大胰腺管是各叶的小管汇合管，开口于十于心脏的背侧，介于两肺叶之间 ，容积仅为全肺的二指肠升部，距胆总管开口7mm。 5.81%。 兔:胰导管是一条薄壁的小导管，从胰腺右叶发出并立、心脏: 即进入十二指肠后段三分之一处。 2 心脏的组织结构:心脏分左、右心室和左、右心房，犬:胰腺一般有两个胰腺管。小胰管开口于胆总管开口心室和心房的壁都由三层膜组成。内层为心内膜，中层的近旁，或与之合成一个开口。大胰管开口于胆总管开为心肌膜，外层为心外膜。 口后方约3~5mm。 心脏的传导系统:包括窦房结、房室结、房室束、7、肾脏 房室束到室间隔两侧的左右分反和左右分反的终支。 肾脏是主要渗透调节和排泄器官。通过泌尿排出代3、肝脏 谢产物并维持水、电解质、渗透压和酸碱平衡。还有分 肝是动物体内最大的消化腺，其分泌物为胆汁，经泌肾素、前列腺素等内分泌功能。肾的外层为皮质(肾胆管送入十二指肠。肝既能分泌胆汁，促进脂肪的分解小球、肾小管)，内部为髓质(收集管)。 与吸收;同时又是机体内物质代谢的重要器官。肝脏的8、生殖器官 表面被覆一层浆膜;浆膜深部为富含弹性纤维的致密结二、主要腺体的位置与形态特征 缔组织层，共同形成肝脏的被膜。被膜的结缔组织进入 动物体内具有两种分泌功能的腺体，一种腺体的分肝实质，将其分成许多肝小叶。肝小叶间的结缔组织为泌物经导管排出，如汗腺、副性腺、消化腺等。这类腺小叶间结缔组织。肝小叶是肝的基本结构单位，其主要体因具有导管，称为外分泌腺(或称有管腺)。另一类腺 体没有导管，其分泌物直接流入血液而分布至全身，这结构有中央静脉、肝板、肝小管、窦状隙和窦周隙。肝 种腺体称为内分泌腺(也称无管腺)。动物体内主要的内脏有很强的再生能力。 大鼠:肝脏分为四叶:左叶、右叶、中叶和尾叶。分泌腺有脑垂体、松果体、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肝再生能力强，切除60~70%后可再生。大鼠无胆囊，胰岛、肾上腺和性腺。 来自各肝叶的肝管口汇成总管，肝脏分泌的胆汁通过肝外分泌腺 总管再流入胆总管，然后进入十二指肠。 1、副性腺:包括精囊腺、前列腺、尿道球腺、凝固腺、 豚鼠:肝脏被深裂缝分成四个主要肝叶和四个小肝包皮腺、阴蒂腺等。 叶及两个深裂，包括方叶、左叶、右叶和后叶。胆囊位 凝固腺为雄性大鼠、小鼠、豚鼠所特有。附着于精于肝左叶和肝右叶中间、肝方叶的胆囊窝中。胆总管向囊腺内侧，呈半月形，是一种半透明的器官，其分泌物十二指肠走行，在距幽门5mm处进入十二指肠。 起着凝固精囊腺分泌物的作用，交配后形成阴道栓。 4、胃肠 前列腺为犬的唯一副性腺。 胃:哺乳动物的胃可分为单室胃和多室胃两大类。2、唾液腺:腮腺、颌下腺和舌下腺。 单室胃的胃壁可分为黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜四层。3、乳腺:小鼠有5对，雌性豚鼠只有1对。 腺部黏膜表面可见许多明显皱襞，纵横交叉。黏膜有上内分泌腺 皮、固有层和黏膜肌层组成。反刍动物的胃为多室胃。1、脑垂体:垂体是体内重要的内分泌腺，以漏斗与下丘多室胃分为没有腺体的前胃及有腺体的真胃(皱胃)，胃脑相连。垂体分泌多种激素，调节机体的功能。 壁也分为黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜四层。 大鼠脑垂体位于间脑腹面，视交叉后方，借垂体柄 肠:分类小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(结与丘脑下部相连。由于它是嵌在颅底基蝶骨的垂体窝内，肠、直肠)、盲肠 在剥脑时很容易被剥掉，常用于做脑垂体摘除手术。 豚鼠的盲肠特别膨大，长度约为15~17cm，约占腹腔的2、甲状腺和甲状旁腺 1/3。 大鼠:沿颈部中线分开颈部肌肉，在喉头的后方、 气管前端甲状软骨的两侧，可看到1对长椭圆形的甲状豚鼠 20~35 12~15/100g体重 15~75 腺，呈深红褐色。左右两端的甲状腺由横越气管腹面的50~90/kg兔 75~100 80~100/kg体重 峡部相联。紧贴每叶甲状腺前外侧面、呈微白色的小腺体重 体为甲状旁腺。 犬 250~1200 25~35/kg体重 65~400 小鼠:甲状旁腺位于甲状腺外侧附近，呈圆形或椭常见实验动物一般生理指标 圆形，很大。 动物 体温? 呼吸(次/分) 心率(次/分) 豚鼠:甲状腺扁平，卵圆形，暗红色，被菲薄的纤小鼠 37.0~39.0 84~230 324~800 维囊紧密地附着于第4~7气管环上，紧靠腮腺的外侧缘，大鼠 38.5~39.5 66~114 261~600 大部分缺峡部。甲状旁腺较小，常位于甲状腺动脉后侧豚鼠 37.8~39.5 110~150 260~400 附近，有的远离甲状腺动脉，而在甲状腺侧叶的中部和兔 38.5~39.5 38~60 123~304 外侧部。一般每侧各有两个甲状旁腺。 犬 38.5~39.5 14~28 100~130 兔:兔的甲状旁腺的位置分布有较大差异。 、肾上腺 3 大鼠:肾上腺呈豆状，质地结实，位于肾脏的前方 内侧，和腰下肌的腹面相接。 第二章 影响动物实验结果的因素及其控制 4、胸腺:胸腺既是机体的免疫器官，同时又具有内分泌 功能。 第一节 动物实验中个体反应差异产生的原因 大鼠:大鼠的胸腺由两叶组成，似三角形。大部分一、 机体反应受遗传和环境等复杂因素影响 位于胸腔前纵隔，顶端近喉部，基底部附着到心包腹面 基因型 的上方。新鲜的胸腺淡红色，表面不光滑，呈不规则的 发育环境 分叶状。大小与结构随年龄而变化。40~60日龄最大， 表现型 以后停止生长，并逐渐退化。 周围环境 免:兔的胸腺是一个轻而薄的腺体，呈浅粉红色， 演出型 位于胸廓内部，胸骨的内壁上，处在纵隔前部，相当于 影响动物性状的遗传和环境之间的关系 1~3肋软骨处。幼兔明显，成年兔易误认为脂肪。 2、动物实验公式 豚鼠:胸腺全在颈部，位于下颌骨角到胸腔入口的 R=(A+B+C) ×D+E 中间。由两个光亮的浅黄色、细长成椭圆形、充分分叶 式中:R,,实验动物的总反应 的腺体组成。随年龄增长而逐步退化和脂肪化。 A,,动物种的共同反应 三、特殊解剖构造 B,,品种及品系特有的反应 1、雄性犬具有阴茎骨，位于骨盆的腹则，阴茎的前 C,,个体反应(个体差异) 部。 D,,环境影响 2、地鼠口腔内两侧各有一个颊囊，从左右两侧的口 E,,实验误差 腔粘膜一直延伸到耳后颈部肩胛部的后方，由一层薄而第二节 影响动物实验结果准确性的因素 透明的肌膜构成，容量可达10cm?。颊囊缺少腺体和完影响动物实验结果准确性的因素大致可分为两大类:主整的淋巴通路。 观因素和客观因素。 3、长爪沙鼠:一个非常重要的解剖特征是脑底动脉主观因素:即人为因素，与实验者操作熟练程度、责任环后交通支缺损，没有联系颈内动脉系统和椎底动脉系心和判断力等有关。 统的后交通动脉，不能构成完整的Willis动脉环。腹部客观因素:动物及饲养环境、实验环境、仪器设备、药有一个卵圆形、棕褐色的无毛区域称腹标记线或腹标记品试剂等。 垫。 一、环境因素 第四节 常用生物学特性参数 环境因素是指影响动物进化、生态反应和生长的所有外不同动物的日消耗饲料量、需水量和排尿量 界条件总和。 日消耗饲料量日排尿量气候因素:温度、湿度、气流、风速等 动物 日需水量(ml) (g) ( ml) 理化因素:氧、二氧化碳、粉尘、臭味、噪音、照度、小鼠 3~6 3~7 1~3 杀虫剂、消毒剂、有害化学物质等 大鼠 10~20 20~45 10~15 居住因素:房屋、饲养笼具、垫料、给食器、供水器等 营养因素:饲料、水、蛋白质、矿物质、维生素等 3、检查与动物实验配套的实验条件、方法是否初步生物因素 到位。 同种生物因素:饲养密度、社会地位、势力范围等。 第一节 选择实验动物的基本原则 异种生物因素:微生物、人、其他动物。 一、相似性原则 二、动物因素 尽量选择研究对象的功能、代谢、结构及疾病性质与人种属 不同种属的动物对同一刺激反应不同 类相似的动物。 品系 同一种属的不同品系对同一刺激反应不同 1、组织结构方面 性别 2、系统机能方面 年龄 3、生理特性方面 疾病因素 4、繁殖特性方面 第三节 动物实验结果影响因素的控制 5、体液成分方面 要获得准确可靠、重复性强的动物实验结果，就必须对 6、解剖特性方面 影响因素进行人为控制，使各种非实验因素降低到最小 7、疾病特点方面 程度，使动物试验结果最大限度地反映出试验因素的反群体分布的相似性 应。 以群体为对象的研究课题，要考虑到选择与人群基因型从控制动物本身和环境条件而言，主要从遗传、疾病和及表现型分布类型相似的动物类别。 环境三方面进行。 操作实感的相似性 一、遗传控制 二、特殊性原则 二、疾病控制 选用解剖、生理特点符合实验目的要求的实验动物。 三、环境控制 动物实验的环境条件与实验动物饲养的实验动物具有的某些解剖生理特点，为实验所要观察的环境条件保持一致。 器官或组织等提供了很多便利条件。前面已介绍了各种技术因素 常用实验动物的解剖生理特点，熟悉这些特点，根据这为确保动物实验的成功，除去动物因素及环境因素外，些特点选择实验动物能简化操作，使实验易于成功。 实验者 选择的实验动物、实验时机、操作技术的熟练程三、根据实验动物不同品种、品系的特点选择动物 度等均不同程度的影响实验结果的准确性和可靠性。 不同种系实验动物对同一因素的反应有其共同的1、动物选择 2、实验季节 一面，但有的也会出现特殊反应。 3、昼夜过程 4、麻醉深度 不同药物或化合物，在不同种系动物上引起的反应5、手术技巧 6、实验用药 是存在很大差异。 7、实验对照 8、实验准备和重复 同种但不同品系的动物，对同一刺激的反应差异很思考题: 大。 影响动物实验结果的因素有哪些,为了保证实验结果的四、标准化原则 准确性，你如何准备, 根据对实验质量的要求选择标准化的实验动物 。 动物实验中选择和使用与研究内容相匹配的标准第三章 动物实验中实验动物的选择 化的实验动物 标准化动物:是指遗传背景明确或来源清楚的，对首先应从生物医学研究的目的和实验要求来选择实验动其携带的微生物和寄生虫实行控制，模型性状显著且稳物，进而考虑实验动物是否容易获得、是否经济、是否定的动物。 容易饲养。一切实验动物应具有个体间的均一性，遗传 在精确试验中，鉴于动物体内外的微生物和寄生虫的稳定性和容易获得三个基本要求。 会干扰试验的结果，最好选择无菌动物或悉生动物，至充分查阅与实验相关的实验动物与动物实验两方面的文少也应使用SPF级动物。 献，积极与实验动物科学工作者进行实验相关内容的交五、规格化原则 流 选择与实验要求一致的动物规格。 必要的动物预试验有助于选择与课题相适应的实验动物 1、年龄与体重: 动物预试验的作用: 动物实验时要注意“天文学时间”和“生物学时间” 1、初步观察动物是否适宜于本项目的研究; 的区别。 2、熟悉动物的生物学特性及饲养管理; 不同种属实验动物的寿命与人类具有很大差异。 实验动物年龄与体重一般呈正相关性，可按体重推肿瘤移植等。所以它是实验肿瘤学研究中极有价值的实算年龄。 验材料。 一般来说，实验动物年龄、体重应尽可能一致，相抗肿瘤研究中动物肿瘤模型的选择 差不得超过10%。 自发性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型 2、动物性别: 移植性肿瘤模型、人体肿瘤异种移植动物模型 不同性别的动物对同一药物的敏感程度是有差异二、药理学研究中的选择 的，如实验无特殊要求应选择雌雄各半做实验，以避免临床前药物代谢动力学研究 因性别差异所造成的结果误差。 进行临床前药物代谢动力学研究，目的在于了解新3、生理状态与健康状况 药在动物体内动态变化的规律及特点，为临床合理用药 特殊的生理状态下，如发情、妊娠及哺乳期，机体提供参考。所以，选择动物时，必须选用成年健康的动对实验的反应性发生改变。 物，常用的有大鼠、小鼠、兔、豚鼠、犬等。 、实验条件 4 作药物动力学参数测定时，最好使用犬、猴等大动六、经济性原则 物 容易获得、价格便宜和饲养经济 一般药理研究 七、动物实验结果的外推 常选用的动物包括小鼠、大鼠、狗、猫等，性别不 医学研究中，动物模型、动物实验都是为人服务的，限，但观察循环和呼吸系统时一般不宜用小鼠和兔。 一切动物模型和动物实验结果都要外推到人身上去，这作用于神经系统的药物研究 就是动物实验结果的外推，因为动物与人到底不是同一 促智药研究一般使用健康成年的小鼠和大鼠。除非种生物，在动物身上无效的药物不等于临床无效，而在特定需要，一般不选用幼鼠或老年鼠。镇静催眠药研究动物身上有效的药物也不等于临床有效。加之不同动物一般选用健康成年小鼠，便于分组实验。抗痛药研究一有不同的功能和代谢特点，所以，肯定一个实验结果最般选用健康成年小鼠或大鼠，且以雄性为宜。 解热药研好采用两种以上动物进行比较观察。所选的动物一类为究首选家兔，因为家兔对热原质极敏感。对神经节传导啮齿类，另一种为非啮齿类。常用序列是:小鼠、大鼠、阻滞影响的药物研究时，首选动物是猫。 狗、猴或小型猪。 作用于心血管药物的研究 八、实验动物的选择应用应注意有关国际规范 抗心肌缺血药物研究可选用犬、猫、家兔、大鼠和GLP 小鼠。抗心律失常药物研究可用豚鼠，因小鼠不便操作SOP 不宜选用。调血脂药物研究一般选用大鼠、家兔，尤其“3R” 是遗传性高脂血症WHHL兔是良好的模型动物。 第二节 常见动物实验中实验动物的选择 作用于呼吸系统的药物研究 | 一、肿瘤学研究中实验动物的选择和应用 镇咳药筛选的首选动物是豚鼠 。猫在生理条件下肿瘤学研究中实验动物的作用 很少咳嗽，但受机械刺激或化学刺激后易诱发咳嗽，故实验动物的肿瘤学特点 可选用猫用于刺激喉上神经诱发咳嗽。兔对化学刺激或 不同种属动物 电刺激不敏感，刺激后发生喷嚏的机会较咳嗽为多 。 不同类型的实验动物 :近交系动物的自发瘤的发支气管扩张药物研究最常用的动物是豚鼠，因其气生率高低不等，有一些高癌系小鼠，只要活到一定的时管平滑肌对致痉剂和药物的反应最敏感。 间，无需任何外加的处理，几乎可以100%地自然发生作用于消化系统的药物研究 白血病、肺癌或乳腺癌等恶性肿瘤，从而证明癌症是可 胃肠解痉药物研究可用大鼠、豚鼠、家兔、犬等，以遗传的。 雌雄均可。催吐或止吐药一般选用犬、猫、鸽等，而不 实验肿瘤学研究中使用得最多的是近交系小鼠和选用家兔、豚鼠、大鼠，因为这些动物无呕吐反射。 大鼠 作用于泌尿系统的药物研究 GF大鼠和小鼠所发生的恶性肿瘤几乎全部发生在 利尿药物或抗利尿药物的研究一般以雄性大鼠或内分泌系统或受激素作用的组织中。无菌动物几乎不发犬为佳。 生内分泌系统和造血系统以外的肿瘤。 三、药物安全性 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 试验中实验动物的选择 祼鼠是一种独特的纯系动物，其特征为:全身无毛，药物安全性评价试验包括急性毒性、长期毒性、生殖毒先天性无胸腺，T淋巴细胞缺失，细胞免疫机能缺陷，性、致突变、致癌、刺激过敏等。不同的试验要用不同对异体移植物几乎无免疫排斥反应，可接受异系、异种的实验动物，试验要求也不完全一致。 急性毒性试验 (一)、环境设施的一般要求 药物的LD50，常用小鼠和大鼠，而且最常用的是设施应选建在远离疫区和公害污染的地区，有便利和充封闭群的动物，如ICR、KM小鼠，SD或Wistar大鼠。 足的后勤供应(水、电、给排水系统，交通运输等)。 长期毒性试验 设施建设应坚固、耐用、经济，有防虫、鼠等野生动物 长期毒性试验持续时间一般较长，而且实验动物的的能力，施工和建筑材料要严格符合设计要求，最好预高、中剂量组是给予中毒剂量的药物，如要获得真正的留可扩大的余地。 药物毒性作用结果，就必须保证动物的质量和适宜的环设施最好为独立结构，具有各种完整的相应职能区域，境。 做到区域隔离以便满足对各种不同动物品种、品系饲养 需要两种以上的动物，才能比较正确地预示受试药和保证动物质量的需要。 物在临床上的毒性反应，常用的一种是啮齿类的大鼠，必要的保证满足设施功能、环境和微生物控制的设备和另一种是狗、猴或小型猪。 措施。 生殖毒性试验 保证动物健康，人员安全，并不对周围环境造成污染。 一般生殖毒性试验，目的是判断雄性、雌性动物连适当的防灾和安全(应急发电、防火、防生物污染等突续用药后，一般生殖行为和生育力的变化。 发事故)应对措施，保证设施正常运转。 致畸敏感期毒性试验 实验动物设施的总体设计应严格遵守国家和地方对建设 判断雌性动物在胚胎器官形成前、后所给的药物对的相关法律、法规的规定。在城市规划、消防安全、环胚胎的毒性和致畸性 。 境保护、卫生防疫、建筑要求等方面按着现有法规进行围产期毒性试验 切合实际的设计。 目的是判断雌性动物在产前(妊娠后期)及产后(至(二)、环境设施的分类 哺乳结束)给药对仔代的影响。 按功能分为: 致突变及致癌试验 生产型设施:繁育生产设施 致癌试验须长达2—3年。如果没有严格的SPF 使用型设施:动物实验设施 条件，很难想象这样的实验能进行到底，因为不是在这 感染性动物实验设施通常的防护主要靠物理学隔样条件下饲养大、小鼠，它们的生命期尚不及致癌试验离原理，采用负压通风达到防止有害气溶胶扩散的目的。 所要求的周期。 按微生物控制程度分类 : 四、心血管系统疾病研究中的选择 普通环境、屏障环境、隔离环境 五、消化和呼吸系统疾病研究中的选择 二、动物实验观察日常管理要求 六、神经系统疾病研究中的选择 (一)、手术后动物日常管理要求 七、泌尿和生殖系统疾病研究中的选择 1、一般护理 八、抗炎与免疫试验研究中的选择 动物的麻醉期尚未过时，要注意动物的保暖，术后九、微循环试验研究中的选择 护理观察室温度与手术室均要恒温和达标，两室的温差十、其他研究中的选择 不超过3?。将未苏醒动物置于干燥而清洁的铺垫物上， 被毛如剃去面积较大，要覆盖干燥消过毒的手术巾。注第四章 动物实验观察室条件要求及实验者的自身保护意摆正动物头颈部位置以保持呼吸畅通，及时清除口腔措施 鼻腔分泌物，以防误人气管。要经常定期地观察记录动 物的呼吸、脉搏、体温的变化，并做好护理记录。 第一节 动物实验观察室条件与管理要求 2(创口处理 一、动物实验观察室环境设施设备条件与要求 手术创口一般用纱布或绷带固定在皮肤上，纱布或 实验动物与动物实验环境设施主要包括外环境和绷带的内面可涂布软膏，有助于防止细菌感染。有引流内环境。外环境主要是指实验动物饲育和实验场所外的管套管或瘘管要定时清洁。一般术后7—8天拆线，有感周围环境，内环境主要是指实验动物饲育和实验场所内染可提前清创，更换纱布和绷带，并详细记录。 的环境。内外环境因素对实验动物有直接作用和间接作3(饮食及输液 用。 术后动物未完全清醒时不给任何饮食，清醒后可以 动物实验设施的建设，必需满足环境控制要求，这先喂水，然后给予食物。若消化道手术，要禁食3天并就要求相关设施必须经过验收，试运转期间未出偏差，补液。在恢复期内要饲喂高蛋白、高能量饲料。若术中交付使用时已具备了环境控制达标的能力。 出血较多，术后较虚弱的动物也必须给予补液。但对于 个体较小的大鼠、小鼠的脱水，当动物静脉补液难以进手术室要有一定的面积，并设有功能分区:更衣室、洗行时，也可采用腹腔补液。 手间、消毒间、器械室、手术室等。 4(并发症的预防和处理 2、内部:易清洁，便洗刷。保持温湿度恒定和空气洁净。 按照国家标准严格控制动物饲养观察室的环境条3、仪器设备:无影灯、动物手术台、麻醉机、呼吸机、件，加强消毒防疫。要仔细观察实验动物术后有无并发心电监护仪等。 症的异常表现，进行记录。清洁级以上动物的实验原则(二)、动物手术室的管理要求 上不允许使用其他药物，以防影响实验结果。非屏障系1、专人负责日常管理、手术登记、配合手术。 统的实验动物术后要加强卫生防疫，尽量不使用抗生素2、各类器械、物品应定期维护、保养，药品、易耗材料等药物预防感染或治疗，如果使用了药物应详细记录。及时添加补充。 清洁级以上动物在实验后如发现发烧、腹泻、呕吐或死第二节 实验者的自我保护 亡等非正常表现时，应立即请兽医检查诊断，找出原因，实验动物在生产、使用过程中，存在感染、繁殖病 原体的可能以及向环境扩散的危险，造成周围人及动物处理病死动物，彻底消毒环境并重新进行该项实验。 5(特殊处理 感染发病，即生物危害 有些实验需在术后做一些特殊处理，可根据研究设 从事实验动物及动物实验工作的人员可能遇到的计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 进行。如果器官移植实验，受体动物术后要使用危害主要有以下几个方面:1、动物屋内的过敏原;2、必要的免疫抑制剂，或在膀胱结石生成实验研究中动物物理性或化学性损害;3、动物实验时相关的危害;4、在术后饮水中要加1,乙二醇才能在膀胱的异物上形成人兽共患病。 草酸结石等。 一、动物室内的过敏原及其防护 6(在大动物术后护理中继续强化驯服 术后动物处于(一)动物室内过敏原造成的危害 虚弱状态，护理人员精心护理，容易与动物建立较为亲小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬等动物的毛、皮屑、血清、近的关系，借此可以强化驯服，以使动物康复后能配合尿液等对某些敏感的人具有抗原性，可通过呼吸道、皮实验研究，减少动物的应激反应，同时也有利实验操作肤、眼、鼻粘膜或消化道等途径引起人的严重变态反应，人员的安全。 出现不适感，甚至发生过敏性鼻炎、支气管哮喘、皮肤7、做好记录 炎等，并可造成反复发作 动物护理记录是实验研究的原始文字材料的组成(二)动物室内常见过敏原及特性 部分，和X线照片、病理切片、各种实验描记图与录像(三)对过敏原的防护措施 等共同构成完整的实验记录，最后集中归为实验档案。 硬件设施:保证环境设施符合国家标准，特别是动物房(二)、长期试验中动物的日常管理 内的换气次数应保持在10次/时以上，温湿度维持在适1、保证观察室环境指标符合要求并保持恒定。 当水平，有条件的饲养室可以对饲养盒加盖过滤帽。产2、严格执行各项饲养管理操作规程。 生高浓度气溶胶的工作，应在1、2级生物用工者感染动3、认真做好观察记录。 物用安全操作超净台内进行。 三、屏障环境内动物实验观察与操作规范 日常工作:实验动物饲养人员及动物实验人员应充分了 通过淋浴，穿着无菌服和风淋等措施，防止人员进解动物房内过敏原的情况，充分做好个人防护，尽可能入屏障设施造成污染。通过一系列无菌操作将动物传进减少在过敏原中的暴露。具体做法是:进入动物室内应和传出屏障设施，使动物和屏障设施在操作过程中不受穿长袖工作服或防护衣，戴口罩、手套;勤洗手，离开污染。 工作区时洗脸及颈部;在工作过程中尽可能避免碰触脸、 凡能够高压灭菌的物品，一律由双扉高压灭菌锅灭拨发、抓痒等;保持动物房及笼器具的清洁等。 菌后传入。如笼架(组装件)、鼠盒(可带垫料)、工作服等。过敏状况评估:定期对实验动物工作人员进行身体过敏不耐热的物品可由灭菌渡槽或传递窗传入，如经辐照灭状况的评估。 菌后的饲料、塑料微型喷雾器等。走廊、缓冲间、浴室、二、物理性、化学性危害及其防护 传递窗等区域，通常采用紫外线照射和熏蒸消毒。动物(一)物理性危害 饮用水一般采用过滤除菌或高压灭菌。 1(动物咬伤、抓伤、踢伤 四、动物手术室设施及管理要求 2(尖锐物品损伤 常见的尖锐物品主要有针头、(一)、动物手术设施要求 刀、剪、锯、破碎的安賠瓶等。 1、结构:独立区域，大动物无菌手术室和小动物急性手 3、放射性物质 动物试验中因为使用仪器所产生术室分开。无菌手术室的基本要求与临床手术室相同。α、β、γ、中子或X-光等放射线(radiation)照射动物，因 而可使动物实验人员及饲养管理人员，暴露于上述放射4(定期健康检查 每半年或一年组织对相关人员线之中。另外，放射性同位素动物实验亦是放射线来源进行体格检查，全面了解健康状况。 之一。 三、动物实验中的生物危害及防护 4、易燃物品及高压气瓶等 (一)动物感染实验中的病原体危险度分类 实验动物感染实验中根据病原体的危险程度分为(二)物理性伤害的防护 1(及时处置 四级，即一、二、三、四级。一级安全度是对人体几乎2(掌握正确抓取方法 没有任何危险的病原体，人的实验室感染及实验室内的3(正确固定和麻醉 感染可能性基本不存在;二级安全度指能够防止实验室4(实验操作规范 实验人员在操作过程中不但要仔细操感染，假如感染，发病的可能性也非常小;三级安全是作，还要密切注意动物的动态，严格操作规范。所用的一旦发病就有可能成为严重病症，但也有有效的预防方 法和治疗方法;四级安全度是一旦感染就有可能成为重注射器、针头、手术器械要放在离动物稍远的地方，以 症，尚无有效的防治方法。危险度分类是基于对人的危免动物挣扎时误伤动物或操作人员的身体，不再使用的 器具及时清理出去。操作人员受伤后，应用75,酒精或险性而提出来的。 3,碘酒作清理、消毒处理，根据情况不同及时诊治。 (二)防护措施 5.遵守操作规程 对放射性物质、易燃易爆物、高压气 1.加强实验动物的管理 2. 使用标准化的环境设施 瓶等的使用，应严格遵守相应的规范，按标准操作程序 来进行，杜绝各类事故的发生。 3(规范操作，培养良好的工作习惯 6(注意用电安全 四、人兽共患病及防护 (三)化学性危害 (一)常见人兽共患病 1(麻醉剂与安乐死药剂 某些注射性麻醉剂长期与 许多动物可携带感染人的病原体，根据病原的不机体皮肤接触可产生损害作用。吸入性麻醉剂在使用过同，对人体健康产生不同的危害。 程中，可通过多种环节进入到空气中。 (二)对人兽共患病的防护措施 2(消毒剂、杀虫剂、清洁剂 常用各类化学消毒剂、 1(完善实验动物环境设施 动物设施要有合理的杀虫剂、清洁剂等，如甲醛、戊二醛、过氧乙酸、碘伏功能区域，各功能区域之间的行走路线不相互交叉。整及除虫菊酯、灭害灵等，多具有挥发性，对人的皮肤、个设施要有良好的空调通风系统，并运行良好。设施应神经系统、呼吸系统都有损害，如表现为急性眼结膜、配备符合标准的消毒灭菌设备。 上呼吸道炎症、喉头水肿和痉挛、化学性气管炎或肺炎、 2(加强人员管理 严格控制各类人员的进出，无皮肤损害等。 关人员不得进入动物实验室。工作及实验人员应按规定3(实验用药品、试剂等 由于实验需要，动物实验做好个人防护。每次接触动物或培养物以及离开饲养观中常使用各类药品、试剂。很多药物可用来制作人类疾察前，必须彻底洗手。工作过程中必须戴上手套、口罩，病的动物模型，如利用致癌物制造肿瘤动物模型等。常禁止用手触摸面部、鼻、眼、口部，禁止在饲养观察室用的一些化学试剂，是强酸、强碱或具有强腐蚀性的。内进食、饮水、吸烟或存放食物。工作期间应穿着饲养这些药品、试剂同时也可对实验人员构成危害。 观察室内的外套或制服、鞋子、帽子。离开工作室时必(四)化学性危害的防护 须脱下防护服，定时消毒清洗。 1(做好环境控制 应定期对实验室环境进行监测。 3(严格实验动物的选择 尽量选择无特定病原体加强动物室内的通风换气，降低各种吸入性麻醉药和化(SPF)动物进行试验，杜绝因实验动物自身携带病原学消毒剂的残余量, 减少对机体的危害。条件许可的条体而使实验人员感染。 件下，安装废气排放系统。尽可能采用物理消毒方法， 4(搞好实验环境 减少消毒剂的使用。动物实验室应安装紧急冲洗设备。 5(及时治疗疾病 2(加强日常管理 制定并不断完善的实验室日常管思考题: 理制度。危险品有明确的标识，并由专人管理，定期检在做动物实验的过程中会有危险吗,如何才能保证实验查。实验场所及时清洁、整理，防止二次污染。对所有人员的安全, 进室人员进行安全卫生教育。 3(完善个人防护 除了工作服、实验服、防护服第五章 动物实验的基本技术方法 外，还应配备面罩或护目镜、口罩或防毒面具等个人防 护设备。 第一节 动物实验前的准备 一、动物实验前的理论准备 它条件都具备的情况下才可配制; 1、了解实验动物方面的基础知识 各种实验器械要消毒、配套。 动物实验人员应掌握实验动物科学基本知识。 3、实验动物 必须了解国家、省、市及所在单位实验动物机构有 实验动物是特殊的材料，是有生命的物质。实验前关实验动物和动物实验的管理法规和制度，并能够切实应了解实验动物品种、品系、等级、许可证、动物质量遵照执行。 合格证情况，进一步提交详细的使用 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 。 参与动物实验的人员都必须通过所在省、市科技主 对本单位不能提供的实验动物，则必须联系购买，管部门组织的实验动物从业人员上岗考试，并取得科技购买的程序、要求、运输等都要认真考虑。 主管部门统一颁发的上岗资格证书 。 三、预实验 2、正确选题立项和设定假设 检查各项准备工作是否完备 选题的一般原则: 实验方法和步骤是否切实可行 ?科学性。即选题应具有明确的理论意义和实践意测试指标是否稳定可靠 义，符合科学性的原则。应当在理论学习、技能掌握、可初步了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实文献检索、研究积累的基础上提出假说，设计新的实验。 验提供补充、修正、完善的意见和经验。 ?创新性。创新性是科学的灵魂，选题能够探索生第二节 动物实验的设计与分组 命科学中的未知事物或未知过程，或能揭示已知事物中良好的设计，成功的前提 的未知规律，或提出新见解、新技术、新方法。 实验设计的几个要素 ?可行性。指选题应切合研究者的学术水平、技术 (1)处理因素 人为施加不同试验条件(给受试对象水平，具备开展实验的条件，能够顺利得以实施。 以各种物理、化学或生物学刺激)，以揭示生物体的内在?伦理原则。 规律。控制处理水平(如剂量、时间、强度、频率等) 实验动物同样是生命体，同样需要考虑伦理问题。在合理的范围。 动物实验设计应按照“,R”原则进行评估和设计。在满(2)试验对象 选择合适的实验动物或动物组织和细足研究需要的前提下，尽可能少用实验动物，或寻找替胞等。必须保证试验对象的一致性，试验对象应当对处代方法;实验应当在动物没有痛苦的条件下进行，需要理因素敏感，并且反应稳定。 手术或其他损伤性实验时，应当给动物麻醉或镇静。实(3)试验效应的观察 采用适当的观察指标，包括定验后的动物应给予很好的护理。 量指标、定性指标和半定量指标，观察动物对各种试验设定假说 施加因子的反应。选择指标时应当考虑到指标的关联性、 假说是预先假定的答案或解释，即实验的预期结客观性、灵敏度和可用性，以提高效应观察的敏感性和果。假说是实验研究设计的前提。如果没有假说，实验特异性。 和观察就会失去目标。假说关系着实验研究的目的性、一、动物实验设计的基本原则 计划性和预见性。假说必须根据实验情况及时加以修正。 (1)对照性原则 3、实验研究计划和方案的制定 同体对照，即同一动物在施加实验因素前后所获得 是指对动物实验研究中涉及的各项基本问题的合的不同结果和数据各成一组，作为前后对照，或同一动理安排。尽可能做到周密合理、切实可行。 物在施加实验因素的一侧与不施加实验因素的另一侧作4、实验方法的选定 左右对照; 要求:可靠性、优越性、创造性 异体对照，即实验动物均分为两组或多组，一组不二、动物实验前的条件准备: 施加实验因素，另一组或几组施加实验因素。 内容:实验仪器、药品、试剂、实验动物等。 没有对照组的实验结果往往是难以令人信服的。对要求:实验手段和实验方法标准化。 照应在同时同地同条件下进行。 1、实验场所 (2)一致性原则 一致性原则是指在实验中，实验组 必须持有实验动物使用许可证 与对照组除了处理因素不同外，非处理因素基本保证均 必须是标准化的条件，规范化的管理。 衡一致。这是处理因素具有可比性的前提。 2、 仪器、药品、试剂 (3)重复性原则 重复性原则是指同一处理要设置多 仪器要校准，好用、会用; 个样本例数。重复的作用是估计试验误差，降低试验误 药品、试剂要提前预定，按照 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 进行配制，特差，增强代表性，提高精确度。重复的目的就是要保证别注意的是，生物试剂要在确认有合格的实验动物和其实验结果能在同一个体或不同个体中稳定地再现。为此， 必须有足够的样本数。样本数过少，实验处理效应将不养成分，以维持正常的生理机能，其营养需求会因动物能充分显示;样本数过多，又会增加工作量，也不符减个体的生理状况如维持、生长及繁殖阶段，动物种类、少实验动物用量的原则。 年龄性别而有所差异。 (4)随机性原则 随机性原则就是按照机遇均等的原实验动物的营养需要: 则来进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误 维持需要、生长需要、繁殖需要 差尽量减少，防止实验者的主观因素或其他偏性误差造实验动物的营养要素: 成的影响。 水、蛋白质、碳水化合物、脂肪、 矿物质、维生 (5)客观性原则 客观性原则是指所选择的观测指素 标尽可能不带有主观成分。所有观测指标尽可能便于定 各种实验动物的营养需要 性定量，结果判断要以客观数据为依据。 小鼠:对蛋白质要求高不低于18%、对维生素A过量敏二、动物实验设计方法介绍 感 (一)、单组比较设计 大鼠:蛋白质 18%~20%，对维生素缺乏敏感 (二)、配对比较设计 豚鼠:粗蛋白18%~20% 粗纤维12%~14%、饲料中应补(三)、随机区组设计 充维生素C (四)、完全随机设计 兔:粗纤维12%~14% (五)、拉丁方设计 猴:体内不能合成维生素C (六)、正交设计 影响营养需求的因素 三、动物随机分组方法 遗传因素 同种但不同品系的动物因遗传基因的表达程方法很多，如抽签、拈阄等形式，但最好的方法是使用度不同而影响遗传的需求，例如近交系小鼠与封闭群小随机数字表或计算器。 鼠，对蛋白质饲料的需求，近交系小鼠要更高些 。ODS第三节 实验动物的抓取固定 大鼠因为基因突变造成L—谷氨酸氧化酶的缺乏，使小鼠的抓取和固定 ODS大鼠无法合成维生素C 。 抓取方法 生理状况 动物在不同的生理状况中，如生长、怀孕、固定方法: 创伤或泌乳时，对营养需求会有所不同，个体需从饲料 徒手固定;固定板固定;固定架固定;简易固定 中获取额外的营养，以满足胎儿的生长、发育，组织的大鼠的抓取与固定 合成或修补，吸取制作乳、蛋、毛的原料。 抓取方法 环境因素 环境因素会改变动物的营养需求。 固定方法: 微生物状态 无菌动物因肠道内微生物状态与一般动物 徒手固定;固定板固定;卵圆钳固定 不同因此在配制饲料时，必须调整饲料成分及配制方法，豚鼠的抓取与固定 以满足动物的需求。 抓取方法 研究条件 固定方法 营养成分的相互作用 徒手固定 固定板固定 实验动物饲料 家兔的抓取与固定 饲料原料: 抓取方法 粗饲料:含粗纤维18,以上，每公斤干物质的消固定方法 化能不超过2500大卡。 徒手固定;盒式固定;台式固定 青绿饲料:富含叶绿素的植物性饲料 犬的抓取与固定 青贮饲料:利用青贮技术，使青饲料处于厌氧条件下，抓取方法 利用乳酸菌发酵产生乳酸，使青饲料处于pH值3.8,4.2固定方法 的环境中，从而较好地保存原有营养价值的青饲料。 慢性试验中犬的固定方法 能量饲料:粗纤维含量不足18,，或一公斤饲料干物质 急性试验中犬的固定方法:头部的固定;四肢固定 中含消化能2500大卡以上的饲料。 第四节 实验动物饲料日粮 蛋白质饲料 品质优良的实验动物取决于有计划的繁育制度、严格的 矿物质饲料 遗传、微生物监控及标准的饲育环境;另一常被忽略的 维生素 添加剂 重要因素是动物的营养需求，动物个体需得到均衡的营配合饲料的分类 按营养成分分类: 1. 挥发性麻醉剂:乙醚、氯仿等 配合饲料:根据饲养动物的营养需要将多种饲料原 2. 非挥发性麻醉剂:苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、硫料按饲料配方经工业化生产的均匀混合物。 喷妥钠等巴比妥类的衍生物，盐酸氯胺酮、水合氯醛等 浓缩饲料:以蛋白质饲料为主，混以矿物质和添加3.中药麻醉剂:洋金花、东莨菪碱等 剂预混料配比而成。不能直接饲喂动物。须按说明与能动物的麻醉方法 量饲料或粗饲料混合后才可使用。 1(全身麻醉 添加剂预混料:由营养物质添加剂(如各种氨基酸、 ?吸入法: 维生素等)和非营养物质添加剂(如促生长剂、粘合剂、 ?腹腔和静脉给药麻醉法 防霉剂等)按各种饲料配方需要加上必要的载体配制成2.局部麻醉:盐酸普鲁卡因、盐酸可卡因 各种添加剂预混料，分别包装，在配料时按比例加入。 麻醉注意事项: 静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜 代乳饲料:指能够替代自然乳的全价配合饲料。 ? 反射和对皮肤夹捏的反应，当这些活动明显减弱或消失饲料的配合 时，停止注射。 配方设计的原则: ?麻醉时要注意保温。保温方法有:实验桌内装灯， 满足动物的营养标准 电褥，台灯照射等 选用适宜的原料 作慢性实验时，在寒冷季节，麻醉剂在注射前应 注重适口性 ? 配合方法 加热至动物体温水平。 第五节 动物的性别鉴定与日龄判断 ?注意保持动物的呼吸道的通畅. 雌雄鉴别 第八节 动物的给药途径和方法 啮齿目:大小鼠 实验动物的给药方法主要分为注射法和投入法两种，注兔形目:兔 射法又分为:皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、脑膜下食肉目: 注射、脑内注射、胸腔内注射、腰椎内注射、静脉注射、 关节腔注射和心内注射等方法，投入法可分为:鼻腔内灵长类: 投入、胃腔内投入、肠管内投入、气管内投入以及经口日龄判断 腔投入。 第六节 动物的编号、标记及去毛方法 动物的编号与标记: 小鼠的给药途径和方法 常用的标记液: 灌胃(i.g):动物要固定好;头颈部保持平展;要沿着口 角进针，再顺着食管方向插入胃内;决不可进针不顺就 ?3%~5%苦味酸溶液(黄色) ?0.5%中性红或碱性品红溶液(红色) 硬向里插。 ?2%硝酸银溶液(咖啡色，涂后需光照10分钟) 皮下注射(s.c):常选用颈背部皮肤。 ?煤焦油酒精溶液(黑色) 皮内注射(i.d):观察皮肤血管的通透性变化及观察皮内编号原则: 反应，多用于接种、致敏实验等。雄性较雌性皮肤紧密， 先左后右，从前到后。左前肢记为1号，左侧腹部注射难度大。 为2号，左后肢3号，头顶部为4号，腰背部5号，尾肌肉注射(i.m):较少应用 基部6号，右前肢7号，右侧腹部8号，右后肢9号。腹腔注射(i.p): 静脉注射(i.v):一般采用尾静脉注射。小鼠尾部背腹编号超过10时，可使用两种不同颜色的溶液，把一种颜 色作为个位数，另一种为十位数。 各有一根动脉，两侧各有一根静脉。 实验动物被毛的去除方法 大鼠的给药途径和方法 1. 剪毛法 灌胃:左手按徒手固定方式固定大鼠,使大鼠伸开两前肢, 2. 拔毛法 手掌握住大鼠背。方法与小鼠相同。 3. 剃毛法 皮下注射:常选在左侧下腹部或后腿皮肤处，方法同小 4. 脱毛法 鼠。 常用的化学药品:硫化钡(BaS)、硫化钠(NaS)、硫化皮内注射:常选用背部脊柱两侧的皮肤，方法同小鼠。 钙(CaS) 肌肉注射:一般选择股二头肌注射，但应避免伤及坐骨第七节 实验动物的麻醉 神经，否则会导致后肢瘫痪 常用的麻醉剂 腹腔注射:用左手的大拇指、食指和中指从大鼠的前肢 和头部后面抓住大鼠，同时用身体抵住大鼠的两后肢使颈动(静)脉采血: 之固定，使腹部向上并伸展，注射方法与小鼠相同。 背跖静脉采血:豚鼠 静脉注射:尾静脉 犬的血液采集方法 豚鼠的给药途径和方法 前后肢皮下浅层静脉采血: 经口给药: 颈静脉采血 固体药物的投入 隐动(静)脉采血 液体药物的投入 股动脉采血 皮下注射:大腿内侧面、背部、肩部等皮下脂肪少的部心脏采血 位 猪的血液采集方法 皮内注射:脊柱两侧 耳大静脉 肌肉注射:大腿外侧肌肉 心脏采血 腹腔注射 猴的血液采集方法 静脉注射: 前肢头静脉 耳缘静脉 后肢皮下静脉 外侧跖静脉 第十节 动物各种体液的采集方法 兔的给药途径和方法 尿液的采集方法 灌胃:确保灌胃管插入胃内;药液推完后将残留在灌胃1、代谢笼采集方法 管内的药物用水冲入胃内，确保给药剂量的准确 将动物放在特制的笼内饲养，动物排便时，可通过皮内注射:背部脊柱两侧的皮肤 笼子底部的大小便分离漏斗，将尿液与粪便分开，达到皮下注射:背部和腿部皮肤 采集尿液的目的。 肌肉注射 2(输尿管插管采集尿液 在动物输尿管内插一根塑料套腹腔注射 管收集尿液。适用于兔、猫、犬等。 (1)兔输尿管插管采集尿液:输尿管插管常用于一侧静脉注射:耳缘静脉 肾脏功能研究时分侧收集尿液。操作方法如下:用氨基犬的给药途径和方法 甲酸乙酯静脉注射麻醉家兔，仰卧固定在实验台上。于经口给药: 液体药物的投入:同兔 耻骨联合上缘向上沿正中线作4cm长皮肤切口;再沿腹固体药物的投入 白线剪开腹壁寻找膀胱，将其翻出腹外，在膀胱底两侧皮下注射 找到输尿管。在输尿管靠近膀胱处，用细线扣一松结，肌肉注射 以玻璃分针或有钩小镊提起输尿管管壁，于输尿管上剪腹腔注射 一小口。从小口向肾脏方向插入一根适当大小的细塑料静脉注射:头静脉、小隐静脉、正中静脉、大隐静脉等 导管，并将松结打紧以固定插管，这时可见尿液慢慢由 第九节 动物血液的采集方法 导管流出。将导管开口固定于记滴器上，记录单位时间大小鼠的血液采集方法 内尿液滴数。将滴下的尿液用量器收集，测量其尿液量。眶静脉丛(窦)采血(多次重复):轻压颈部两侧，眼球实验过程中，应用温生理盐水纱布，将手术部位覆盖，充分外突 以保持动物腹腔温度和润湿肠管。 眶动脉和眶静脉取血(大量采血):尽量使动物眼周围皮(2)犬输尿管插管采集尿液:将犬麻醉后，手术方法肤往眼后压，眼球突出充血，弯头镊迅速夹去眼球 暴露双侧输尿管，在固定扎点约2cm处的输尿管近肾段尾静脉采血: 下方分别穿一根丝线，用眼科剪在管壁上剪一斜向肾侧剪尾或切开尾静脉:将尾巴在热水中浸泡数分钟或用酒的小切口，分别插入充满生理盐水的细塑料管(插入端剪精/二甲苯反复擦试 成斜面)用留置的线结扎固定，可见到尿滴从插管中流出针刺尾静脉 (头几滴是生理盐水)，塑料管的另一端与带刻度的容器其它:心脏采血、大血管采血等 相连或接在记滴器上，以便记录尿量。在实验过程中应兔、豚鼠的血液采集方法 经常活动一下输尿管插管，以防阻塞。在动物切口和膀耳中央动脉采血:兔 胱处应以温湿的生理盐水纱布覆盖。 耳缘静脉采血:兔 3 (尿道插管采集尿液 心脏采血:兔、豚鼠 (1)雄犬尿液的收集:取一根内径约0(1cm-0(2cm、 外径约0(15cm-0(20cm、长约30cm较硬的塑料管，动物呼吸的测定 头端圆滑，尾端插一个粗注射用针头作接尿液用。先以动物心电图的测量 液体石蜡润滑导尿管滑头端，然后由尿道口徐徐插入，生化指标的测定方法 一般均无阻力。插入深度约22cm-26cm。可根据动物大血脂、酶、血糖、激素等 小而定，一般中等犬插入24cm为适度。当导尿管插入血液学指标的测定与检查方法 膀胱时，尿液立即可从管中流出，证明插入正确。然后血常规 再少许进入即可用胶布固定导尿管，或在尿道开口处缝免疫学指标测定方法 一针，结扎固定导尿管，不致滑脱。将导尿管固定好，第十二节 受试动物的临床检查方法 并把导尿管尾端放入刻度细口瓶内，收集尿液。若需长一、一般检查内容及方法 时间反复取样的实验，为避免尿液标本污染和实验犬尿 (一)全身状态观察 道逆行感染，导尿管末端应按无菌技术要求保护，不开 1、精神状态 放时应用无菌敷料包扎夹闭。 2、营养状况 (2)雌犬尿液的收集:取一根小号金属导尿管，内径 3、发育状态参数 约0(25cm-0(30cm、长约27cm，插时头端先用液体石 (二)体温检查 蜡润滑，用组织钳将犬外阴部皮肤提起，再用一把小号 (三)呼吸次数 自动牵开器将阴道扩开，即可见到尿道口，然后将导尿 (四)脉搏次数 管由尿道口轻轻插入。至深度约l0cm-12cm，即可插入 (五)被毛和皮肤 膀胱，并可见到尿液从导尿管流出。在外阴部皮肤缝一 (六)粘膜检查 针，将导尿管固定好。在固定导尿管时，可先用血管钳二、系统检查内容及方法 将导尿管夹闭，不使尿液外流到处溢溅，待缝扎固定好(一)、消化系统检查 后再放开导尿管收集尿液或排空尿液。由导尿管尾端接1、采食与饮水的观察:食欲废绝、减退、亢进、异嗜。 一根细胶皮管通人玻璃量器内，收集、记录尿量。 2、口腔检查 (3)雄性家兔尿液的收集:一般用2kg以上雄兔，按3、腹腔检查 30ml,kg-60ml,kg给兔灌水，1小时后用25,乌拉坦、粪便性状观察 4 溶液4ml,kg耳静脉注射麻醉，将兔固定于兔台上，由(二)、呼吸系统检查 耳静脉以输液泵(2ml,分)注入5,葡萄糖盐水，由尿道1、呼吸动作检查:呼吸次数、呼吸节律、呼吸困难等。 插入导尿管(顶端应先用液体石蜡涂抹)，并压迫下腹部2、上呼吸道检查 排空膀胱，然后收集正常尿，给药后再收集尿。在收集3、胸部检查 尿液期间应经常转动导尿管。 (三)、循环系统检查 胆汁的收集方法 主要检查心脏和脉搏，使用听诊检查。 一般采取手术收集。以大鼠为例，手术前禁食16(四)、泌尿系统检查 小时-18小时，饮2(5,葡萄糖盐水。将动物腹腔麻醉1、排尿动作和次数的观察 后，仰卧于实验台上，从背至腹中线去毛、消毒。自剑2、肾脏检查 突下及腹中线做3cm-5cm的切口，或自背沿末肋切3、膀胱检查 4cm-6cm长切口。肌肉钝性分离，注意勿伤下面组织。(五)、神经系统检查 切开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起。在门静脉一侧，1、神经状态检查 找出肝、胆总管。大鼠没有胆囊，几只肝管汇集成肝总2、运动机能检查 管，肝总管和胰管一起汇成胆总管，开口于十二指肠。3、感觉异常检查 分离出胆总管，在胆总管靠近十二指肠的膨大后端剪开三、动物脏器组织的活检方法 小切口，用剪成斜口的聚乙烯管尖端由此插入，一直向(一)、肝脏活检 上插入至肝总管后，结扎固定，可收取胆汁。注意:若1、肝脏部分切除活检 插管前端插在胆总管处，收集到的将是胆汁和胰液混合2、针刺肝脏活检 液。为准确起见，可在肝总管处剪切口插入。 (二)、淋巴结活检 第十一节常见观察指标的测定与检查方法 (三)、骨组织活检 生理指标测定方法 (四)、阴道组织活检 动脉血压的测定 第十三节 动物的安乐死 (一).原则: 及外界环境的影响，经一定时间逐渐发生一系列的死后尽量减少动物的痛苦，避免产生惊恐、挣扎、喊叫 变化，常见的尸体变化有:尸冷、尸僵、尸腐等。正确注意实验人员的安全 地辩认尸体的变化，可以避免把某些死后变化误认为生方法容易操作 前的病理变化。 不能影响实验结果 三、尸体内脏器官采集技术 尽可能缩短致死时间 实验动物剖检，一般取背卧位。对患有传染病的判断是否死亡时不仅要看呼吸，而且要观察神经反射、实验动物通常不剥皮。一般先切断肩胛骨内侧和髋关节肌肉松弛等情况 周围肌肉，使四肢摊开(仅以部分皮肤与躯体相连)然后(二).方法 沿腹中线由剑状软骨到肛门切开腹壁，再沿左右最后肋颈椎脱臼法:大、小鼠、豚鼠、兔 骨切开腹壁到脊柱部。这样腹腔器官全部暴露，此时检空气栓塞法:兔、猫、犬 查腹腔液的数量和性状，腹膜是否光滑，有无充血、淤放血法:大、小鼠、豚鼠、兔、猫、犬 血、出血、破裂、脓肿、粘连、肿瘤和寄生虫，脏器的断头法:大、小鼠、沙鼠 位置是否正常，肠管有无变化，破裂。膈的紧张程度及药物法: 无破裂，大网膜脂肪的含量等。一般先取胸腔脏器，后药物吸入:大、小鼠、豚鼠等;CO2、CO、乙醚、氯仿取腹腔脏器。 (胸腔脏器的采集 用镊子夹住胸骨剑状突，剪断横膈等 1 药物注射:兔、犬静脉注射氯化钾、巴比妥类麻醉剂、膜与胸骨的连结，然后提起胸骨，在靠近胸椎基部，剪DDT等 断左右胸壁的肋骨，将整个胸壁取下。打开胸腔后，注第十四节动物尸体剖检与送检方法 意检查胸腔液的数量和性状，胸膜的色泽，有无出血、一、尸体剖检的物品准备和注意事项 充血或粘连等。检查心包时，注意心包的光泽度及包内(一)尸体剖检的物品准备 的液体数量、色泽、性质及透明度。 1、剖检用器械:解剖刀、剪、镊 (1)胸腺采出 采取胸部器官时，首先要采出胸腺，2然后采出心脏和肺脏。胸腺易被破坏，应特别小心。 、消毒液 、固定液:10%甲醛溶液、95%酒精 (2)心脏采出 在心包左侧中央做十字形切口，用镊3 4、安全防护用品:工作服、手套、口罩等 子夹住心尖，提出心脏，可沿心脏左侧的左纵沟切开左 (二)尸体剖检注意事项 右心室，检查血液及其性状，然后用镊子轻轻牵引，切1、尸检前，应仔细了解病尸生前发病情况、临床表现及断心基部的血管，取出心脏。 (3)肺脏采出 治疗情况。 用镊子夹住气管向上提起，剪断肺脏2、剖检时间应在动物死亡后尽快进行。 与胸膜的连结韧带，将肺脏取出。 3、对确诊或疑是人畜共患病的，应用消毒棉球堵塞尸体2(腹腔脏器的采集 可由膈处切断食管，由盆腔处切断的天然孔，对场地器械等严格消毒。 直肠，将胃、肠、肝、胰、脾一起采出，分别检查。也4、搬运患有传染病动物的尸体时，要堵塞天然孔。注意可按脾、胰、胃、肠、肾、肝、膀胱、生殖器的次序分消毒。 别采出。 5、剖检人员应严格注意自我保护。 (1)脾脏采出 腹腔剖开后，在左侧很容易见到脾6、未经检查的脏器，勿用水冲冼。 脏，一手用镊子将脾脏提起，另一手持剪剪断韧带，采7、剖检完毕，应将尸体、废弃物妥善处理。 出脾脏。 二、尸体的外部检查方法 (2)胰脏采出 胰脏靠近胃大弯和十二指肠，在胰脏(一)一般检查 的周围有很多脂肪组织，因为胰脏与脂肪组织相似，不1、营养状态 易区别。为此，可将胰脏连同周围的脂肪组织一同采出，2、可视粘膜 浸入10,甲醛溶液中，数秒钟后胰脏变硬成灰白色，脂3、体表检查 肪不变色，很容易区分。 4、淋巴结检查 (3)胃肠采出 在食道与贲门部做双层结扎，中间剪5、皮下检查 断，再用镊子提起贲门部，一边牵拉，一边切断周围韧6、肌肉检查 带，使胃同周围组织分离，然后按十二指肠、空肠、回(二)、尸体变化检查 肠的顺序，切断这些肠管的肠系膜根部，将胃肠从腹腔 动物死后，尸体受体内存在的酶和细菌的作用，以中一起采出。动作要轻，避免拉断肠管。 (4)肾脏采出 用镊子剥离肾脏周围脂肪，然后将肾2、固定设备:手术台、手术显微镜、无影灯、器械台、脏采出。 麻醉台、药品柜、吸引器、输液架、氧气瓶、电子秤等。 (5)肝脏采出 用镊子夹住门静脉的根部，切断血管3、检测设备:测温计、心电图机、多导生理记录仪等。 和韧带。操作时应小心，因为肝脏容易损伤。 4、其他设备 3(盆腔脏器的采集 先切离直肠与盆腔上壁的结缔组(二)特殊设备 织，还要切离子宫与卵巢，再由骨盆腔下壁切离膀胱颈、1、人工呼吸机 阴道及生殖腺，最后将肛门、阴门做圆形切离，即可取2、人工心肺机 出骨盆腔脏器。 3、手术显微镜 4(口腔器官的采集 剥去下颌部皮肤，颈部气管、食道常见动物外科手术器械清单 及腺体便明显可见，用刀切断两下颌支内侧和舌边结的器械、敷料的打包与消毒方法 (一)器械与敷料的打包 肌肉，再用镊子夹住，拉出外面，将咽、喉、气管、食 1、器械的打包:器械固定，十字打包。 道及周围组织切离，直至胸腔人口处一并取出。 5(颅腔器官的采集 沿环枕关节横断颈部，，使头颈分2、敷料的打包:十字打包 离，再去掉头盖骨，用镊子提起脑膜，用剪刀剪开，检(二)消毒 查颅腔液体数量、颜色、透明度。用镊子钝性剥离大脑动物麻醉与手术视野准备 与周围的连结，然后将大脑从颅腔内撬出。 1、动物麻醉 2、手术视野准备:脱毛、备皮 第六章 动物实验外科 手术人员的消毒及防护 术后护理 手术种类繁多，范围、大小和复杂程度不同，但基本操第二节 动物实验外科基本操作技术 作技术是相同的 手术视野的暴露要清楚。切开组织，打开手术通路是显手术顺利完成，一定意义上取决于基本操作的熟练程度露的主要内容。既要有利于显露术野，又不能造成过多及其理论的掌握 的组织损伤。 理论指导下的不断实践，是唯一的正确途径。 组织切开、分离与止血 稳、准、巧、轻、快是基本要求。 (一)组织切开 目的要求 1、组织切开的一般原则 1(了解常用手术器械及缝合材料. (1)根据实验目的要求确定手术切口的部位和大小。 2(熟悉手术中切开、剥离、止血的基本操作要领。 (2)根据不同部位的切口采用不同的执刀方式。 3(熟悉外科缝合、打结方法。 2、注意事项: 4(通过动物试验，训练基本操作技能。 (1)切开前，应先将切口部位的皮肤拉紧，使其平坦紧第一节 术前准备及术后处理 张而固定。 动物禁食与手术环境准备 (2)刀刃与切开的组织垂直，以一次切开为佳。 1、动物准备:提前单独饲养并注意观察。术前应禁食禁(3)组织要逐层切开，按皮肤纹理或各组织的纤维方向水:避免麻醉和手术过程中发生呕吐，大动物术前8~24切开为佳。 小时禁食，术前6小时禁水;啮齿类动物如是肠道手术，(4)组织的切开处应选择无重要血管及神经的地方。 术前禁食;反刍动物术前禁食24~36小时，术前禁水6(5)选择切口时，应注意选择易于敷料或导管包扎固定小时。 的部位。 2、手术室:清洗消毒，术前进行空气消毒。 (二)、组织分离 常用外科器械 分离的目的在于充分显露深层的组织或血管，便于手术1、一般外科手术器械:手术刀、手术剪、手术镊、血管操作。 钳、持针器、拉钩、缝针、缝线等。 1、组织分离的一般原则: 2、眼科手术器械 (1)根据不同部位手术的需要采用不同的分离方法。常3、显微外科手术器械 用的方法:锐性分离、钝性分离。 常用手术设备和检测仪器 (2)沿正常组织间隙分离。 (一)基本手术设备 2、注意事项: 1、常规设备:冰箱、恒温箱、离心机、天平等。 (1)肌肉的分离应顺肌纤维方向作钝性分离。若需横行 切断，应在切断处上下端先夹两把血管钳，切断后结扎(三)、剪线及拆线 两断端。 1、剪线:正确的方法是用张开的剪刀沿着拉紧的结扎线(2)神经、血管的分离应顺其平行方向分离。动作要轻，滑至扣结处，再将剪刀稍向上倾斜，剪断。 操作要细。 2、拆线: (三)止血 (四)、换药 对组织切开、分离过程中所造成的出血必须及时止血。1、换药前的准备:器械和材料。 常用的止血法有: 2、注意事项:严格无菌操作 1、压迫止血:多适用于毛细血管渗血。 本章重点: 2、钳夹止血:小血管 动物术前准备注意事项。 3、结扎止血:可靠的止血方法。适用于较大的血管。 组织切开的注意事项。 (1)单纯结扎止血法 组织分离的注意事项。 (2)贯穿结扎止血法 手术过程的止血方法有哪些, 4、其他方法: (1)药物止血法 第七章 药物研究的动物实验方法 (2)烧烙止血法 二、缝合、打结、拆线与换药 第一节 药物试验剂型、剂量与样本数确定 (一)缝合 一、受试物的剂型配制 1、常用的缝合种类与方法: 在药物研究的动物试验中，需要用溶剂、助溶剂或(1)间断缝合(结节缝合) 赋形剂将受试物配制成一定剂型后给动物使用。 (2)褥式缝合 溶剂、助溶剂的要求:无毒性、与受试物无反应、(3)“8”字缝合 制成的溶液稳定。 (4)连续缝合 常用的溶剂:水、生理盐水、植物油等。 (常用的助溶剂:吐温-80 5)毯边缝合(交锁缝合) 6)浆肌层单缝合 二、给药途径与剂量 ( (7)浆肌层连续缝合 各种药物试验都应采用两种给药途径为宜。一种与(8)全层内翻缝合 临床给药途径相同，另一种以注射给药。 (9)荷包缝合 (一)、动物用药量的确定 2、注意事项 1、先用小鼠粗略地探索中毒或致死剂量，然后用(1)缝合前，应彻底止血，并清除缝口内的血凝块及游小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂离组织，必要时加以冲冼。 量，一般可取1/10-1/5。 (2)缝合时，缝针穿入或穿出组织应与该组织表面相垂 2、植物药粗制剂的剂量多按生药折算。 直。 3、化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特(3)入孔和出孔距皮肤切口边缘一般0.5~1cm。 别是化学结构和作用都相似的药物的剂量。 (4)两边针孔要对称，缝线不要过紧过密。 4、确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动(5)深切口需按原解剖层次对合缝合。 物也没有中毒的表现(体重下降、精神不振、活动减少(6)线结应位于切口的同一侧。 或其他症状)，可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，(7)缝合皮肤后，应对皮。 作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，(二)、打结 在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增正确则牢固的打结是结扎止血和缝合的重要环节。 强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便1、常用的扣结种类: 迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出(1)方结:避免形成滑结。 现剂量与作用强度之间毫无规律，则更应慎重分析。 (2)外科结: 5、用大动物进行实验时，开始的剂量可采用给鼠(3)三重结: 类剂量的十五分之一~二分之一，以后可根据动物的反2、常用的打结方法: 应调整剂量。 (1)单手打结法 6、确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄(2)止血钳打结法 大小和体质强弱。一般说确定的给药剂量是指成年动物 的，如是幼小动物，剂量应减少。如以狗为例:6个月 狗体重以10kg计,则A2=0.5198m2 以上的狗给药量为1份时，3-6个月的给予1/2份，45-89 狗的剂量:1608*0.5198/10=84mg/kg 日的1/4份，20-44日的给1/8份，10-19日的给1/16份。 (2)转换因子计算 7、确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同， 按mg/kg折算mg/m2转换因子计算: 所用剂量也不同，以口服量为100时，灌肠量应为大鼠为6，狗19，小鼠3，豚鼠8，家兔12，猫14，猴100-200，皮下注射30-50，肌肉注射25-30，静脉注射为12，人35。 25。 250x6/19=79mg/kg (二)、实验动物用药量的计算方法 (3)每kg体重占有体表面积的相对比值计算 动物实验所用的药物剂量，一般按mg/kg体重或小鼠1.0(0.02kg)，大鼠0.47(0.20kg)，豚鼠0.40(0.40kg)，g/kg体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算出相当家兔0.24(2.0kg)，猫0.22(2.5kg)，狗0.16(10.0kg)，猴于每kg体重应注射的药液量(ml数)，以便给药。 0.24(3.0kg)，人0.08(50kg)。 例:计算给体重1.8kg的家兔，静脉注射20%氨基 250*0.16/0.47=85mg/kg 甲酸乙酯溶液麻醉，按每kg体重1g的剂量注射，应注(4)按人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值计算 射多少ml, (5)按人和各种动物间每公斤体重剂量折算系数计算 (三)、人与动物及各类动物间药物剂量的换算方法 (W) 1、人与动物用药量换算 在新药研制过程主要分临床前试验研究、临床人体试验 人与动物对同一药物的耐受性相差很大。一般说研究、新药批准上市后的不良反应监测等三个阶段。这来，动物的耐受性要比人大，也就是单位体重的用药量三个阶段都涉及药物安全性评价问题。在临床前的实验动物比人要大。可按下列比例换算:人用药量为1，大、研究中，主要是在实验室应用实验动物进行药物的安全小鼠为25-50，兔、豚鼠为15-20，狗、猫为5-10。 性评价。 可采用人与动物的体表面积计算法来换算: 实验动物的质量及其规范化管理与药品安全性试验结果 (1)人体体表面积计算法: 的科学性和可靠性息息相关，因而，实验验动物的规范东亚人:许文生氏公式: 化是GLP的一个重要组成部分。 体表面积(m2)=0.0061x身高(cm)+0.0128x体重(kg)第二节 药物急性毒性观察的动物试验方法 -0.1529 急性毒性试验(Acute Oral Toxicity) :一次或在24h内多如:身高168cm，体重55kg， 次经口给予实验动物受试样品后动物在短期内出现的健体表面积为1.576m2 康损害效应。 (2)动物体表面积计算法: 经口半数致死剂量Oral Median Lethal Dose : 经口一次 由体重推算体表面积时， 或24h内多次经口给予受试样品后引起实验动物总体中Meeh-Rubner氏公式较适用， 半数死亡的毒物的统计学剂量以单位体重接受受试样品A(体表面积，以m2计算)的质量(mg/kg 或g/kg)来表示。 试验目的:1、观察急性中毒表现，寻找靶器官。2、测，体重,以g计算)2/3定毒性参数。3、为长期毒性、蓄积毒性等试验给药剂量=K× 10000的设计提供依据。 一、试验要求 K为一常数，随动物种类而不同，小鼠和大鼠9.1、豚鼠1、动物选择:小鼠，体重18-22克，雌雄各半。 9.8、家兔10.1、猫9.8、狗11.2、猴11.8、人10.6，为2、给药途径和容积:两种途径，注意容量。 一粗略的估算值。 3、给药剂量与分组:首先进行预试验。动物分4-6组，如:家兔1.5kg，则A=0.1324m2 每组至少10只以上。给药剂量按等比级数增减。 2、人及不同种类动物之间药物剂量的换算 4、观察记录:即刻观察动物反应，记录中毒症状、体征(1)直接计算法 和死亡情况。观察周期为两周。 例:某利尿药大鼠灌胃的剂量为250mg/kg， 5、解剖记录:动物死亡应及时进行剖检。 粗略估计狗灌胃的剂量, 二、急性毒性试验LD50 LC50 计算方法 大鼠体重以200g计，则A1=0.0311m2 1、改进寇氏法 250mg/kg的剂量如改以mg/m2表示: 要求:每组动物数相等;剂量按等比级数;Pn<0.2 250*0.2/0.0311=1608 mg/m2 Pm>0.8 根据试验条件及试验结果，选用LD50的计算公式 最后一次给药后24小时每组处死2/3-1/2动物，检测各 此法易于了解计算简便可信限不大结果可靠特别项指标。留下动物继续观察2-4周后处理检查，以了解是在试验前对受试样品的急性毒性程度了解不多时尤为毒性反应的可逆程度和可能出现的蓄积毒性反应。在此适用 期间，除不给受试物外，其他观察内容与受试物期间相 同。 2、概率单位-对数图解法 预试验以每组2~3 只动物找出全死和全不死的剂第五节 制剂常规安全性评价的动物试验方法 量。 异常毒性检查法 动物数一般每组不少于10 只各组动物数量不一定 本法系将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内或要求相等。 口服给药，在规定时间内观察小鼠死亡情况，以判定供 剂量及分组一般在预试验中得到的两个剂量组之试品是否符合规定的一种方法。 供试用的小鼠应健康无伤，体重17,20g,在试验前间拟出等比的六个剂量组或更多的组此法不要求剂量组 及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。作过本间呈等比关系但等比可使各点距离相等有利于作图。 试验的小鼠不得重复使用。 作图计算 供试品溶液的配制:除另有规定外，用氯化钠注射三、测定LD50应注意的几个问题 1、测定前，应进行预试验。 液按各药品项下规定的浓度制成供试品溶液。节 制剂2、注意动物因素对试验结果的影响。 常规安全性评价的动物试验方法 3、注意环境因素的影响。 检查法 4、注意操作因素的影响。 除另有规定外，取上述小鼠5只,按各药品项下规定5、注意实验条件的一致性。 的给药途径，每只小鼠分别给予供试品溶液0.5ml。给6、观察时间一般为14天。 药途径分为以下几种。 7、一般情况下，各剂量组的死亡分布有一定规律。 静脉注射:将供试品溶液注入小鼠尾静脉，应在4,第三节 药物长期毒性观察的试验方法 5秒匀速注射完毕。 长期毒性试验就是对动物重复多次给药，观察药物 腹腔注射:将供试品溶液注入小鼠腹腔。 对动物的毒性反应，一般是指连续14天以上。 皮下注射:将供试品溶液注入小鼠腹部或背部两侧 长期毒性试验的目的:寻找可能的靶器官及停药后皮下。 组织和功能损害是否可逆的情况，为临床安全用药的剂 口服给药:将供试品溶液通过适宜的导管，灌入小量设计提供参考依据，为临床毒副作用反应的监测提供鼠胃中。 依据。 结果判断 一、试验要求 除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有1、动物选择和饲养管理 死亡;如有死亡时，应另取体重18,19g的小鼠10只复2、受试药物 试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。 3、给药途径:一般要求与临床给药途径相同。 本章重点: 4、给药剂量与分组:三个试验组，一个对照组。每组动1、为什么要对人与动物的用药量进行换算, 物20只，雌雄各半。 2、什么是急性毒性试验, 二、观察指标 3、异常毒性对动物的要求, 1、一般性指标:外观体征和行为观察、采食情况、体重。 4、哪些家兔需经预测体温后方可供热原实验用, 2、化验指标:血液、尿液 5、供热原试验用的注射器等物品应如何处理, 3、病理检查:尸检、脏器系数、病理切片 4、特殊指标: 第八章 免疫研究的动物实验方法 三、指标检测时间与恢复期观察 1、指标检测时间: 第一节 动物免疫血清的制备方法 大鼠:最后一次给药后24小时内和恢复期结束各进行一一、试验准备 次。 (一)动物的选择 犬:在试验前应检测正常值2次，给药后1个月检测一 用于制造免疫血清的动物，首先要求健康、体壮，次，停药时检测1次，恢复期结束时检测一次。 对免疫原刺激反应性好。其次是血清采集方便，收获量2、恢复期观察: 大。还要考虑操作方便，易于得到。常用的动物有兔、 山羊、绵羊、鸡、豚鼠等。 制取不同抗原的免疫血清所采用的免疫程序不同，但基 具体选择时，应考虑尽可能使用SPF动物、清洁动本遵循这样的原则: 物，并且是非免疫动物。大动物要求未发生过传染病。 基础免疫,增强免疫,检查抗体滴度,采集 动物的年龄，要求青壮年。大量生产免疫血清一般1、免疫途径:基础免疫，一般选择皮内、皮下注射或肌多选用马、牛进行。 肉注射。抗原来源困难的，选择皮内多点注射。加强免(二)抗原处理 疫多选用皮下、肌肉或静脉注射。 抗原是一类能刺激机体产生抗体，且能与抗体发生2、佐剂选择:抗原免疫原性差的多选择油乳佐剂及免疫特异性结合反应的物质。大多数蛋白质如细菌、病毒及增强剂等，抗原免疫原性较好的选择一般佐剂。基础免其代谢产物(毒素等)和异种血清等具有良好的免疫原疫时加佐剂，而加强免疫时不加佐剂。 性，是完全抗原。而绝大多数多糖、类脂和一些分子量3、抗原的选择:基础免疫多选用灭活或弱毒抗原，抗体 产生后，可用强毒或加大攻击量。 小的蛋白质、多肽及一些化学物质，因缺乏免疫原性称 三、免疫血清的采集与提纯 之为不完全抗原或半抗原。对于半抗原必须进行适当处 (一)免疫血清的采集 理。 、载体的选择:载体是指与半抗原结合后，能促使半抗抗体效价合格后，即可收集动物血清。可以一次性放血，1 原具备免疫原性的大分子物质，如血清蛋白、球蛋白等。也可多次采集。 1、采血方法 最常用的是血清白蛋白。 2、连结方法:采用化学的方法，使半抗原结合到载体上，2、免疫血清的收集 并成为载体蛋白的功能团，即抗原决定簇。连结时:不(二)免疫球蛋白的分离与提纯 应造成半抗原的结构变化，也不能使蛋白载体变性。 盐析?脱盐?提纯 (三)佐剂的种类与制备 第二节 小鼠单克隆抗体的制备原理 佐剂:是指能非特异性地改变或增强机体对抗原的特异单克隆抗体(Monoclonal Antibody，McAb)即单个B性免疫应答的一类物质。 淋巴细胞克隆所分泌的抗体。 抗体主要由机体的B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有1、佐剂的标准: 1)应无致癌作用及辅助致癌作用，不能诱导和促进肿合成一种抗体的遗传基因。当机体受抗原刺激时，抗原( 瘤形成。 分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细(2)应无毒性。 胞。被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克(3)应具有一定的吸附能力。 隆。如果选出一个合成一种抗体的细胞进行培养，就可 得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单(4)具有极高的纯度。 (5)应能为动物降解吸收，不宜长期留在体内或诱发组克隆细胞所合成的抗体即为单克隆抗体。 织损伤。 单克隆抗体的特点是:理化性状高度均一、生物活性单(6)不含有与动物有交叉反应的抗原物质。 一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，(7)不应诱发自身超敏性，也不应与免疫抗体形成有害并且来源容易。 的免疫复合物。 单克隆抗体的制备是将免疫淋巴细胞与骨髓瘤细胞融(8)应性质稳定，能长期贮存。 合，经过培养、筛选和克隆化，建立既能分泌针对预定 2、佐剂的种类: 抗原的特异性单克隆抗体，又能无限制增殖的杂交瘤细(1)油乳佐剂:佛氏佐剂、白油佐剂等。 胞系，用来生产单克隆抗体，该项技术称为淋巴细胞杂(2)胶体佐剂:氢氧化铝胶、明矾佐剂。 交瘤技术。 (3)合成佐剂:溴化十八烷基三甲基铵 杂交瘤抗体技术的基本原理:是通过融合两种细胞而同 时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫(4)微生物佐剂:结核分枝杆菌、葡萄球菌、百日咳杆 菌等。 的小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主(5)动物源佐剂:蜂胶等。 要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生(6)植物源佐剂:某些中草药、植物的提取物等。 长，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，(7)核酸及其类似物:DNA、RNA、多核苷酸等。 即所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与3、常用佐剂的制备: 骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞才具有持续增殖的能力，二、免疫程序与效价测定 形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征(一)免疫程序 的细胞克隆。 建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所步进行:一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使来源于免疫动物的脾细胞。脾是B细胞聚集的重要场所，分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应(30,的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞)，培养后答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细取上清以ELISA法选出抗体高分泌性的细胞;这一过程胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。目前体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔常用的B细胞瘤株有:P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein，接种培养。 1975)，P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein，1976)，第三节 肿瘤组织移入动物体内的方法 X63-Ag8.563(Kearneyetal，1979)，一、人体肿瘤组织移植入动物体内的方法 Sp2/0-Ag14(Schulmanetal，1978)等，这些细胞株皆为动物:免疫缺陷动物。裸小鼠、裸大鼠等。移植方法: 、肿瘤组织块移植 HAT敏感细胞株。 1 2、肿瘤组织悬浮液移植 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易 3、肿瘤组织培养液移植 于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程 移植途径: 度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇 (PEG1000,2000)是目前最常用的细胞融合剂，一般1、皮下移植 应用浓度为40,(W/V)。 2、肾包膜移植 细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠3、原位移植 骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形二、动物间肿瘤组织的移植方法 式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾 动物间肿瘤组织移植术可分为两类:免疫缺陷动物细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融间肿瘤移植和非免疫缺陷动物间肿瘤移植。 免疫缺陷动物间肿瘤移植:将已在裸鼠体内成功生长的合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在 7天，无需特别筛选，细胞的多聚体肿瘤以组织块或细胞方式，继续移植到其他裸鼠的体内培养基中存活仅5, 形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛进行传代。 非免疫缺陷动物间肿瘤移植:将在正常动物体内生长的选去除。 肿瘤，以组织块或细胞方式进行传代给正常动物。一般细胞DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基 酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参来说，该肿瘤组织来源于该品系动物本身，而且局限于与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧在该品系动物间相互移植传代才能成功，在异种动物体啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶内则不能生长。 (HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合第四节 动物皮肤移植方法 成DNA。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分:次鉴定动物组织相容性基因是否一致。是遗传监测常用的黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基嘌呤(aminopterin，A)很有意义的一种方法。大、小鼠常用尾皮移植和背皮移 植。移植后必须观察100天。 和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称 移植后接受超过100天:遗传高度一致 为HAT培养基。氨基嘌呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细 胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒移植后前三周内排斥:H-2复合体显著差异 性培养基选出的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺失的移植后发生慢性排斥:非H-2区域差异 (HGPRT,)细胞株，所以不能在该培养基中生长。只一、背部皮肤移植方法 有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基常用于小鼠 中长期存活与繁殖 (一)材料准备 在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多(二)操作方法 个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免1、固定小鼠 疫应答，实质是众多B细胞群的抗体分泌。而针对目标2、取皮与植片:取直径5-10mm的皮肤左右各一块。两抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个只小鼠左片做自体移植，右片互相交换。注意:毛根方随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关向相反 细胞的融合体，需仔细筛选去除。筛选过程一般分为两3、包扎: 4、观察(1)移植失败(2)急性排斥:2~3W 2、接种部位的处理 (3)慢性排斥:3W后(4)移植存活 3、接种样本的处理 二、尾部皮肤移植方法 4、其他准备 适合于大鼠、小鼠。雌性为宜。 动物感染细菌的方法 异体皮肤移植是利用免疫系统识别“自己”与“异已”的特1、感染途径与方法 性，进行组织相容性鉴定的方法。 2、感染后的观察 优点:敏感性强，经济;可监测多H基因。 动物感染成功的标志:(1)动物的非特异性症状。缺点:时间长，为监测非H-2 组织相容基因的差异需如动物感染后出现的食欲不振、精神萎靡、体重减轻、观察100天的时间;植片脱落原因不定。 皮毛失去光泽、血常规改变、体温上升等，局部出现红与背部皮肤移植法相比，尾部皮肤移植法有何优点, 肿、脓性分泌物等炎症现象。(2)特异性的标志。在局 部炎症分泌物或发热期的血液中分离到接种菌。 尾部皮肤移植法 背部皮肤移植法 解剖后的处理:注意严格消毒 快速 约2~3分钟 需20~30分钟 二、动物感染真菌的试验方法 简便 不需剃毛、易包扎、创小 剃毛、难包扎、 创伤大 动物的选择与处理 节省 可接受异体2~4块皮片 只接受1块 根据菌种的特点选择适当的动物 皮片 对正常动物进行预处理:注射免疫抑制剂、切除器官等 第九章 有关感染研究的动物实验方法 标本:临床标本、培养分离的纯菌种。 菌种用生理盐水制成混悬液，可加入5%猪胃粘液素以第一节 病毒增殖的动物接种方法 增强感染力。 一、病毒增殖的鸡胚接种方法 接种方法 种蛋:最好是SPF蛋。白壳蛋，蛋形正常。 感染后的处理:详细记录，严格管理，定期观察，消毒孵化:温度、湿度 灭菌 第三节 动物感染寄生虫的试验方法 接种途径及方法 、尿囊腔接种 动物感染寄生虫试验的目的: 1 2、卵黄囊接种 1、用人体寄生虫感染实验动物，进行人体寄生虫研究。 3、绒毛尿囊膜接种 2、用人畜共患寄生虫感染实验动物，建立实验动物寄生4、羊膜腔接种 虫疾病模型，进行临床医学研究。 3收获: 接种后每天照蛋一次，及时取出死胚。接种后24、寄生虫保种。 小时内死亡的可能是因损伤、污染或中毒引起的非特异易感动物的选择 性死亡，应放弃使用。 肺吸虫 接种物及收获物如是传染源，应特别注意生物安全 1、动物与寄生虫样品准备 二、动物感染病毒的接种方法 动物准备:犬或猫 接种途径、方法及接种量 寄生虫样品准备:从肺吸虫中间宿主(石蟹或蝲蛄)体 内分离囊蚴。 动物感染病毒的接种途径包括皮内接种、皮下接种、肌 肉接种、腹腔内接种、静脉接种、脑内接种、经口接种2、感染方法:饲喂、腹注、灌注 等。 3、结果检查:两个半月后，可在粪便中查到肺吸虫虫卵 收获方法 4、注意事项:肺吸虫的囊蚴具有感染性，操作者应注意动物接种后，经过一定时间后，会产生病症或死亡，对个人防护以免经口感染。感染后的动物应隔离饲养，粪死亡的或扑杀致死的动物进行剖检，采集病变明显的病便应收集作无害化处理，以免污染水源，造成人为传播。 料或实质器官等，低温保存。 1、动物尸体剖检 器械应消毒灭菌处理 第十章 有关生殖与胚胎研究的动物实验方法 2、病料的采集 第二节 动物感染细菌和真菌的试验方法 第一节动物发情、交配及妊娠检查 一、动物感染细菌的试验方法 一、雌性动物排卵、发情与发情鉴定 感染前的准备 排卵:自发性排卵、诱发性排卵 1、动物的选择 发情周期:发情前期、发情期、发情后期、间情期 发情鉴定: 1) 将2%过氧乙酸放在烧杯中加热至35?。 1、阴道涂片检查法:啮齿类动物常用，主要观察阴道上2) 用脱颈椎法处死妊娠18天的孕鼠。 皮细胞的变化来判断发情周期。 3) 迅速将处死孕鼠放入2%过氧乙酸烧杯中浸泡1分2、外部观察法:各种动物都可用。 钟。 4) 在孕鼠腹腔用碘酒消毒。 3、试情法 4、阴道检查法:适用于体形较大的动物。 5) 打开腹腔，找出子宫颈和2个子宫角，分别用止血钳二、精液采集与品质检查 (血管夹)夹住。 精子:哺乳动物的精子其形态与结构基本相似，是具有6) 用剪刀剪断子宫颈、子宫角，使子宫与母体分离。 活动性、含有遗传物质的雄性细胞，可分为头部、颈部7) 将子宫连同止血钳(血管夹)一起放入手术隔离器的和尾部。 药物灭菌渡槽中。 精液品质检查: 8) 从隔离器内取出渡槽中的子宫。 1、精子密度:每ml精液中所含精子数。 9) 用灭菌生理盐水冲洗后放入培养皿中。 2、精子活力:精液中呈前进运动精子所占的百分率。 10) 一人剪开子宫取出连胎盘仔鼠，一人用纱布擦干仔3、精子形态检查:畸形率和顶体异常率。 鼠，并剪断脐带。 三、配种鉴定 11) 对仔鼠进行按摩，直至仔鼠开始呼吸。 12) 待仔鼠正常呼吸，身体转向肉色后，可将仔鼠传给配种鉴定是掌握怀孕与预测分娩时间的一项重要工作， 除人工辅助交配的实验动物以外，证明动物已交配过的带奶的保姆鼠。 方法有阴道涂片法和阴道栓检查法。 讨论: 四、怀孕鉴定 1、剖腹产手术仔鼠的成活率与哪些 因素有关, 临床检查:试情法、摸胎法 2、对仔鼠按摩刺激有什么作用, 实验室诊断: 3、仔鼠正常呼吸后，身体为什么会转向肉红色, 第二节 动物的去势、剖腹产 一、动物的去势 第十一章 人类疾病的动物模型 指通过人为的方法摘除或破坏实验动物的生殖腺及其附 属器官而使之绝育的方法。 第一节 概述 人类疾病动物模型(animal model of human 常用手术方法:睾丸摘除术、卵巢摘除术 二、小鼠的剖腹产 diseases)是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现1的动物实验对象和相关材料。 、手术隔离器的准备 手术隔离器装配有供2人同时操作的四只手臂，一一、人类疾病动物模型的意义 个药品消毒传递渡槽和相应的保温装置。剖腹产手术前生物医学研究的进展常常依赖于使用动物模型作为实验按隔离器消毒灭菌的方法对手术隔离器消毒灭菌，同时假说和临床假说二者的试验基础。人类各种疾病的发生在药物浸泡渡槽中注满0.2%新洁尔灭。 发展是十分复杂的，要深入探讨其的发病机理和治疗效2、动物准备: 果不能也不应该在病人身上进行。应该通过对动物各种 疾病和生命现象的研究，进而推用到人类，探索人类生1) 选择成年小鼠3雄6雌，按1雄:2雌交配。 命的奥秘，以控制人类的疾病和衰老，延长人类的寿命。 2) 交配后的第二天起每天上午8:00以前观察阴道栓。 3) 以见栓之日为“0”天，第18天下午进行剖腹产手术。 人类疾病的动物模型(Animal Model of Human Diseases) 是生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模似性表4) 带奶保姆鼠应提前1—2天配种，在剖腹产手术前1 天或当日产下幼仔。 现的动物实验和材料。使用动物模型是现代生物医学研 究中的一个极为重要的实验方法和手段，有助于更方便、3、手术器械的准备 1) 将2把眼科剪、2把组织镊、4只培养皿、10块纱布、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律， 从而制定防生理盐水经高温灭菌后传入手术隔离器。 治措施。 2) 将1把手术剪、1把组织镊、3只止血钳(或血管夹)人类疾病动物模型的研究，是生物比较医学的应用科学，包好灭菌后备用。 研究人员可利用各种动物的生物特征和疾病特点与人类3) 手术前打开手术隔离器的加热设备，将温度控制在疾病进行比较研究。长期以来人们发现，选用人作为实35-37?。 验对象来推动医学的发展是困难的，临床所积累的经验4、剖腹产手术过程 不仅在时间和空间上存在着局限性，许多实验在道义上 和方法学上还受到种种限制。而动物模型的吸引力就在 5.可以简化实验操作和样品收集:动物模型作为人类疾于它克服了这些不足点，其在生物医学研究中所起到的病的“缩影”，便于研究者按实验目的需要随时采取各种独特作用，正受到越来越多的科技工作者的重视。 样品，甚至及时处死动物收集样本，这在临床是难以办1(避免了在人身上进行实验所造成的危害:临床上对外到的。实验动物向小型化的发展趋势更有利于实验者的伤、中毒、肿痛病因等研究是有一定困难的，甚至是不日常管理和实验操作。 可能的，如急性和慢性呼吸系统疾病研究时很难重复环6.有助于全面地认识疾病的本质:临床研究未免带有一境污染的作用。辐射对机体的作用也不可能在人身上重定的局限性。已知很多病原体除人以外也能引起多种动复实验。而实验动物可以作为人类的替代者，在人为设物的感染，其表现可能各有特点。通过对人畜共患病的计的实验条件下反复观察和研究。因此，应用动物模型，比较研究，可以充分认识同一病原体(或病因)对不同机除了能克服在人类研究中经常会遇到的伦理和社会限制体带来的各种损害。因此从某种意义上说，可以使研究外，还充许采用某些不能应用于人类的方法途径，甚至工作升华到立体的水平来揭示某种疾病的本质，从而更为了研究需要可以处死动物。 有利于解释在人体上所发生的一切病理变化。 2(临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来:动物疾病模型的另一个富有成效的用途，在于能够细致临床上平时很难收集到放射病、毒气中毒、烈性传染病观察环境或遗传因素对疾病发生发展的影响，这在临床等病人，而实验室可以根据研究目的要求随时采用实验上是办不到的，对于全面地认识疾病本质有重要意义。 性诱发的方法在动物身上复制出来。 因此利用动物疾病模型来研究人类疾病，可以克服3(可以克服人类某些疾病潜伏期长，病程长和发病率低平时一些不易见到，而且不能在病人身上进行实验的各的缺点:一般遗传性、代谢性和内分泌等疾病在临床上种人类疾病的研究。同时还可克服人类疾病发生发展缓发病率很低，如急性白血病的发病率较降，研究人员可慢，潜伏期长，发病原因多样，经常伴有各种其它疾病以有意识地提高其在动物种群中的发生频率，从而推进等因素的干扰，可以用单一的病因，在短时间内复制出研究。同样的途径已成功地应用于其他疾病的研究，如典型的动物疾病模型，对于研究人类各种疾病的发生、血友病、周期性中性白细胞减少症和自身免疫介导性疾发展规律和防治疾病疗效的机理等是极为重要的手段和病等。 工具。 某些疾病潜伏期很长，很难进行研究，如肿瘤、慢二、人类疾病动物模型的复制原则 性气管炎、肺心病、高血压等疾病，这些疾病发生发展成功的动物模型常常依赖于最初周密的设计，动物模型很缓慢，有的可能要几年、十几年、基至几十年。有些设计一般应遵循下列原则。 致病因素需要隔代或者几代才能显示出来，人类的寿命 1、相似性: 期相对来说是很长的，一个科学家很难有幸进行三代以 2、重复性: 上的观察，而许多动物由于生命的周期很短，在实验室 3、可靠性: 观察几十代是容易的，如果使用微生物甚至可以观察几 4、适用性和可控性: 百代。 5、易行性和经济性: 4.可以严格控制实验条件，实验材料的可比性:一般说三、动物模型的分类: 来，临床上很多疾病是十分复杂的，各种因素均起作用，一)按产生原因分类: 患有心脏病的病人，可能同时又患有肺脏疾病或肾脏疾 1、实验性动物模型(experimental animal model)病等其他疾病，即使疾病完全相同的病人，因病人的年又称为诱发性动物模型，是指研究者通过使用物理的、 化学的、生物的和复合的致病因素作用于动物，而造成龄、性别、体质、遗传等各不相同，对疾病的发生发展 均有影响。采用动物来复制疾病模型，可以选择相同品动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类种、品系、性别、体重、活动性、健康状态、甚至遗传疾病时的功能、代谢或形态结构方面的病变，即人为地和微生物等方面严加控制的各种等级的标准实验动物，诱发动物产生类似人类疾病模型。 温度、湿度、光照、噪音、饲料等实验条件也可严格控 优点:可在短时间内复制出大量疾病模型,并可严格制。用单一的病因作用复制成各种疾病。 控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要、 无论营养学、肿瘤学和环境卫生学等方面，同一时制作方法简便、实验条件简单、其他因素容易控制。 期内很难在人身上取得一定数量的定性疾病材料。动物 不足:因是诱发的疾病,与自发的疾病有所不同;并模型不仅在群体的数量上容易得到满足，而且可以通过不是所有的人类疾病都可诱发。 投服一定剂量的药物或一定数量的肿瘤等方式，限定可2、自发性动物模型(spontaneous animal model)指变性，取得条件一致的模型材料。 实验动物未经任何人工处置，在自然条件下动物自然发 生或由于基因突变的异常表现，通过遗传育种保留下来型，以增加所复制动物模型与人类疾病的相似性，例如的动物模型。 以草食性动物兔复制动脉硬化模型需要胆固醇剂量远比 优点: 疾病的发生、发展与人类相应的疾病比较人类高得多，而且病变部位并不出现在主动脉弓，病理相似、是自然条件下发生的疾病、应用价值高。 表现为纤维组织和平滑肌增生为主，这些现象与人的情 不足:来源较困难、种类有限，而且有时保种较困况就有一定差距，这就要求研究人员要全面了解致病因难，不能大量应用。另外，自然获得性动物肿瘤与人类素与动物及方法全部信息，掌握致病因素的剂量，分析肿瘤所发生的类型和发病机制有的也有差异。 能否达到预期结果。 3、抗疾病型动物模型(negative animal model)就是(二)注意动物因素的选择 指特定的疾病不会在某种动物身上发生，从而可以用来复制动物模型应注意选用标准化和实用价值的动探讨为何这种动物对该疾病有天然的抵抗力。 物。复制动物模型时应遵循适于大多数研究者使用，容、生物医学动物模型(biomedial animal model)是指利4易复制、便于操作和采集各种标本。动物来源应注意选用健康动物生物学特征来提供人类疾病相似表现的疾病用标准化实验动物，家畜和野生动物作为模型资源的补模型。如沙鼠缺乏完整的基底动物环，左右大脑供血相充。 对独立，是研究中风是理想动物模型;鹿的正常红细胞生活在标 标准化实验动物用作模型资源其优点:?是镰刀形的，多年来被供作镰刀形红细胞贫血研究等。准化的环境内，有清楚的遗传背景和微生物控制标准，但这一类动物模型与人类疾病存在着一定的差异，研究具有较强的敏感性、较好的重复性和反应均一的特点。时要加以分析比较。 ?有严格的饲养规程。?易获取大样本进行实验和观察。实验性动物模型: 缺点是在人工控制下培育的动物与自然生长繁育的动物1)物理因素诱发的动物模型:如机械损伤、放射线损伤、有所不同，而且标准化环境的维持消耗大量的资金。 气压、手术等; 家畜生活环境与人类相似，饲养成本比实验动物低，2)化学因素诱发的动物模型:如化学药物致癌、化学毒但标准化程度低，宜慎重。野生动物也可用作模型资源物中毒、强酸强碱烧伤等 补充，适用于疾病自然发生率较低的疾病，但在实验条3)生物因素诱发的动物模型:如细菌、病毒、寄生虫、件下维持较困难，且对人、家畜直接或间接的威胁，同生物毒素等 时缺乏模型的基本信息。 4)复合因素诱发的动物模型:上述因素的复合 (三)注意近交系的应用 5)生物技术制作的动物模型: 近交系的选择应注意遗传背景清楚，反应均一、个生物技术制作的动物模型: 体差小，广泛地应用于动物模型复制，但在设计中必须嵌合体动物模型 慎重考虑以下因素。 核移植动物模型 1.近交系的繁殖方法与自然状态不同。例如自发性转基因动物模型 糖尿病BB Wistar Rat具人类糖尿病临床特征但实际中基因敲除动物模型 常并发有周围神经系统严重疾病、睾丸萎缩、甲状腺炎、克隆动物模型 恶性淋巴瘤等，因此要有目的选择，不可盲目的采用近四、注意事项 交系。 1.模型要尽可能体现所要求的人类疾病 2.近交系与其形成的亚系不能视为同一品系。要充2.注意所选用动物的实用价值 分了解新品系的特征及有关资料。 3.注意环境因素对动物模型的影响 3.即使已形成模型的品系由于育种和环境改变，仍4.不要盲目使用近交系 有可能发生基因突变和遣传漂变。即存在变种甚至断种5.不要盲目使用非人类灵长类动物 的危险。 6.正确评估动物模型 4.国外常用二种近交系的杂一代(F1)作为模型。其(一)注意致模因素的选择 个体之间均一性好，对实验的耐受性强，弥补了近交系 致模因素的选择是复制动物模型的关键步骤。应明的不足。除近交系、杂交一代外，封闭群动物(远交系)确研究目的，清楚相应人类疾病的发生、临床症状和发虽然个体间的重复性和一致性没有近效系、F1动物好，病机理，熟悉致病因素对动物所产生的临床症状和发病但遗传特性及反应性保持相对稳定，其生活力强，繁殖情况，致病因素的剂量。动物的遗传背景、性别、年龄率高、抗病力强、可以大量生产。其某些方面可选用。 等对模型的复制都有一定的影响，选择适当的致病因素(四)注意环境因素的影响 和尽量避免选择与人类相似性小的实验动物作动物模 复制模型的成败与环境因素密切相关，居住、饲料 改变、光线、噪声、氨气浓度、温、湿度、屏障系统故 障等。任何一项被忽视都可能带来严重影响。除此以外，第一节 动物实验数据的处理与分析 复制操作如固定、麻醉、手术、药物和并发症等处置不实验数据的记录和贮存 当，同样会产生不良后果，因此在复制模型时充分考虑1、实验数据的来源 环境因素和操作技术。 动物实验过程中获取的原始资料或各种数据 五、影响动物模型的因素 2、实验数据的记录 1、动物因素对动物模型复制的影响 清晰、 准确、规范 (1)动物种类的影响: 3、实验数据的贮存 (2)动物品系的影响: 记录本等，注意保存，做好备份 (3)年龄和体重的影响: 实验数据的检查和分类 (4)性别因素的影响: 、原始数据的检查与核对 1 (5)生理状态和健康因素的影响: 检查数据本身是否有错误、取样是否有差错和不2、实验技术因素对动物模型复制的影响 合理数据的订正等。 (1)实验季节: 专业检查、统计检查、人工检查和计算机检查 (2)昼夜不同时间的影响: 2、数据缺项与差错处理 (3)麻醉深度的影响: 剔除、减少样本数、纠正 (4)实验给药的影响: 3、实验数据的分类 3、环境因素和营养因素对复制模型的影响 计数资料、计量资料、质量性状资料 第二节 自发性动物模型 实验数据的分组 一、免疫缺陷动物模型 根据所得数据中所含变数的多少确定是否分组。当变数 1、B淋巴细胞功能缺陷动物 不多时(30个以下小样本)不必分组，直接统计分析。 2、T淋巴细胞功能缺陷动物 当变数较多时，需分组进行统计分析。 3、T、B淋巴细胞联合免疫缺陷动物 实验数据的统计描述 二、遗传性高血压大鼠模型 算术平均数 三、糖尿病动物模型 标准差 1、自发性糖尿病BB Wistar大鼠模型 率 2、自发性糖尿病NSY小鼠模型 构成比 3、自发性非肥胖糖尿病GK大鼠模型 第二节 动物实验数据的分析 4、自发性遗传糖尿病中国地鼠模型 取得的动物实验数据资料经整理和初步统计描述后，必四、癫痫动物模型 须采取相应的统计分析方法进行分析比较，即进行显著五、自发肿瘤疾病动物模型 性检验。 第三节 诱发性人类疾病动物模型 如:定量指标 t检验、F检验 一、心血管疾病动物模型 定性指标 卡方检验 1、动脉粥样硬化动物疾病模型 学习掌握统计学的有关知识是必要的 二、呼吸系统疾病动物模型 学会使用统计分析相关软件 1、慢性支气管炎 第三节 动物实验报告与论文的撰写及注意事项 2、哮喘性肺炎 一、动物实验报告的撰写及注意事项 四、消化系统疾病模型 动物实验报告是描述动物实验过程，记录动物实验 1、病毒性肝炎疾病 动物模型 结果的材料，是表达研究成果的一种形式。 五、造血系统疾病模型 (一)撰写动物实验报告的原则 1、贫血疾病动物模型 1、真实性 动物实验报告最突出的特征 2、维生素E缺乏的溶血性贫血模型 实事求是，绝对真实，杜绝主观，重视“反常” 六、神经系统疾病动物模型 2、可重复性 动物实验报告的关键 七、肿瘤疾病动物模型 3、可操作性 (二)动物实验报告的基本格式与要求 第十二章 动物实验数据的处理与分析 动物实验报告一般包括实验名称、实验目的、实验 器材、实验步骤、实验结果和实验结论等内容。 一、动物实验研究有时是不全面的 常用的两种格式:一般实验报告式，仿学术论文通过动物模型得到的结果外推到其他物种上是不可靠 式 。 的。 通过动物实验测试药物和其他化学物的安全性，其结果一般动物实验报仿学术论文式 是不可靠的。 告式 通过动物实验证实生物医学中的某些理论往往是不可靠题目(内容) 题目 的。 目的(原理) 引言(导言) 动物实验在生物医学研究中并不一定起关键和决定性作实验对象与用品 材料与方法 用。 方法步骤 二、动物实验有时是误导的 结果与分析 结果与分析 在动物试验中观看到的许多明显的与在人体不同的异常结论或结语(讨讨论与结论 现象，有的可能是供试动物物种本身所特有的正常的生论) 物学特性反应，也可能是非自然手段所引起的变化，或附录:原始记录， 附录:原始记录 是由于实验室环境的应激反应所致。这种异常性与人类公式推导，参考文献等 的病理变化毫不相关。 (三)注意事项 动物试验结果误导的事例。 撰写动物实验报告应以事实为根据，不得修改、编造数 应用动物试验进行研究和检测，只是许多可用的实验技据。 术之一。 报告要求格式标准、整洁、图表准确、字迹端正、简明 第二节 动物保护 精练。 一、国外动物保护动动的兴起及动物保护法规 写报告不得使用圆珠笔，绘图宜用铅笔。 二、动物实验与动物保护之间的争论及人们的反应 注意文字规范，用词专业，语句通顺。 第三节 动物实验中提倡“3R” 计量单位与统计学符号应按有关规定书写。 Replacement 替代 二、动物实验论文撰写的注意事项 Reduction 减少 应当重视实验动物应用状况的描述 Refinement 优化 1、实验动物种系名称 第四节 进行动物实验应遵循的基本原则 准确描述实验动物的种系名称，不用不规范的俗 一、动物实验应遵循的基本原则 名，如“大白鼠”、“小白鼠”、“黑鼠”等。 研究目的明确 2、实验动物质量及来源 人道地使用动物 实验动物的遗传学控制分类、实验动物微生物学控 符合“3R”原则 制分类，提供实验动物的单位名称及生产许可证号等。 饲养管理标准化 3、性别、规格等 掌握必要的实验知识 动物准确数量、性别比例、体重及年龄、健康状况 二、确保遵循原则的措施 4、动物实验条件 加强动物实验管理 动物饲养环境条件、动物实验环境条件，动物饲养管理 强化研究人员的继续教育 方式 发挥动物管理部门的职能5、动物实验的某些处理方式 动物实验设计分组:随机、对照 麻醉剂:种类、剂量、给药方法 “麻醉后……” 动物的处死方法: “处死后……” 第十三章 动物实验研究的局限性及动物保护与替代问题 第一节 动物实验研究的局限性