无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质方法的建立与评价

无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的建立与评价 无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质方法 的建立与评价 第26卷第2期河北医科大学Vo1.26No.2 2OO5年3月JOURNAlOFHEBEIMEDICALUNIVERSITYMar. 2005.127. ? 研究快报? 无胶筛分毛细管电泳检测微量蛋白质方法的 建立与评价 赵京山,温进坤,韩梅 (河北医科大学基础医学研究所,河北省医学生物技术重点实验室,河北石家庄050017) 【主 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 词】电泳,毛细管;聚乙烯二醇类;研究技术 【中图分类号】Q5o3;0658【文献标识码】B 无胶筛分毛细管电泳(non—gelsievingcapillary electrophoresiS,NGSCE)是近年来发展起来的一 种用于检测核酸的新方法,与毛细管凝胶电泳相比, 具有向毛细管内注入筛分介质方便,易于冲洗,毛细 管可反复使用,以及便于实现自动化等优点. NGSCE一般以非交联的高分子水溶性化合物作筛 分介质,常用的有水溶性纤维素衍生物,聚吡咯烷 酮,线性聚丙烯酰胺等.我们尝试采用非涂层管,以 大分子聚乙二醇20000(polyephelenglycol20000, PEG20000)为筛分介质,以NGSCE模式进行蛋白 质样品的检测,通过对缓冲体系,筛分介质浓度,上 样量等分离条件进行优化,取得了良好的效果. 1材料与方法 1.1仪器及试剂:P/ACETMMDQ毛细管电泳分 析系统为美国BECKMAN公司产品,甲醇,PEG 200:00为色谱纯,骨桥蛋白(osteopontin,OPN)为 本室分离纯化,其它试剂为进口或国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯. 1.2毛细管电泳条件:非涂层毛细管总长度为57 cm,有效长度为50cm,内径为75m(河北锐沣色 谱器件公司产品);电泳缓冲液为150mmol/I硼酸 盐缓冲液(PH10.0,含有30g/IPEG20000);检测 波长为214nm;分离电压23kV;压力进样0.5psi x5S;检测温度为25?. 1.3方法的评价:利用重复实验.以OPN的迁移 时间为评价指标,评价NGSCE法的重复性;采用线 [收稿日期]2005—01—25;[修回日期]2005一O1—3] [基金项目]国家自然科学基金(No30270499)和河北省自然科 学基金(No303454)资助项目 ),男,河北藁城人,河北医科大学基 [作者简介]赵京山(1969一 础医学研究所医学硕士研究生,从事心血管分子生物学研究. *通讯联系人:温进坤,教授,博士生导师.Tel:(03l1) 6265563,E—mail:wjk@hebmu.edu.cn 【文章编号】1007—3205(2005)02-0127一O2 性关系和灵敏度实验,通过对OPN标品的倍比稀 释,依次经NGSCE方法检测,确定所建方法的灵敏 度及峰面积和OPN浓度之间的关系;利用回收实 验,根据OPN的浓度和峰面积计算回收率. 2结果与讨论 2.1NGSCE方法的建立:通过对实验条件进行优 化,成功建立了一种采用非涂层管,以PEG20000 为筛分介质,检测微量蛋白质的无胶筛分毛细管电 泳方法.重复性实验表明,三批测定的批内变异系 数分别为2.21%,2.02,2.30;批间变异系数 为2.16%,均<5.灵敏度和线性关系分析显 示,OPN含量与峰面积在(0.079,2.5)mg/mL的 范围内线性关系良好,其直线方程为Y一39019x+ 1193.8,相关系数为0.996,最小检测限为0.079 mg/mL.回收实验结果显示,所建方法的回收率> 95%. 2.2NGSCE条件的优化:单用50mmol/L硼酸盐 缓冲液(pH7.5,10.0),50mmol/L磷酸盐缓冲液 (pH7.5,10.0)作电泳缓冲液时,OPN的分离效 果均不理想;适当提高缓冲液的离子强度(150 mmol/L硼酸盐缓冲液),分离度虽有所改善,但电 流较大,仍不能满足检测需要.在该电泳缓冲液中 加入改性剂PEG20000后,电流变小,电渗流趋于 稳定,可显着提高分离度.当PEG20000大于其临 界浓度(25g/I)时,形成交缠溶液而产生筛分效应, 此后随浓度升高,筛孔缩小,位阻效应增强,OPN的 迁移时间延长而峰型不再改变.因此,PEG20000 是一种优良的筛分介质. 本实验观察了pH值,电压,上样量等因素对分 离度的影响.发现适当提高电泳缓冲液的pH值 (pH7.5,10.0)使多数蛋白质分子带上负电荷,因 其与管壁所带电荷相同,相互排斥,有利于减少蛋白 质在管壁的吸附,减少断流现象.当电压<23kV ? 128? 第26卷第2期河北医科大学Vo1.26No.2 2005年3月JOURNALOFHEBEIMEDICALUNIVERSITYMar.2005 时,提高电压,OPN迁移时间缩短,分离度增加;但 当电压>23kV时,因产生焦耳热增加,分离度减 小,基线上移,噪声增大.进样量对分离度有明显的 影响,进样量大,峰展宽,分离度下降.进样量少,不 易检出峰.0.5psi的压力,进样5S峰形较好,分离 度较高. 2.3NGSCE方法评价:以OPN纯品进行重复性 实验,结果显示,批内,批间变异系数均<5;灵敏 度和线性关系分析显示,OPN含量与峰面积在 (O.079,2.5)mg/mL的范围内线性关系良好,最 小检测限为0.079mg/mI;回收率>95.以上 结果说明该方法的重复性,最小检测限和回收率均 能满足微量蛋白质检测的需要. 总之,本实验采用非涂层管,以PEG20000为 筛分介质,建立的检测微量蛋白质的NGSCE方法 具有检测速度快,纳升级进样,自动化程度高,可直 接定量等特点.该方法在微量蛋白质样品的检测方 面具有良好的应用前景. ? 研究快报? MAPKs参与一氧化碳抗大鼠肢体缺血再灌注 所致肺损伤的作用 周君琳?,凌亦凌,朱晓光,黄新莉 (1.河北医科大学第三医院手外科,河北石家庄050051;河北医科大学基础医学院 病理生理学教研室,河北石家庄050017) 【主题词】一氧化碳;局邵缺血;肺;冉攫拄损伤;大鼠 【中图分类号】R363.2【文献标识码】B【文章编号】1007—3205(2005)02—0128 —02 研究表明,肢体缺血再灌注(ischemia一32只,河北省实验动物中心提供.以橡皮止 血带绑 reperfusion,IR)损伤不仅局限于局部,严重时尚可扎双后肢根部造成肢体缺血,4h后松开止血带使 引起远隔脏器的损伤.其中肺是易受累的首位靶器肢体血流再灌注.将动物随机分为4组(每组8 官,表现为急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征.血只):对照组,对照+CO组,IR组和IR+CO组.对 红素氧合酶(hemeoxygenase,HO)一1是近来发现照组给予同样的麻醉和操作,只是不造成肢体缺血. 的一种可被氧化应激和炎症反应所激活,并对机体IR组使双后肢缺血4h再灌注30min.对照组和 具有保护作用的热休克蛋白,其催化产物之一——IR组动物暴露于室内空气中.IR+CO组和对照+ 一 氧化碳(carbonmonoxide,CO)的生物学功能正CO组动物分别于再灌注前1h和相应的对照时间 受到人们极大的关注.本室前期研究结果显示,外点置含有0.025CO的空气中,直至再灌注后3 源性小剂量CO具有抗肢体IR所致肺损伤的作用.min.光镜下观察肺组织学以及肺组织间隔中中性 为探讨其作用机制,本研究进一步观察了外源性粒细胞(polymorphonuelearneutrophil,PMN)数目 CO抗肢体IR所致肺损伤时肺内有丝分裂原活化的变化.应用Westernbloting检测肺组织中三种 蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,磷酸化MAPKs,即细胞外信号调节激酶 MAPKs)的变化.(extraeellular—signalregulatedproteinkinase, ERK),c—Jun氨基末端激酶(c—JunNH2一terminal 1材料与方法kinase ,JNK)~p38表达的变化.结果以(?s) 实验采用体质量200~250g健康雄性sD大鼠表示,应用不配对t检验进行显着性 差异比较,以P <O.05为有显着性差异. [收稿日期]2004—1I-12;[修回日期]2005—02—01 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30271337) [作者简介]周君琳(1966一),女,河北新河人,河北医科大学第 三医院副主任医师,副教授,医学博士,从事手外科疾病诊治研究. *现工作单位:100020,北京,首都医科大学附属北京朝阳医院 骨科 2结果 对照组和对照+CO组肺组织结构基本正常; IR组肺组织出现水肿,出血,肺不张以及PMN聚 集等病理征象;IR+CO组上述病理变化显着减轻. Westernbloting检测显示,对照组和对照+CO组肺