【doc】试用ICAM—1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共刺激效应

【doc】试用ICAM—1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共刺激效应 试用ICAM—1相关小分子肽抑制角朊细胞 介导的共刺激效应 一之. - 402- ? 免疫学技术与方法? 试用ICAM.1相关小分子肽抑制角朊细胞介导的共束4激效应 餐(白隶恩医科大学基础医学院免疫学教研室,长春002)j}Z 中国图 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 号分类号Q1~9'2.12 摘要目的:探讨ICAM一1相关肽抑制角朊细胞将超抗原TSSq'-I递呈给T淋巴细胞.方法:应用鼠抗人cD54单克隆抗 体筛选噬菌体随机十五肽库,经4轮筛选后,挑取20个克隆进行测序,利用含保守序列的阳性克隆噬苗体对角朊细胞递呈超 抗原TSSq'-1路T细胞进行阻断试验.结果:得到保守序列为?稻KPGP阢,所筛选的阳性噬菌体克隆与野生型噬菌体相 比具有明显的阻断效应(P<0_01).结论:ICAM-1相关小分于肽可望降低超抗原介导的皮肤炎症反应. 关键词竺里竺垦至垫苎细胞间粘附分子一中毒性休克综合征毒素一璺里,!f InhibitingtheCO-stimulatingeffectofkeratinocyteusingICAM-1related曲de ZI~6"VGMing.j『vGGui—Zhen.Depart.~..ntofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedialSciences,Changc hun 】3fK)21 AbstractObjective:%exploretheinhibitingeffectofICAM一1relatedsenPeP叫e0Ilkeratin~3'teswhichpntsuperanfigen qx3ST-1toTcellsMethods:Usedmouseanti—humanCD54MeAbtoscmephagedisplay15-rr'pepfidemrdmnHbraAfter4roundselee— fionschese20clonesatrandomandanalyzedtheDNAser-cesUsedthephcontainedccasev,'a live宕eqIncestoMeekthatkerafinoc~tes ntsuperantigenTSST-It0TcellsResults:TheconservativearDinoacids.qunceisrmSFQSS MEr~PPG.Theblocldngeffect0fpositive colonalphageissigniilcataly啦啊目c邮predththatofdtypephage(P<0.01).Can~asiem:ICAM-1relatedsmallpe~idecouldre— duceskinbtflammatim~mediatedby. superantigens KeywordsPhage&playSuperanligenlmemenularadhesionmolecule-1ToxicShocks ya~drometoxin-1Kera6noe~es 细胞间粘附分子一1(hatemellularadhesionmole— cule一1,ICAM-1)是一种表达于多种细胞表面的跨膜 糖蛋白,是最早发现的免疫球蛋白的超家族粘附分 子之一.通过与其相应的配体整台素家族成员之一 的LFA1相互作用,在介导细胞的信号转导与活化, 炎症反应及创伤愈合等一系列重要的生理和病理过 程中发挥重要作用.正常情况下,人表皮角朊细 胞(keratinoevtes,KC)不表达ICAM一1,但在许多炎症 性皮肤病病损处,KC可表达ICAM1,体外试验表 明,经IFN一处理培养中的人类KC可表达MHC1I 类分子及ICAM一1;免疫组化研究表明表达ICAM lrKCgnLFA一1阳性T细胞可同时集中于某一部位, 表明ICAM一1在皮肤炎症过程中发挥着重要作用. 因此,寻找一种ICAM一1的拮抗物来阻断ICAM一1 LFA一1介导的细胞粘附将有助于缓解炎症反应的发 生.本文应用噬菌体展示技术(Phagedisplay)钓取 ICAM一1的相关序列并对其在KC辅助超抗原介导的 作者简介:张明.男,34岁,博士研究生,主要从粤H胞及分子免嫂 学研究,现在白求恩睡科大学附属二院皮肤科 T细胞增殖中的封闭效应进行了研究. 1材料与方法 1.1材料K91菌株,野生型噬菌体n甜,测序引 物均为美国密苏里大学Smiths博士惠赠;'I7DNA聚 合酶测序试剂盒购自Promega公司,P-dATP购自北 京亚辉公司;鼠抗人CD54,?一DR单抗购自北京中 山生物技术有限公司;TSST-1,人基因工程重组? 购白军事医学科学院. 1.2噬菌体十五肽库的筛选链亲合素包被聚 苯乙烯培养皿,4?过夜,2%BSA封闭37?1h, TBS洗3遍,加人生物素化抗ICAM一1抗体4?过夜, 次日洗去未结合的噬菌体,测滴度用于下一轮筛选. 共进行4轮筛选,回收率稳定. 1.3阳性克隆噬菌体单链的制备取4轮筛选物 测滴度,随机挑取加个单克隆经扩增,PEG沉淀回 收噬菌体,2C0ulTBS溶解测滴度,留leo出备用,另 leol经酚:氯仿,异成醇抽提,乙醇沉淀后经琼脂 糖电泳证实. 1.4阳性噬菌体克隆DNA序列分析用saI1双 r,,/ 脱氧末端终止法对所提单链进行测序,测序方法参 照Promega公司T7DNA聚合酶测序试剂盒说明书 电压2200v,预电泳3O一40min,正式电泳3,4h. 1.5含有保守序列的阳性克隆噬菌体的阻断活性 检测 1.5.1经尼龙毛柱法分离T淋巴细胞流式细胞 仪检测T细胞纯度为94.2%,台盼蓝排除试验,细 胞活力在98%以上.调细胞浓度1×l旷lml. 1.5.2角朊细胞培养参照文献[6取培养1W的 角朊细胞经IFN.r(5ooU/m1)处理48h,取少量细胞 置C)~ospin制片,应用免疫细胞化学染色法检测 ICAM一1及HLA—DR,剩余细胞调成浓度1×1/ml备 用. 1.5.3经扩增的单克隆噬菌体及野生型噬菌体 Fusel经O.22pin微孔滤膜过滤除菌测滴度为1× 10/ml备用. 1.5.4T细胞增殖阻断试验于96孔细胞培养板 内加入1×1,孔IFN一7处理的KC.加丝裂霉素(终 浓度25t~m1)37~C水浴30min后弃上清,实验组加 入含保守序列的阳性克隆噬菌体,对照组加入空载 体Fuse1,共设l,105,10",1,0共5个梯度,最后 各孔均加含'ISST-1(终浓度10m1)的T淋巴细胞 悬液100ta(含1×l细胞)375%c培养48h 后.用MqT法检测. 2结果 2.1筛选及单链提取经4轮筛选回收率稳定在 10..一10,所提单链DNA分子量位于9000bp (图1). 2.2测序结果共得到12个可读序列.保守序 Mw( 15 10 7 2 图1阳性克隆单链DNA琼脂糖电泳 Rg.iElectroN~oreticalv出oft~a4tlvephagedonalssDNA 图2阳性克隆的保守核苷酸序刊 Kg.20艘v蚰ve珊lde咖esequaneeofp0e#lage clam AB 图3免疫组织化学染色检测KC表达IqlLA-DRfA)和 ICAM-I(B) F.3ObservatimlofIlIA-DR(A)OrICAM.1(B》一,,EssPd 加thesm'faeeofKC;by.瑚如如哪岫妇60由?stahli~ Ncce:a.IFN一一ua~treatedKCIblT-恤删KC 3? 2.s l2,0 堇Ls. 1.0 O_s O l010'10ln' Dilulionofphage 图4阳性克隆对KC逛呈超抗原TSST-I给T细胞的阻龋 作用 Fig.4Theblockingeffectofpcpll咿donemkel'afi~~- 0whichpresentsupe,-a,ltt~TSSTdtoTcells te;?蜊np刊with1dtypeph~e(P<001) 列为5'ATTACTCGCAG'IT1TGAGTCTAGTA1?AGC— CTGGTCCGCCTGGT-3'(图2),经推断其氢基酸序列 为lle—Thr-Arg-Ser-Phe—Glu.Set-Set-Met.Clu.Pro—Glv_ Pro—PID-GIv即1TRSFQSSMEPGPPG 2.3KC表达HLA—DR及IC_AM.1免疫细胞化学染 色结果表明一7处理的Kc可表达HLADR分 子及IC~aM一1阳性反应细胞膜呈棕褐色物质沉着而 IF'N一7未处理的角朊细胞不着色(图3,图4). 2.4阻断试验结果表明所筛选的克隆噬菌体在 10b及l05滴度的情况下对Kc辅佐超抗原活化T细 胞增殖具有显着的阻断作用,而应用野生型噬菌体 无此作用(P<0.01),说明所筛选阳性克隆噬菌体 所表达的短肽在此发挥了作用,尽管本实验未观察 到阳性克隆噬菌体的最大封闭效应所具备的滴度, 但在所设的滴度范围内,其封闭作用与噬菌体的滴 度呈正比(图4). 3讨论 噬菌体展现技术(Prl且displaytechniques,PDT) 是由美国Smith博士于1985年首次提出并建立和发 展起来的利用丝状噬菌体在体外表达外源基因的一 项新技术,其要点是,以经过改建的噬菌体为载体, 将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基园P?或P? 区,从而使表达的外源短肽或蛋白质表达在噬菌体 表面,并使表达产物保持良好的空间构象并发挥良 好的生物学活性,从噬菌体肽库中筛选目的短肽是 研究蛋白质分子之间相互作用的一个有效工具. 根据上述原理我们利用鼠抗人ICAM一1McAb从随机 十五肽库中筛选出可与抗ICAM.1McAb结合的噬菌 体,从理论上讲,该噬菌体表面表达的随机小肽(十 五肽)即为ICAM-序列中的某一段或与其高度同源 的相关序列.近年来研究表明,在超抗原介导的炎 症性皮肤疾病中,角朊细胞可以作为抗原递呈细胞. 辅佐超抗原活化T淋巴细胞,角朊细胞成为APE 的前提条件是在IFN-7作用下表达MHc?类分子 及IcAM一1,ICAM一1与T细胞表面的LFA.1相结合, laVA1应用抗ICAM-1及单克隆抗体可以阻断二者 的结合.我们的实验结果表明IFN.处理的KC 具有辅助超抗原TSST-1诱导T细胞增殖,进一步应 用抗ICAM.1单抗筛选出的阳性克隆噬菌体具有阻 断角朊细胞辅助超抗原TSST-1引起的T细胞增殖. 推测所筛选的阳性克隆噬菌体表面表达的短肽可能 与含有I且一1结合有关的序列,因而可以与位于细 胞表面的ICAM—L共同竞争与T细胞表面的LFA.1 相结合,从而在一定程度上减少了I(2~M.1I|FA一1 介导的细胞粘附,即降低了角朊细舱递呈超抗原给 T细胞时ICAM.1所提供的共刺激效应,在上述情况 下,超抗原TSST-1不能或不足以引起T细胞的活 化.由于对照组采用了不含外源插入基因的野生型 噬菌体,从而保证了这种封闭效应是来源于插入小 可以推测,根据已知序列 肽序列而非噬菌体本身. 人工台成ICAM.1相关的小分子肽可望成为缓解超 抗原介导乃至其他免疫相关的皮肤炎症反应的一种 新的手段. 4参考文献 1金伯泉主编细胞和分子免疫学西安世界图书出版公司. 1995:31,61 2‰KH,I)ebbiT,ckBSda/.d目T口alk哪吨伸ealnessthe ?瑚岫1me/~:uleintetcdlularadhez/onmdeeu/e-1inir,Em~atmyder- mntos~.JInvestD目r.1~9;92:746,750 ,Winiski^P.?CAICAM-1qman日d7h m肌k日址?y船cel1]ine:Charnaerln~nasi咄oe//一E/JSA韶一 myJInvestBcm~o1.1992:99:48—52 4Bash~TY.Niclok~"BJ,MeriTC#a/.Recq:nbi~tmin一 【eTinduces}nR瑚帆叫h—k舯啪J lnv~t1)~matd.1984;83:88,9o 5sl印h即FP.SmithGP"body?.em嘶叫嘶of啦vt峨: effmi~'?ofta,ga0?(e.1988;73(2):3~5 6F~iraJC.GrdoB,VollmerSda/.Tcellcloneafrom|s01dn1e一 pr~rootekeratlnocy0eproliferati~in"aImoduetz EurJInmll0.1994:24:593 7鲍永利,富宁.杨贵贞噬菌体表达短肽模拟脂多糖类脂A表 位的研究中国免疫学杂意.1999:15(2).593 8sko-..L,B?g毗d0.Superanfige~:DotheyhaveatoteinskindIs ^rdLD~msto1.1995~131:829 9NiekdctfBJ,MitraRS.o?Jda/.Accessorycellfrncli~keaxtin. oey细forsuperanngtmsJItrmtmd.1993;~50(6):219~. 10StrangeP.s}l叶L,B日出O.Jm响nh姐Ikrn0c VakT础ginthepre~eneeofb目e?:Invm?tof『nl histoca'nl~fihll时cle8c【删j?r.衄I?JInvestDenmntol,1994; 102:150 [收稿l99加修回1999.06-0.5] (编辑徐杰) 欢迎订阅《中国免疫学杂志》