冷却牛肉储藏过程中腐败菌多样性的研究(可编辑)

冷却牛肉储藏过程中腐败菌多样性的研究(可编辑) 冷却牛肉储藏过程中腐败菌多样性的研究 上海海洋大学 硕士学位论文 冷却牛肉储藏过程中腐败菌多样性研究 姓名:李正堂 申请学位级别:硕士 专业:食品科学与工程 指导教师:李柏林 20081230上海海洋大学硕士博士学位论文 摘 要 本论文采用克隆建库法、.变性梯度凝胶电泳法以及纯培养的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 初步比较 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了相同销售条件下的未包装冷却牛肉与保鲜膜包装冷却牛肉中 的微生物群落结构。通过采用 的区片段进行.变性梯度 凝胶电泳,同时利用 全长序列,通过克隆文库技术对两个样品的微 生物群落结构进行研究。与此同时利用常用纯培养的方法,根据细菌的菌落形 态、菌落颜色、革兰氏染色等常见特征,从市售冷却牛肉中,选取菌落形态差别 比较明显的菌株进行研究。 通过分子克隆的方法研究发现: 微生物群落结构表现出较大的差异。保鲜 ,主要为 膜包装冷却牛肉共有个 乳球菌属,%,乳杆菌属,%,肉品杆 菌属,%和索丝菌属,%;未包装冷却牛肉则共得到个 ,主要是乳球菌属,%,索丝菌属,%, 不动杆菌属,%。结果表明,保鲜膜包装对于葡萄球菌属以及 冷杆菌属等一些细菌都起到了一定的抑制作用。 通过纯培养的方法研究发现:从未包装冷却牛肉和保鲜膜包装冷却牛肉中挑 选出差异较明显的菌株共株,其中保鲜膜包装冷却牛肉样品共株,未包装冷 却牛肉样品共株;同时选取两样品中的优势菌株各株进行进一步的研究株 细菌编号为:一,其中一为未包装冷却牛肉样品:一位保鲜膜包装冷却牛肉样品,通过 序列等进行分类研究,确定该细菌的分类地位,并结合 以及 形态、常规生理生化特性进行鉴定,确定各细菌所属种。实验表明:为假单 胞菌属中的恶臭假单胞菌.,为希瓦氏菌属下的 . .,而和为希瓦氏菌属下的腐败希瓦氏菌 .,为窄食单胞菌属中的嗜麦芽窄食单胞菌 ,为嗜冷杆菌 .,为葡 萄球菌属中的松鼠葡萄球菌.,为微杆菌属中的产左聚 上海海洋大学硕士博士学位论文 糖微杆菌.。实验证明两样品的共有优势菌为希瓦 氏菌属。 通过实验分析比较冷却牛肉中微生物多样,初步得到一定的理论 数据,为以 后冷却牛肉中预测预报模型的开发、群体感应效应的研究以及牛 肉的保藏和销售 提供一定的理论基础。 关键字冷却牛肉, 克隆文库法, ,,微生物群落 结构,分离与鉴定 , . , ,. , ,,. ;, %,%,%%; ,%, %,%.上海海洋大学硕士博士学位论文 糖微杆菌.。实验证明两样品的共有优势菌为希瓦 氏菌属。 通过实验分析比较冷却牛肉中微生物多样,初步得到一定的理论 数据,为以 后冷却牛肉中预测预报模型的开发、群体感应效应的研究以及牛 肉的保藏和销售 提供一定的理论基础。 关键字冷却牛肉, 克隆文库法, ,,微生物群落 结构,分离与鉴定 , . , ,. , ,,. ;, %,%,%%; ,%, %,%.上海海洋大学硕士博士学位论文 . , , , ; ; ., :,?. ;一 .’ . :..; .;.; .; ?.. ; .;.., . ,乙气, , , 褥髯澎占违 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同 意学校保留并向围家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版,允 许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文 的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或 扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 口 保律 ,: 午街后通川小版十义。 小。、??沦义槭: 学移论义作彬‘掺私: 指吁教掺彩: 李盘谨 ‖ ?针:蝴‘’,』,夕 ?叫刀?川么上海海洋大学硕士博士学位论文 第一章 引 言 自改革开放以来,我国的畜牧业得到了空前发展,肉类产量己连续十年居世 界第一。随着人民生活水平的‘提高,人们所关注的从以前的“民以食为天”转变 为更注重于肉食品的安全卫生质量即“民以安为先”,同时对于肉的加工体系和 消费形态有更高的要求,正是在这样的要求下冷却肉正逐渐被广大市民所接受, 而冷却肉便是国外目前广泛应用的肉类制品。近年来,我国一些大城市也逐步在 示范推广。 在中国,主要有二种肉类产品:鲜肉和冻肉。大多数人仍喜欢凌晨宰杀、清 早上市销售的或畜禽“活杀后热气腾腾的鲜肉,而且一直被认为是最新鲜最安 全卫生的肉。实际上,这是一种认识上的误区,因为刚刚被宰杀后的畜禽会发生 一系列变化,产生的热量会导致肉温升高,有时温度可达?,而后慢慢 降至常温,而热鲜肉为微生物的繁殖提供了适宜条件温度、水分和养分等,结 果会使食物中毒的危险性大大升高,不易保存。同时,刚死不久的动物呈尸僵状 态,其肌肉纤维僵直,只有经过解僵、后熟过程后,氨基酸、蛋白肽类等风味物 质才能形成,肉的味道才会鲜美。这一过程所需的解僵时间,猪为天,鸡为 天,而牛则要天。冷冻肉是指在低于零下?的环境中冻结保存的 肉,肉组织呈冻结状态。虽然低温可抑制微生物的生长繁殖,有利于肉制品的长 期保存,但因冷冻肉在食用前解冻时,肌细胞中形成的冰晶会刺破细胞膜,造成 汁液流失,使肉的营养价值和风味受到影响或劣变,烹食后觉得粗糙无味。 我国肉类产量世界第一,但冷却肉加工率不足%。近几年来,我国肉类消费 发生了明显的结构性变化,呈现从冷冻肉一一热鲜肉一一冷却肉的发展过程。 冷却肉的问世,被称为“肉类消费的革命”。冷却肉将以柔嫩多汁、味道鲜美、 营养丰富、安全卫生等优势而得到前所未有的发展,将逐渐取代 热鲜肉和冷冻 肉,成为我国肉类消费的主流,在一些城市出现了冷却肉的消费热潮,市场份额 在逐年扩大。年的一项行业研究结果显示,在我国收入较高的发达城市,冷 却肉已占到人均年消费肉量的%%。随着人民生活水平的提高,冷却肉将是 鲜肉发展的必然趋势。 上海海洋大学硕士博士学位论文 .冷却肉的特点 冷却肉是指对严格执行检疫制度屠宰后的畜禽胴体迅速进行冷却处理,使胴 体温度以后腿为测量点在内降为..。,并在后续的加工、流通和销售过 程中始终保持在~?范围内的鲜肉。冷却肉从屠宰到销售过程,大约要经过 天时间,在此期间肉完成了解僵、后熟变化,质地变得柔软有弹性,营养物质充 分保持。冷却肉在冷却加工过程中,肌肉通过自溶酶的作用,使部分肌浆蛋白质 ., 分解成肽和氨基酸,成为肉浸出物的成分。同时分解成次黄嘌呤 核苷酸,且 肌肉中肌原纤维的连接结构会变得脆弱并断裂成小片化,使肉变得柔嫩多汁并具 有良好的滋味和气味,口感细腻,滋味鲜美,安全卫生,是目前市场上质量最好 的生鲜肉。与热鲜肉、冷冻肉相比,冷却肉具有以下突出的优点: ?冷却肉安全卫生,保质期长。与冷鲜肉比较,冷却肉从; 、流通到销售各 环节始终处于?温度范围,有效地抑制了引起肉类腐败变质的革兰氏阳 性芽孢菌和无芽孢菌、球菌、霉菌等适温性腐败菌的生长繁殖。能避免消费 者因食用被沙门氏菌、大肠杆菌、肉毒梭菌和金黄色葡萄球菌等致病菌污染 的肉类而引起的食物中毒。既使肉类维持了新鲜状态,又具有较长的保质 期。一般热鲜肉的保质期只有,而冷却肉的保质期可达周以上。 ?食用品质好。冷却肉从加工到零售消费大约需要天时间,经历了较为充分的 解僵成熟过程。因此,冷却肉不仅柔嫩多汁,风味改善【,而且保证了肉的营养 价值【。 ?冷却肉食用方便。冷却肉不仅具有不用解冻即买即用的方便性,而且在冷却 肉生产过程中,多配合有按食用特点设置的分割利用程序,呈现分割肉状 态,为消费者提供了极大方便,符合现代人们消费的理念。 .我国冷却肉的发展现状 在世纪年代,我国开始了对冷却肉的研究与生产,但由于经济、技术等 方面的原因,发展相对滞后。我国冷却肉加工成套技术与国际领先水平尚有很大 差距,而且加工水平参差不齐,数量少、规模小,产品的质量还达不到要求,冷 却肉在生产、销售并不能完全抑制一些嗜冷微生物的生长和繁殖,因此 冷却肉货架期短、表面褐变及汁液流失情况还较严重。在我国的广大农村和城市 上海海洋大学硕士博士学位论文 大部分的人还是习惯于消费热鲜肉。发达国家生肉供应中的%是冷却分割肉, 而在我国基本上是低附加值的白条肉,分割肉不足%。我国肉类行业技术发展 的重点之一就是要发展冷却肉制品,提高冷却肉的市场占有率: 改善低温肉制品 的加工 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 ,提高肉制品的货架期。封目前我国冷却肉的生产已经呈现出强劲的 发展势头,一些肉类加工企业把冷却肉列为主打产品但是在我国现有的多个 肉类加工企业中只有少数几家涉足冷却肉的生产,如:河南双汇集团、湖南唐人 神集团、江苏雨润集团、北京千喜鹤集团、山东金锣集团、得利斯集团等,他们 潜在的冷却肉生产能力也只有十几万吨。就目前来看,我国冷却肉生产远未发展 到“走上城市居民餐桌”、“在肉类消费中占有一定比例”的阶段。如何让冷却 肉走上百姓餐桌,以冷却肉消费替代热鲜肉、冷冻肉消费仍是亟待解决的问题。 .冷却肉发展中存在的问题 早在上世纪、年代,发达国家就已经开始冷却肉的研究与推广。时至今 日,欧美和日本等国家已形成了科学的加工工艺和流通技术,以及完善有效的质 量控制体系,在这些国家的食品超市和商店中出售的几乎全部是冷却肉。在我 国,冷却肉的发展尽管给我国肉类市场开辟了新的空间,展现出了蓬勃的发展前 景,但目前冷却肉在市场上并未普及,究其原因主要有以下几个方面: .消费意识上的误区 “半夜宰猪,早市卖肉”这是我们千百年来普遍的习惯。基于长期以来的消 费习惯和认识上的错误,广大城乡居民热衷于热鲜肉,他们认为热鲜肉更新鲜、 更卫生,这是不科学的。要改变这种不科学的肉类消费结构,首先应从消费意识 入手,以多种形式的科普宣传活动来帮助广大居民了解和认识冷却肉,引导他们 转变观念走向科学合理的肉类消费。 .消费水平的限制 由于冷却肉的加工、流通、零售过程中要求非常严格的冷链条件,这比定点 屠宰并在农贸市场直销的热鲜肉无疑需要更大的投入。冷却肉一般需要在有冷链 条件的超市销售,其产品价格往往要上浮%%。所以,冷却肉的生产成本 高、价格较贵以及消费者对冷却肉的认识程度不足,使得肉类生 产企业在发展冷 却肉生产时面临较大的市场风险。因此,加大冷却肉的研究力度,制定科学合理上海海洋大学硕士博士学位论文 的加工工艺,降低冷却肉的生产成本,并随着人民生活水平的进一步提高,冷却 肉的普及将成为必然。 .冷却肉的腐败变质机理 造成冷却肉腐败变质的原因有微生物污染和脂肪酸败两个方面,而微生物污 染并大量繁殖是冷却肉腐败变质的主要原因【。冷却肉表面细菌数达到/ 时,冷却肉开始出现腐败变质,在腐败菌的作用下,蛋白质首先分解为肽,并经 断键分解为氨基酸,氨基酸及其含氮低分子物质在相应的酶作用下进一步分解, 冷却肉表现出腐败特征。氨基酸经脱羧、脱氨分别形成胺类和羧酸,氧化脱氨亦 可生成酮酸,进而形成羟酸、醇等。由甘氨酸、鸟氨酸、精氨酸、组氨酸和色氨 酸可分解甲胺、腐胺、尸胺、组胺、色胺等腐败胺类和酚及吲哚等物质,最后生 成硫化氢、甲烷、硫醇、氨和二氧化碳等,冷却肉在这一系列分 解过程中产生大 量毒性物质,并发出令人厌恶的臭味。 .冷却肉的微生物污染源 健康牛肉组织内部是无菌的,在屠宰、分割、加工、包装、贮藏、运销等过 程中,屠宰环境、周转器具和生产用水中含有大量的微生物,会对冷却肉造成污 染。如果条件适宜,腐败微生物就会大量繁殖,使冷却肉迅速腐败变质。冷却肉 加工厂的用水~般为自来水,国际水质 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 规定自来水细菌总数不得超过个 /。 在冷却肉生产中,无论是胴体的清洗,加工设备、容器等的清洗,车间墙壁 地面的保洁都需大量的水,水中含有的微生物种类和数量与冷却肉的污染有密切 关系。另外,泥土中的微生物也会造成冷却肉的污染,表层泥土大约含有 ~个细菌,一般病原菌在土壤中不会繁殖,但可以生存一段时间,土壤中 本身还存在一些能够长期生活的厌氧病原菌。一般室内空气含菌量为~个 /“,特别是耐干旱的革兰氏阳性菌最常见,空气含尘埃越多,含菌量越多,高 的可达个/:’以上,肉品暴露在空气中,污染难以避免。 胴体表面初始污染的微生物主要来源于动物裸露在外的器官如皮、毛、嘴 和屠宰环境。在卫生状况良好的条件下屠宰动物,表面的初始菌数为~ /,其中%%能在低温下生长【】它们大多数来自动物粪便和表皮, 上海海洋大学硕士博士学位论文 少部分来自土壤、水和植物,也有少量来自粪便。初期肉表面的微生物只有通过 循环系统或淋巴系统才能穿过肌肉组织进入肌肉深处,而淋巴系统对细菌起过滤 作用,当细菌数量较少时,淋巴细胞能将其吞噬和消化;当肉表面的微生物数量 增多,出现局部性腐败或肌肉组织局部受到破坏时,表面的微生物便可直接进入 肌肉内部组织,造成肉品的生物性污染。动物肠道中存在着正常菌群,一定数量 的微生物随着食物水等进入消化道,在动物健康状态下不会进入机体循环系统。 因此,除非去除内脏时不小心刺破肠道屠宰后没有很快摘除内脏, 或是在宰杀前 饱食;一般来说体内是不会被肠道中所带细菌污染的。 动物在屠宰分割过程中,空气、屠宰工具、工作台、人员及一些与胴体和分 割肉接触的设备会对胴体产生交叉污染。在刺杀放血和剥皮时,微生物首先从下 刀处进入组织,细菌数量最多在开始剥皮处,而最少的是离下刀的远处,平均菌 数为~/。环境潮湿、工作者的手、臂和衣服上沾有血和碎组织,使 动物躯体又再次被污染。在一天作业完毕后,从剥皮者的衣服上刮下来的标本检 出细菌数为 /。猪在烫洗时,烫洗槽水温维持在?,能减少嗜 冷菌和病原菌的数量,但对嗜温菌、嗜热菌以及芽胞菌作用不大。由于皮毛、蹄 上的土、粪、血和其它异物小块脱落于水中,在头几个躯体经过烫洗后,每毫升 水中就含有数百万个细菌,如果不及时更换烫洗槽中的水,就会对后面的猪胴体 造成严重交叉污染。冷却肉暴露于空气的面积越大,与用具接触机会越多,就越 容易造成交叉污染。因此,在分割间进行冷却肉分割时,要严格控 制环境温度和 操作时间。冷却室中的空气含有许多细菌、霉菌和酵母菌【,冷却室温度保持得 越低越好,通常在?以下,这样可以迅速和彻底地将白条肉的最厚部分冷却, 从而抑制微生物的生长。操作过程中的微生物污染可以通过关键控制点得到控 制。 .污染冷却肉的主要微生物 孔凡真等.”将冷却肉中的微生物分为细菌和真菌,其中细菌主要有大肠杆 菌、沙门氏菌、变形杆菌,也有枯草杆菌、马铃杆菌及球菌。而在肉的深层有厌 氧性腐败菌,如:腐败梭菌和溶组织梭菌。冷却肉中可能存在的病原微生物主要 有沙门氏菌、李氏杆菌、链球菌、布氏杆菌、结核杆菌、魏氏梭菌、钩端螺旋上海海洋大学硕士博士学位论文 体、猪瘟病毒等。其中对人类安全威胁最大的是炭疽杆菌,但沙门氏菌则是常被 发现的病菌。李宗军和江汉湖等【的研究发现,在?条件下,冷却肉中的 微生物主要是革兰氏阴性杆菌,有:胞壁假单胞菌和漆状假单胞 菌:而在。条 件下,冷却肉中的细菌主要是革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性球菌,有:葡萄球 菌、埃希氏菌、肠细菌、肠球菌、假单胞菌和弯曲杆菌。 杜林等【】将冷却肉中的病原微生物分为:产单核细胞李斯特杆菌、嗜水气单 胞菌、肠炎弧菌、耶尔森肠道球菌、蜡状芽胞杆菌、肉毒梭菌和致病型大肠杆 菌,而致病菌有:小肠结肠炎耶尔森氏菌、肉毒梭菌芽胞杆菌、产气荚膜梭状芽 胞杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌属等。刘子宇等【】对冷却肉中的 微生物进行分离,结果显示冷却肉中的微生物主要有革兰氏阴性需氧嗜冷菌假单 胞菌属、革兰氏阳性热杀索丝菌属和乳酸菌属,还有潜在致病菌李斯特氏菌属。 可见,污染冷却肉的微生物主要有病原微生物和腐败微生物两大类。致病菌有: 小肠结肠炎耶尔森氏菌、肉毒梭菌芽胞杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌、沙门氏 菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌属等。而常见的腐败性嗜冷菌有:假单胞菌属、 莫拉氏菌属、不动杆菌属、气单胞菌属、肠肝菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、热 死环丝菌等,其中,假单胞菌属是冷却肉中的优势菌。 当然不同的学者因为研究手段的不同,在研究结果上也会稍显不同,有的 学者将肉类食品中主要的腐败细菌主要分为:革兰氏阴性、需氧嗜冷的 , ,,和兼性厌氧的 , 以及革兰氏阳性的 , ,和 。肉中常发现的致病性 , , 嗜中温细菌包括, , ,, 以及 。在正常的冷藏条件下,这些致病菌的生长 受到抑制,在贮藏和运输过程中若温度控制不当,它们可能迅速增殖而对公共健 康构成潜在的威胁。 肉品中虽然也有霉菌和酵母,但它们的致腐能力较低,可以在肉品中生长 的霉菌主要有,,,,,一 上海海洋大学硕士博士学位论文 ,,。在肉品中可能存在的酵母有 , ,等。 .肉品中腐败微生物的代谢特性 肉品表面起初污染各种微生物,随着贮存时间的延长,其菌相构成发生改变, 其中~种或几种会成为优势菌群,成为引起肉品腐败的主要微生物,而其它菌会 处于较低的数量,甚至消亡。有研究表明,微生物的生长都是以消耗肉品中低分 子成分为基础的。肉品的腐败类型取决于哪一种腐败菌在竞争中占优势,以及它 们产生异味化合物如硫化氢、挥发性胺、酯和乙酰姻等的能力。优 先刊用肉中的葡萄糖,当细菌数目达到个/时,葡萄糖的供应将不能满足其 生长需求,开始利用氨基酸作为生长的基质,生成带有异味的含硫 化合物、酯、酸等。 /是在有氧的条件下造成肉品腐败的主要微生物之 一。这类微生物主要利用氨基酸作为生长基质,但其在降解氨基 酸时,并不产生 有异味的副产物,因而其致腐能力较低。但是,当这类微生物成为腐败菌相的主 要组成部分时,它们会增强与.的致腐能力。这是由 于/竞争了环境中的氧,使氧的供应受到限制。在缺氧状 态下,即使有葡萄糖存在,仍会分解氨基酸而形成有异味的化合 物。缺氧状态下,.将会产生硫化氢,使肉品变色,变味。 在低氧分压条件下,将会有利于兼性厌氧的., ,和的生长。 .的生长以半胱氨酸和丝氨酸为底物,即使葡萄糖供应充足时也 是如此。.在有氧的条件下产生有机的含硫化合物,在无氧的条件下 产生硫化氢,因而具有较强的致腐能力。当环境条件适合于.时,即 使它不是菌相中的优势菌,它仍可能是引起肉品腐败的主要因素。 利用葡萄糖作为生长底物,在有氧的条件下生成 乙酸,产生甜的异味 ,并能分解亮氨酸和缬氨酸产生异戊酸和异 丁酸。无氧条件下 分解代谢的终产物主要是乳酸,另 外也生成少量的挥发性酸。因而,肉品在真空包装时, 上海海洋大学硕士博士学位论文 可能成为主要的腐败菌。 在有氧的条件下利用葡萄糖和一磷酸葡萄作为生长底 物,有的种类可以分解氨基酸产生包括硫化氢在内的挥发性含硫化合物及有异味 的胺类物质。因而当环境条件适宜时,具有很强的致腐能力。 在肉品污染的初期只占微生物中很小的一部分,但真空包装的 肉类,由于处于低氧分压的条件,很快成为优势菌。 生长时利用葡萄糖产生乳酸,当碳水化合物耗尽时,便利用氨基酸,产生挥发性 脂肪酸。使肉品出现“或“”的气味。 各种腐败菌对于肉品的致腐作用取决于其初始菌数及其对环境的适应能力, 生长最快的种类将最终成为优势菌。因而在控制肉品的腐败时,不仅要控制细菌 总数的增长,而且要采取措施来抑制那些致腐能力强的菌群的生长。 .肉品腐败变质所处环境 ..温度 温度是影响肉类食品货架期的最重要的环境因素。低温不仅可以控制腐败微 生物的繁殖,而且可以大大降低因脂肪氧化而导致产品质量下降的化学反应速 度。引起食物中毒的微生物在。以下生长缓慢,在.以下停止生长,嗜冷 微生物在以下生长缓慢,在一基本停止生长。研究表明,当 贮藏,表面 肉的初始菌数为个/时,在贮藏天表面出现粘液,而在 出现粘液的时间缩短为天,在?贮藏,仅需天表面即出现粘液,因而低温贮 存可有效地抑制微生物生长,从而延长肉类食品的货架期。由于各种微生物生物 学特性的差异,温度的改变对于各种微生物生长的影响程度是不同的。下表为几 种嗜冷菌在不同温度条件下的世代时间。 上海海洋大学硕士博士学位论文 表温度对于肉上纯培养的嗜冷腐败菌世代时间的影响 . . . . . . . . .伽 . . . . . . . . . . . . 勘 . . . . . . . . . . 口口,“ ?. . . 摘自 在不同的温度条件下,肉类食品中微生物的菌群构成不同。当温度变化时, 生长最快的种类成为导致肉类腐败的优势菌。在有氧条件下,温度接近?时, 适合于嗜中温菌的生长,因而,和取代 而成为优势菌。在无氧的条件下,当温度 低于?时,嗜冷的乳酸杆菌.成为优势菌,当温度达到? 时,嗜中温的和占主导地位,若在起初有产气荚膜杆菌 .存在,则其将成为优势菌 ..气体成分 氧气是影响肉类食品货架期的另一个很重要因素,除了氧气本身的氧化作用 外,更重要的是它影响需氧微生物的生长。气体成分的不同,决定了肉类食品中 微生物群的构成不同,因而肉类食品腐败的类型也是不相同的。下表为污染的肉 品的主要腐败菌及致病菌对氧气的需求情况。 上海海洋大学硕士博士学位论文 表污染肉品的微生物对氧气的需求情况 需氧菌?生长需要氧气 兼性厌氧菌?有否氧都可生长 / .微氧菌?需低浓度氧 厌氧菌?生长受氧的抑制 :的抗菌作用早已被证实。革兰氏阴性细菌可以被%的:所抑制,而: 对乳酸菌的抑制作用很小。。的抗茵效应,一般认为有下列四种机理:?改变细 胞内的值,从而影响胞内酶的活性与物质运输:?抑制脱羧酶的活性;?。 溶于细胞膜,使其功能遭受破坏;?抑制非脱羧酶的活性。认为的 作用方式最可能是后两种机制。不管是哪种机制,:可以延长腐败菌的迟滞期与 世代时间,从而延迟腐败的发生。 表 %:对贮存于条件下冷却肉中腐败菌世代时间的影响 . % ? 世代时间 % 微生物种类 空气 . . . .. . . . . . . . . . . . . 上海海洋大学硕士博士学位论文 注:摘自 影响:抑菌作用的因素很多,主要包括以下几个方面:?肉品中的微生物 种类,?:的应用时间,?:浓度,?贮存温度。。对不同种类微生物的作用 不同,一般来’既,革兰氏阴性细菌比革兰氏阳性细菌对:更敏感。常见的引起 肉品腐败的细菌如革兰氏阴性的,/可以被 %的抑制,而革兰氏阳性的 则能够在%中生 长 ,对:有很高的抗性,甚至可以在%的:中生 长。:对引起食物中毒的厌氧菌影响不显著,无氧和高浓度:会促进它们的生 长。研究表明,气调包装不会增加,., , 即厂口砌忉矗“致病菌的危害性。 :的应用时间对其抗菌效果也有重要影响。对敏感的微生物,在其 生长 早期使用,可以延长其迟滞期,当其进入对数生长期后,:对其抑制作用降低 。因而气调包装应用时间越早,抑菌效果越好。尽管各种 微生物对于:的敏感程度不同,但一般来说,酵母、霉菌与细菌可以被%~ %的:/抑制,在%的浓度范围内,:的抑菌效果线性增加。浓度高 于%,:抑菌效果的增加相对较小。但有报道认为,%:对鲜肉的保鲜效果 优于%:/%:/%:。 低温可以增强:的抑菌效果。这可能是由于低温下。在水相中易于溶解, 研究 这有利于快速形成碳酸,并解离成与。一。 证明,低温条件下,:气调包装的猪肉腐败大大减慢。 。一般作为填充气体,通常认为其对细菌无抑制作用,但有研究表明,有 利于延长猪肉的货架期,在%:中贮藏,细菌数达到×个/所需时间为在 空气中贮存所需时间的倍。 在真空包装中,需氧的受到抑制,而厌氧和兼性厌氧的. 和成为主导腐败微生物。低温无氧条 件下,口比 和坨具有更快的生长 尽管能利 速度,因而乳酸杆菌成为真空包装肉类的优势菌。 用不被利用的、磷酸葡萄糖,但能产生抗菌物质,抑 上海海洋大学硕士博士学位论文 制其生长。因此真空包装的肉品的腐败主要是由于乳酸菌数量的迅速增长而引起 的。乳酸菌具有嗜冷、微需氧和抵抗亚硝与的特性,因而真空包装的肉制 ,。乳酸菌主 品在低温条件下贮藏时,它们仍能够生长 要通过产气、产生酸腐味、粘液及乳状渗出液导致肉品的腐败 .。由于乳酸菌的优势地位及其它不利因素的影响,限制了其它菌群如 ,和等的生长,使它们不能在 真空包装肉制品的腐败菌群中占优势 .。尽管在真空包装的 肉制品中发现了一些种类的致病菌,如,, , ,但由于乳酸菌的竞 , 争性作用,以及低温贮藏和亚硝的作用,使它们的生长受到抑制。对引起真空包 装肉制品腐败的菌群的特征研究表明,和为优势菌。 .研究表明真空包装的南非维也纳香肠的主要腐败菌群为 和其总量占乳酸菌的%。 .微生物多样性的研究方法和发展趋势 对冷却肉中污染的微生物种类繁多,来源复杂。传统的针对微生物的研究, 大都是采用微生物分类、鉴定方法,对保减过程中微生物进行分离,根据微生物 数量和微生物的形态特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应等作 。 为鉴定依据【 .传统纯培养的方法研究微生物多样性 传统的微生物学方法为微生物的研究奠定了坚实的基础,然而这些方法同时存在 许多缺点,用于细菌分类鉴定不但耗时费力,对部分细菌的分类鉴定仍困难重 重,而且只有不到%的微生物是可以在实验室条件下培养的,绝大部分的微生物 在目前条件下还未能培养】。所以传统方法很难全面反映污染微 生物多样性的全貌,具有一定的局限性和盲目性,一定程度上阻碍了复杂微生物 多样性的研究进程【舶。 .分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用 自年,由】及其同事开始用核酸测序技术来研究微生物区系及分子 系统发育关系以来,预示了一个现代微生物学时代的到来。其基本理论基础就上海海洋大学硕士博士学位论文 是,直接从样品中提取微生物,以基因组的多样性反映物种多样性,从而 可以比较全面客观地展现样品中微生物组成和多样性。以扩增技术为基础 的分子生物学技术的出现,为微生物区系研究提供了从不同视角认识其多样性的 可能引。基于指纹技术的分子生物学研究手段,例如核苷酸基因探针 技术、竞争性、 基因序列分析等逐步被引入到微生物多样性的研 究中,主要包括两大类依赖于培养技术的指纹图谱技术,其中包括菌落核酸 杂交、各种技术、依赖限制性内切酶的指纹图谱技术脉冲场凝胶电泳,核 糖型及 的限制性酶切图谱分析等, 的限制性酶切图谱分 析可以通过随机克隆的方法对细菌进行分类鉴定。不依赖于培养技术的指纹 图谱技术,其中包括 的随机克隆、核酸杂交、 基因序列同源性 分 析、温度梯度凝胶电泳及变性梯度凝胶电泳。在这些技术中变性梯度凝胶电泳技 术,和克隆文库的方法 已经广泛用于土壤、污水、粪便等细菌多样性和种群结构研究 ,并开始应用与食品有关的微生物多样性研究?捌,主要应用于食品中微生 物的分离和鉴定、食品发酵过程中微生物群落的动态监测、标准模型的建立、食 品质量监测与控制。 它在微生物多样性的研究方面越来越受到青睐。 .. 的发展和技术原理以及在食品微生物学研究中的应用 ... 的发展和技术原理,是 变性梯度凝胶电泳技术 由和于年最先提出的用于检测突变的一种电泳技术 。年等】首次在中使用“夹子”,使该技术趋于完 善。年等首次将技术应用于分子微生态学研究领域,并 证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特 的优越性,可以很好的反映微生物的多样性【’。该技术是一种可 检测长度相同 而碱基组成不同的序列在不同变性条件下的电泳方法,这些序列不同的 片段在变性梯度凝胶电泳上由.于解链行为不同,导致的迁移速率不同,在胶片特 定位置上形成不同的泳带而得以分离。它的分辨率比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝 胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。上海海洋大学硕士博士学位论文 ?一?? ?一缈 图 对片段的分离示意图. 技术的工作原理是利用变性剂在聚丙烯酞胺凝胶中形成的浓度梯度, 相同长度的片段在各自相应的变性剂浓度下解链,导致空间构型发生 变化,使电泳速度急剧下降,由于片段碱基组成有差异,造成在其相应的变 性剂梯度位置停滞,从而在凝胶上呈现不同的条带,形成与序列特异性相关的特 征性图谱图】目前通常使用的变性剂为尿素。该技术可以分辨具 有相同或相 近分子量的目的片段序列差异,可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性,以 及扩增片段的多态性。 在电泳技术中,用于分析的多是产物,在电泳变性过程中人们不 希望所有的这些片段完全变性,因此在’端引入序列,即“夹子”,将一 段长度为~富含、的碱基片段附加到双链的一端以形成一个人工高温解 链区。由于分子中的、碱基对要比、碱基对结合得牢固,因此、含量高 的区域具有较高的解链温度。这样,片段的原有部分就处在低温解链区从而可以实现 更好的分离。“夹子”即保证了十分保守的双链片段能解开,又保证双链在电泳过 程中不能完全分离【。常规的电泳技术对于长度超过的片段的序列 变化情况,只能有%的检出率。应用“夹子”技术,可使检出率提高到%。 系统要求在制备好的高浓度变性剂中加入聚丙烯酰胺,使其产生线性 的变性梯度,对待测片段进行电泳,电泳的温度要低于待测解链 区域 值,一般为?。变性剂梯度由胶板的顶端向底端线性增加,电泳方向平行上海海洋大学硕士博士学位论文 。 于变性剂梯度变化方向。 核酸染色最常用的是溴化乙锭染色法和银染法,银染法是通过银离子十 与核酸形成稳定的复合物,再使用还原剂如甲醛使银离子还原成银颗粒,把核酸 电泳带染成黑褐色,其灵敏度比高倍,是目前最灵敏的方法。但银染法不 易回收,无法进行后续的杂交分析。近年来,相继出现了 , 和 等新一代荧光核酸凝胶染料,这类染料的背景极 低,可以更好的观察微量的条带。致突变性远低于数倍甚至数倍,几乎具 有银染的超高灵敏度。由于该染料渗透入凝胶的速度极快,无需脱色,使染色过 程更加简便,节省时间。虽然这种染料的价格比较昂贵,但还是一类具有良好应 用前景的荧光染料。显色后,凝胶上的条带可以在回收后用于测序,也可以直接 ‘ 进行凝胶的杂交分析。 可根掘试验的需要进行选择。技术主要包括以下几个步骤:?食品或 其它环境样品的采集;?样品中微生物总提取;?核糖体可变区 扩增,得到相同大小不同序列的微生物扩增的混合物;?预实验主要是对 扩增出的 片段的解链性质及所需的化学变性剂浓度范围进行分析,选 择最佳的变性梯度:?制备凝胶:?得到样品的特异性指纹图谱,进行 分析:?软件分析。如图所示分析流程图。 一 一 一 一上海海洋大学硕士博士学位论文 图 分析微生物种群结构流程图 . ... 技术在肉品微生物研究中的应用 近年来,在肉品微生物方面的研究中,仍然是应用传统的微生物培养的方法 研究微生物的多样性,但是由于细菌之间的相互作用】以及污染来源的复杂性如 水、土壤、兽皮、粪便和环境等的影响,增加了研究的难度,对猪 肉在屠宰和 储中污染微生物数量上的差异,也只是大体的估计,对于不同工艺中污染的多样 性差别在哪里,储藏过程中变化如何,仍不是很清楚。这项技术以基因组 的多样性反映物种多样性,适用于整个菌群多样性的动态观察;可以同时检测多 个样品,对不同样品进行比较,因而有利于研究不同来源样品中细菌菌群多样性 的动态观察。该项技术被应用到很多领域如发酵香肠【、干酪【州、食品污水 、泡菜【、土壤】以及猪粪便中【】的微生物区系研究,明显优于传统的培养 方法。同时,也有学者把该技术应用到食品中监测微生物在不同阶段的微生物 类型,来反映整个过程中微生物种群的空间变化。但是应用该技术针对对冷却 牛肉中的微生物多样性方面至今也没有相关研究。因此,研究对市售冷却牛肉中 腐败微生物的多样性,为冷却牛肉的保鲜提供理论依据和实践参考。 ..克隆文库分析法在微生物多样性研究中的应用 基因克隆是一个比较直观而简单的操作程序。它之所以具有非常重要的生物 学意义,是因为这一技术可以为我们提供一个纯粹的基因标本。通常,一个基因 总是和细胞里其他基因同在。基因克隆技术诞生之前,我们根本无法纯化单个基 因,这意味着我们只能对基因群、而不是特定基因的结构与功能进行研究和开发 利用。 克隆文库的建立通常分为基因组的提取,宏基因组的扩增,然后 将扩增后的目的片段进行连接,最后进行转化,其中基因组的提取与后续 的 克隆子所携带信息有着密切关系,我们根据需要进行扩增,常见为 区等,而在选择 作为扩增的目的片段主要是出于其特有的一些优势 进行考虑的, 广泛地存在于各种细菌当中,是细菌生命活动所必需的上海海洋大学硕士博士学位论文 功能分子。而且几乎所有已知细菌的碱基序列已被测定并存入基因 库。另外 具有可变性.广泛用于土壤、污水、粪便等细菌多样性 和种群 结构研究,并开始应用于食品中。进行连接的过程其实就是将载体和要克 隆的目的片段连接,成为一个完整的重组分子,这样才能将目的片段 利用特殊的手段如电击法、、等化学试剂法转化入大肠杆菌中进 行表达,最后完成测序工作。建库质量的好坏,可能影响到实验结果的分析,由 于基因文库所携带的信息量非常大,基本能够很好的反应出该样品的生物信息, 但是克隆文库方法自身也存在一些缺点,比如:挑选克隆子具有一定的随机性, 可能漏掉一些需要的基因序列,克隆转化的技术要求比较高,费用消耗较大。 ... 连接技术 利用连接酶把载体和要克隆的目的片段连接在一起,成为 一个完整的重组分子,这就是分子克隆中常说的连接反应。当载体和外源 末端都是由一种产生粘性末端的内切酶切割产生的话同尾酶也可以,或 者两者末端被接上一段互补的多聚体的尾巴,那么经退火后可形 成新的重组分 子。连接后产生的重组分子中仍然保留着外源两端的限制性内切酶切点, 从而使我们能方便地从重组分子再次取出所克隆的片段。 ... 转化技术 转化是将外源分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性 状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技 术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变体’,一,它可以容忍外源分子进入体内并稳 定地遗传给后代。 .本文研究内容及意义 本文旨在分析超市销售储藏过程中超市销售环节中冷却牛肉的微生物多 样性,国外对于冷却牛肉中微生物多样性分析不多,国内对于冷却牛肉的多样 性分析很少,目前只有山东农业大学罗欣等人年报道了冷却牛肉的初始菌 相构成。而对于冷却猪肉中微生物多样性分析则相对较多,方法 相对成熟,但是上海海洋大学硕士博士学位论文 对于冷却肉中微生物多样性的分析,绝大部分的研究者停留在纯培养的方法上进 行的研究。 本研究利用分子生态的方法克隆建库,?变性梯度凝胶电泳与纯培 养相结合的方法分析比较未包装冷却牛肉与保鲜膜包装中微生物多样性,并得出 纯培养与分子生态方法用于样品微生物多样性分析的优越性比较结果,以及初步 分析保鲜膜包装的抑菌作用。通过分析比较冷却牛肉中微生物多样,初步得到一 定的理论数据,为以后冷却牛肉中预测预报模型的开发、群体感应效应的研究以 及牛肉的保藏和销售提供一定的理论基础。上海海洋大学硕士博士学位论文 第二章传统纯培养的方法分析冷却牛肉中微生物多样性 .材料和方法 .样品采集 年月购自上海易初莲花周家嘴路店的某品牌未包装冷却牛肉,无菌 操作下将冷却牛肉分割成两块,一块进行保鲜膜包装,另一块不 包装,同时放入 冰箱进行保藏,天后取样。 .主要试剂和仪器 用于扩增的全套试剂及扩增引物均购于上海生工生物工程技术 服务有限公司;细菌基因组提取盒,购于 仪,相关生理生化试验所用试剂均购自于国药集团。 .菌落总数的测定 采用稀释平板方法进行菌落总数的测定。 .菌体的培养与分离纯化 样品经系列稀释后涂布在培养基上,?倒置恒温培养,后统计数 量。挑取菌落表型差异的单菌落,纯化后的菌种转至斜面,?保 存。 .菌体的生理生化鉴定 参照东秀珠,蔡妙英《常见细菌系统鉴定手册》进行。 .单菌落提取及纯化 选用细菌基因组提取盒直接提取单菌落。 .的扩增 以提取的基因组为模板,选用细菌通用引物正向引物. .’, ’.’:订’ 反向引物: .’。选用耻体系进行聚合酶链式反应。反应条件为:预变性 ,然后变性,?退火,?延申,个循环,循环结束 上海海洋大学硕士博士学位论文 后?延伸 。选择上海生工生物工程技术服务有限公司柱式抽提 试剂 盒进:产物的纯化。送上海生工生物工程有限公司进行测序。 . 分析 、 本试验选用的限制性内切酶有: 。 矛 取的 的产物,分别加入肛内切酶、率相应的 和叩去离子水。。恒温后于恒温分钟终止反应【】。取酶切产物毗 用.%琼脂糖凝胶电泳检测删。 . 测序和进化树分析 获得菌株部分长度 约序列,将该序列通过程序与 核酸数据进行对比分析://.../,获得条相似性较 高的序列,使用和 软件,构建系统进化树。 结果 .菌落总数的测定 通过梯度稀释法得知未包装冷却牛肉中的细菌总数为:. /;保鲜 膜包装冷却牛肉中的细菌总数为:. /。细菌总数上说明保鲜膜对细菌 的生长起了一定的抑制作用。 .细菌菌落特征 根据两样品在营养琼脂上所生长的细菌菌落表型差异的特点,共筛选出 株,其中保鲜膜包装冷却牛肉样品共株,未包装冷却牛肉样品共株,根据测 序结果在同一样品种数量上所占比率较大的为样品中的优势菌株,两样品各株 进行革兰氏染色株细菌编号为:一,其中一为未包装冷却牛肉 样品:位保鲜膜包装冷却牛肉样品,并详细 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 其细菌基本特性表 。上海海洋大学硕士博士学位论文的提取和扩增 将从活菌中提取的总进行%的琼脂糖凝胶电泳,在左右出现条 带如图,表明已获得较为完整的微生物的全部基因组的。对株活化菌 进行全长序列的扩增。均能得到重复性好且稳定、清晰的特异条带,片段 大约左右如图。踮? ‰??上海海洋大学硕士博士学位论文 图菌株的 电泳图谱 图菌株的总电泳 . . . 分析基因序列 的方法可在 限制片断长度多态性类型代表 上区分细菌种的差异【】:每个 ,,用这种方法显示的 了一个操作分类单位 雾;样性能用以估计分离物中存在的最低限度的细菌种的数引。由 图可以看出,株菌的 片段对种内切酶均有多个切点,并经重复实验可获 得稳定的酶切图谱。各菌经酶切后片段大小分布比较均匀,便于比较分析。根据 酶切图谱图、分析可知: 酶的单酶切对、的 与 进行的双酶切以及 片段都能酶切稳定且彻底,两株菌所得 片段酶切片断数目和位置 基本一致。 酶的单酶切对,、,的 片段有个酶切位 点,相比所选择的双酶切更彻底。 根据酶切片段图谱,按’】提出的菌株间同源性计算公式,可在分 子水平 上计算菌株间相似性。公式如下: ×/ 其中表示和两菌株共有的片段数目,为菌株所得的片段数,为菌 株所得的片段数。计算所得结果见表~上海簿洋大学硕士博士学 位论文 表诒口酶切相似率%结果 % 珊 根据同源性计算分析得出: 种酶对种菌的 片段所进行的酶切,、、三株苗都能够 同时保证相对较高的同源性,证明三者存在一定的亲缘关系。上 海海洋大学硕士博士学位论文 图酶切结果 酶切结果 图. ..系统发育分析 将株分离细菌所获得的 序列提交,获得它们在数 据库中的临时登录号.为:.,通过软件与 中已发表的 序列进行同源性比较,选取同源性在%以上的细菌 构建系统发育树图,由系统发育树可知与已报道的假单孢菌属 亲缘关系最近;和希瓦氏菌属 亲缘关系最近,贝与希瓦氏菌属亲缘 关系最近;与窄食单胞菌属亲缘关系最近; 、和分别与嗜冷杆菌属,葡萄球菌属 ,微杆菌属亲缘关系最 近。也可以看出符合所进行酶切的结果,、和为同一种属。 上海海洋大学硕士博士学位论文 图基于 序列同源性的株细菌系统发育树 . .生理生化鉴定 参照:对的结果,根据《常见细菌系统鉴定手册》作相应的生理生 化试验表,每一株菌株进行生理生化鉴定时。做平行样个,可以得 出为 假单胞菌属中的恶臭假单胞菌.。为希瓦氏菌属下的. ,而和为希瓦氏菌属下的腐败希瓦氏菌.,在其 窄食单胞菌属内仅有一个种为嗜麦芽窄食单胞菌 。为嗜冷杆菌。为葡萄球菌属中的松鼠葡萄球菌.。 为微杆菌属中的产左聚糖微杆菌.。 表细菌常见生理生化鉴定 上海海洋大学硕士博士学位论文 :大多数?%菌株为阳性,一:大多数?%菌株为阴性,/一:阳 . 性多于阴性,:未实验 讨论 实验中分离出的株活菌,主要是根据其在形态、颜色等特征特异性差别 显著的基础上,筛选出来的,不排除筛选出同一种属,甚至是同一菌株,比如 、和都为希瓦氏菌属细菌,但是经过生理生化鉴定之后,发现此三株 细菌非同一菌株,本实验中和虽然鉴定为同一种菌株,但是二者表型也 非都相同,在甘露醇和柠檬酸盐实验中表现出部分阴性,而在这两个实 验中都表现为阳性。此外虽然与、为同一菌属下的不同种,但是从 系统发育树看来图,与的 的序列相似性要比为同一种的 和两菌株更高。所以生理生化鉴定为同一菌株的基因型的相似性不一定 比同一种属的其他细菌更高。这也许与细菌存在的环境有关,这决定了其生理生 化表型的相同,但是并没有改变其基因的结构。 希瓦氏菌属通常存在于水和土壤中,活性较强,能产生、不良气味产物和 还原等而导致正常肉变粘,使正常肉由鲜红色变为绿色、褐色或灰色,冷 藏过程较其他低温细菌生长速率快。但是此类细菌常存在于海洋食品中,在冷却 牛肉中分离出该菌种,这也许与超市销售环节中同海产品相混杂或操作员的交叉上海海洋大学硕士博士学位论文 感染有关:当然也不排除食品冷藏链过程中冷藏车被污染的可能性。研究证明, 假单孢菌属一直都是冷藏肉中存在的优势菌】,假单胞菌属在冷却肉的初始菌相 中占%,常存在于土壤和水中,广泛分布在食品中。本实验中分离出的 菌株为恶臭假单胞菌,但是由于没有作其的含量的测定,未知它 是恶臭假单胞菌下的生物变种还是生物变种。另外,许多嗜冷菌株,是导致 新鲜冷冻食品腐败的重要细菌。本实验中所分离的希瓦氏菌属此前也被归于假单 胞菌属,被称为腐败交替假单胞菌,假单胞菌属和希瓦氏菌属 是冷链流通中高水分蛋白食品的特定腐败菌 。嗜冷杆菌的细胞膜内含有大量的不饱和脂肪酸,而且会随温度的降低 而增加,从而保证了膜在低温下的流动性,这样,细胞就能在低温 下不断从外界 环境中吸收营养物质。而兼性嗜冷菌生长的温度范围较宽,最高温度达到?时 还能生活。嗜冷微生物是导致低温保藏食品腐败的根源。松鼠葡萄球菌是凝固酶 阴性葡萄球菌,是人体皮肤粘摸正常菌群之一。同时乳酸杆菌属 ,葡萄球菌属,嗜冷杆菌属; 微杆菌属都有比较明显的分布【钔,而这些微生物的存在主要 是与外界环境的接触导致的,如水、土壤、污物等。不同学者研究结果的差异, 可能是肉品来源和所处的环境不同所致【。本实验中可培养微生物的情况看来, 共有的优势菌为希瓦氏菌属,葡萄球菌属、冷杆菌属、微杆菌属、假单胞菌属等 都有不同的分布。 本实验应用以及 序列对分离的活菌,进行了初步的鉴 定,根据的结果初步得出各菌在微生物进化系统中的从属地位,同时经过 对应的生理生化鉴定,确定了各细菌所属的种,这为以后的研究提供了一定的理 论依据,同时也为冷却肉类储藏设备的开发提供一定的基础数据,由于本实验有 限,未能尽可能的分析出冷却肉中的其他细菌,比如其他研究者用特定培养基培 养出的热索丝菌属和乳酸杆菌属等冷却肉中常见 的细菌,另外由于不同的研究对于肉类中细菌的来源,也有不同的看法,本实验 没有彻底排清这些细菌的来源,同时这也将是一个庞大的工程,这也为接下来的 研究提供了线索。上海海洋大学硕士博士学位论文 第三章克隆文库分析法分析两种不同包装冷却牛肉中微生物多 样性 材料和方法 .样品采集 年月购自上海易初莲花周家嘴路店的某品牌未包装冷却牛肉,无菌 操作下将冷却牛肉分割成两块,一块进行保鲜膜包装,另一块不包装,同时放入 ?冰箱进行保藏,天后取样。 .主要试剂和仪器 用于扩增的全套试剂及扩增引物均购于上海生工生物工程技术服务有限 公司:细菌基因组提取盒和回收盒均购于 . 载体;感受态细胞等连接转化所用全套试剂购自公司:仪。 。 . 的提取 选用细菌基因组提取盒提取样品中细菌的宏基因组。 . 克隆文库分析 .. 的扩增 以提取的基因组为模板,选用细菌通用引物正向引物: .’,反向引物:’. .’进