hoechest 染色Hoechst是一种膜通透性的荧光染料,故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形,淡蓝色,内有较深的蓝色颗粒;而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集。
常用Hoechst33258和Hoechst33342,前者渗透性不如后者好,多用于活细胞染色,而后者活细胞和死细胞均可。Hoechst33342 能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA ,使之发出明亮的蓝色荧光。凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡...
Hoechst是一种膜通透性的荧光染料,故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形,淡蓝色,内有较深的蓝色颗粒;而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色,或核呈分叶,碎片状,边集。
常用Hoechst33258和Hoechst33342,前者渗透性不如后者好,多用于活细胞染色,而后者活细胞和死细胞均可。Hoechst33342 能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA ,使之发出明亮的蓝色荧光。凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异,很易判别。
Hoechst 染色方法:
1. 贴壁细胞
A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满。
B. 刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入固定液,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
C. 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。
D. 加入终浓度为10μg/ml的Hoechst染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动数次。
E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍。
F. 将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上,尽量避免气泡。切勿弄反。
G. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。
2. 悬浮细胞
A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内,加入固定液,缓缓悬起细胞,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
B. 离心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μl液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。
D. 稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
E. 均匀滴加Hoechst染色液,染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。
F. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍。
G. 盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。
H. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。
3. 组织切片
A. 对于任何常见切片,处理至常规可以进行免疫染色时,或完成常规的免疫染色后,即可进行后续的Hoechst染色。
B. PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。可在六孔板中操作。
C. 加入Hoechst染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动。
D. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
E. 将切片置于载玻片上,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。
F. 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。
荧光物质均易发生淬灭,染色后的样品宜避光。在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭,但仍宜尽量避光。注意控制染色时间,染色时间过长容易出现假阳性。
PI单染
将处于对数生长期的细胞,经过不同浓度的药物处理不同时间后,离心(1000 rpm,5 min)收集贴壁和悬浮的所有细胞,PBS洗涤,再次离心(1000 rpm,5 min),每个离心管的细胞重悬于500μL 预冷的PBS中,缓慢注入3mL预冷无水乙醇进行固定,4℃下保存(可保存1~2周),待检。细胞上机检测前低速离心除去乙醇,PBS洗涤2次,每个离心管分别加入500 μL PBS重悬细胞,然后加入10 μL 10mg/mL无DNase的Rnase A,37℃孵育30 min,转入冰浴,加入25 μL 10mg/mL PI,冰上避光染色30 min,300目筛绢过滤,于EPICS XL型流式细胞仪中进行检测及分析数据。
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