血小板源性生长因子BB表达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用【精品推荐-doc】

血小板源性生长因子BB 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用【精品推荐-doc】 血小板源性生长因子BB表达对促进大鼠肌腱愈合和防止肌腱粘连的作用 南京大学医学院附属鼓楼医院 林 樾 梁红伟 李云剑 燕 辛 谭 谦 【摘要】目的 研究血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)基因转染大鼠肌腱细胞后促进肌腱愈合及防 止肌腱粘连的作用。 方法 90只大鼠随机分为A、B、C三组，建立跟腱损伤模型。A组:实验组，肌腱 断端注射PDGF-BB基因转染的肌腱细胞;B组:对照组，肌腱断端注射肌腱细胞;C组:空白对照组。6-0 丝线行改良Kessler法缝合跟腱，管型石膏固定一周。术后第3d、1w、2w、4w、8w取样，分别行大体、 组织学观察、力学以及免疫学 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 ，对比肌腱粘连度、组织中成纤维细胞数量、胶原纤维含量、肌腱最大 抗拉力及最大滑动距离、组织中PDGF-BB的浓度。结果 PDGF-BB基因转染肌腱细胞经过RT-PCR以及 测序证实在体外稳定表达。实验组在肌腱粘连度、胶原纤维数量、成纤维细胞数量、肌腱最大滑动距离以 及组织中PDGF-BB含量等方面均优于对照组(P<0.05或P<0.01),但在肌腱最大抗拉力方面与对照组无统 计学差异(P>0.05)。结论 运用PDGF-BB基因转染肌腱细胞注射有促进肌腱内源性愈合、减轻肌腱粘连的 作用。 【关键词】PDGF-BB基因;肌腱愈合;肌腱粘连;基因转染 【Abstract】Objective To study the effect of platelet-derived growth factor-BB(PDGF-BB)gene expression in the process of promoting rat tendon healing and preventing adhesion of rat tendon. Methods 90 rats were randomly divided into three groups (gorup A、B and C), established tendon injury models. Group A: injected PDGF-BB gene transfected rat tendon cells in the end of injury tendon; Group B: injected tendon cells; Group C: control. Then samples were taken from rats tendons in different times including 3 days,1 week,2 weeks,4 weeks and 8 weeks after operation. Morphology and histology observation、mechanical testing and immunoassay were given. The effect of PDGF-BB gene transfected rat tendon cells in the process of promoting tendon healing and preventing adhesion of tendons were proved by comparing of the degree of tendon adhesion ;The number of tissue fibroblasts and collagen fiber content; tendon maximum tensile strength and the maximum sliding distance after the tendon healing ; levels of PDGF-BB in tendon tissue as well. Results The transfection of PDGF-BB gene into tendon cells were testified by RT-PCR and sequencing, and PDGF-BB could stably expressed in vitro. Compared with control, the PDGF-BB gene transfected rat tendon cells had more advantages in the degree of tendon adhesion; The number of tissue fibroblasts and collagen fibers; the maximum sliding distance and the content of PDGF-BB in tendon tissue(P<0.05 or P<0.01),while there was no obvious statistical significance in the largest tendon tensile strength and so on with the control group.Conclusion The injection of the PDGF-BB gene transfected rat tendon cells had the effect of promoting tendon’s endogenous healing and preventing adhesion of tendons. 【Key words】:PDGF-BB gene; Tendon healing; Tendon adhesion; Gene transfection 肌腱损伤是外伤后较为常见的一种疾病，由于肌腱组织的特殊性，其修复后往往因为严 重的粘连而引起功能障碍。目前对肌腱的研究已 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ，在肌腱的修复过程中存在外源性修复 和内源性修复两种机制。所谓内源性修复是指通过组织液营养下肌腱细胞自身修复损伤所达 到的愈合，这种愈合可以避免肌腱粘连的形成。而外源性愈合是指通过肌腱外周组织的滑膜 及结缔组织在肌腱断端产生肉芽组织，同时肌腱外膜中的成纤维细胞增殖并随毛细血管长入 肌腱断面，最终通过肉芽组织修复损伤，这种愈合速度较快，但粘连较重。在肌腱修复的过 程中，两种机制同时作用，通常情况下外源性愈合占主导地位，因此肌腱的愈合过程不可避 免产生粘连，影响正常功能。由此可见，在肌腱损伤的修复中，如何促进内源性愈合，延缓外源性愈合是预防肌腱粘连的另一条途径。本文通过将血小板源性生长因BB(PDGF-BB)基因转染大鼠肌腱细胞，并获得稳定表达的肌腱细胞，将其注入大鼠肌腱断端，研究其在促进肌腱愈合、防止肌腱粘连方面的作用和机制。 材料和方法 1.动物来源及主要试剂:SD清洁级大鼠90只，重量(124?15)g，由南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心提供。胎牛血清(杭州四季青);F12培养基(美国Gibco公司); ?Lipofectamine2000(美国invitrogen公司);PDGF-BB Elisa试剂盒(武汉中美公司);PDGF-BB(美国R&D公司);I型胶原酶(美国Amersco公司);0.25%胰蛋白酶(美国Invitrogen公司);抗大鼠I、III型胶原抗体(美国Bioworld公司);SABC免疫组化检测试剂盒(武汉博士德公司)。 2.动物模型:术前氯胺酮(30mg/kg) 肌肉注射麻醉, 无菌条件下, 于大鼠右后肢行足跟纵切口,打开跟腱鞘管,挑出跟腱,横行切断,肌腱断端用不同方法处理后，6-0丝线行改良Kessler法缝合跟腱，术后管型石膏固定大鼠患肢一周。 3.实验分组:实验动物随机分为A、B、C三组，A组,实验组，PDGF-BB基因转染的肌腱细胞 88(密度10个/ml)，20μl，断端注射;B组,对照组，未转染肌腱细胞(密度10个/ml)，20μl，断端注射;C组，空白对照组，不行任何处理直接缝合。 4.检测指标:术后3d、1w、2w、4w及8w五个时间点, 分别每组随机处死6只大鼠，行跟腱大体、组织学及免疫学检测;术后4w和8w分别每组再取4只大鼠跟腱行生物力学测定。 4.1大体观察 观察肌腱的愈合及粘连情况。 分别于术后第4周和第8 周取标本观察, 各 【1】组肌腱粘连程度按汤锦波等在肌腱粘连分级 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 进行分级。 4.2组织学观测 取断端两侧1.5mm范围内的肌腱组织，常规石蜡包埋，行肌腱纵切面切片，? HE染色:测定缝合处附近1mm范围内肌腱内成纤维细胞数目;?Masson 染色:测定术后第4、8周断端附近1mm范围内肌腱内胶原纤维面积占测量窗面积的百分比。以上每个标本 2均利用计算机在高倍视野(×400)下5个窗口测量取平均值，测量窗面积13000μm。 4.3生物力学测定 将大鼠处死后，右后肢膝关节离断，去除足部除跟腱外其他软组织，通过夹具将大鼠足部固定于力学测定仪的下端夹具，将跟腱的近端固定于仪器的上端夹具。用20g钢针外固定捆扎大鼠足趾作为预负荷。将力学测定仪调零。肌腱滑动距离:设定拉伸速度为1cm/min、最大拉力为50N后开始测试，测定达到最大拉力时肌腱的滑动距离。肌腱最大抗拉力:测定肌腱被拉断时所需的拉力。以上测定结果均由计算机直接生成。 4.4 免疫学检测:分别于术后第3天、第1、2、4和8周五个时间点采集大鼠跟腱吻合口两侧1.5mm范围内的腱鞘和肌腱组织100mg，提取总蛋白，采用Elisa方法，通过绘制标准曲线，定量检测大鼠跟腱中PDGF-BB的含量。 5(统计学方法 所有数据均应用SPSS13.0统计学软件处理。结果以均值?标准差表示(χ?,)，组间以t检验进行处理，P,0.05为差异有显著意义。 结果 1(转染PDGF-BB基因的大鼠肌腱细胞鉴定 构建的pcDNA3.1/Myc-HisB–PDGF-BB质粒经测序证实。转染大鼠肌腱细胞后由该组大鼠肌腱细胞RNA成功扩增出目的基因片段(573bp) ,而对照组RNA没有扩增出目的基因片段(图1)。证明转染pcDNA3.1/Myc-HisB–PDGF-BB的肌腱细胞有PDGF-BB mRNA的正确表达。 2(大体观察: 术后3天，各组切口均未愈合，肌腱周围伴有较明显肿胀，术后1-2周，各组切口基本愈合，肌腱及腱周组织水肿逐渐减少，并逐渐出现与周围组织粘连;术后4周，各组肌腱粘连明显，滑动性差，腱断端被较牢固的纤维组织连接，其中C组肌腱粘连最严重。术后8周，各组肌腱粘连较4周均减轻，各组肌腱粘连程度分级差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。 图1 RT-PCR检测PDGF-BB mRNA 的表达:1. marker 2.转染组RT-PCR3.转染组β-actin RT-PCR 4.未转染组RT-PCR 5.未转染组β-actin RT-PCR 表1 术后8周各组肌腱粘连程度分级(n=10) 肌腱粘连分级 组别 ?级 ?级 ?级 ?级 ?级 A组 0 1 2 3 1 B组 1 1 2 3 3 C组 0 1 2 2 5 3.组织学观察: 术后3天各组肌腱断端均可见充血水肿及炎细胞浸润;术后1周，充血、水肿较术后3天有所减少，同时胶原纤维增生，炎性细胞向胶原纤维浸润，并见吞噬细胞活跃;腱周组织可见毛细血管增生、成纤维细胞增殖活跃，其中以C组最明显;A组细胞数量相对较少(P<0.05)，而B、C组近断端的腱实质内可见较多成纤维细胞增殖，断端有新生胶原形成，并出现较多的新生毛细血管。术后2-4周，各组肌腱的炎性反应逐渐消退，成纤维细胞增殖活跃并向肌腱断端迁移，可见排列紊乱的胶原成分和毛细血管增生。术后8 周, 各组成纤维细胞数较前明显减少，组间数量趋于一致。肌腱断端胶原纤维的排列方向趋于一致，与肌腱纵轴平行，肌腱与周围组织的粘连较前减轻。愈合过程中B、C组各部位的成纤维细胞及胶原纤维含量均较A组多(P<0.05)，肌腱粘连也较重(图2、3，表2，3)。 图2各组肌腱HE染色粘连度观察×100:A组PDGF-BB转染组，B组未转染细胞组，C组对照组 图3各组肌腱Masson染色胶原纤维含量观察×100:A组PDGF-BB转染组，B组未转染细胞组，C组对照组 表2 各组各时间点成纤维细胞计数(个)(χ?,) 术后3天 术后1周 术后2周 术后4周 术后8周 aababababA组 153.2?18.4 145.0?19.6 130.2?20.0 117.9?16.5 98.5?13.8 bbbbB组 170.4?25.7 165.3?24.1 160.1?15.2 163.7?20.5 149.2?16.0 aaaaaC组 192.1?23.2 187.2?19.3 180.5?24.1 163.1?23.9 158.0?19.3 a注:表中数据为单位面积内成纤维细胞计数，A组为实验组，与对照组相比P<0.01,与肌腱细胞组对比 bP<0.05 表3 各组各时间点胶原纤维含量(%)(χ?,) 术后4周 术后8周 ababA组 43.46?5.69 46.45?5.01 bbB组 55.32?7.85 53.37?8.23 aaC组 61.04?8.46 59.38?7.94 a 注:表中数据为单位面积内胶原纤维染色面积所占百分比，A组为实验组，与对照组相比P<0.01,与 b肌腱细胞组对比P<0.05 4(生物力学测定 A组肌腱愈合后,滑动距离与其他两组相比有显著增加(P<0.01)。同组术后四周与八周相比，由于愈合后的功能重建等作用，粘连较第四周时有所好转(P<0.01)。 同时各组之间在第四周及第八周，肌腱最大抗拉力均无明显差异(P>0.05)，对照组由于粘连较重，肌腱断端虽已愈合，但局部增粗，与腱周组织粘连严重。导致其抗拉力增加(表4)。 表4 各组生物力学测定(χ?,) 滑动距离(mm) 最大抗拉力(N) 4周 8周 4周 8周 abcabcdedeA组 3.25?0.33 3.65?0.21 79.03?11.40 81.18?13.73 bbeeB组 2.29?0.40 2.21?0.37 75.88?15.07 78.40?9.58 aaddC组 2.01?0.23 1.89?0.24 85.03?15.19 86.33?10.92 a、b、cd、注:表中数据为最大滑动距离(毫米)和最大抗拉力(牛顿)A组为实验组，与其他两组相比P<0.01,eP>0.05 5(免疫学检测 PDGF-BB在肌腱组织中浓度检测 Elisa检测结果表明，各组标本中，随时间推移，其PDGF-BB的量均逐渐下降，但仍明显高于B、C两组，至第8周时，A组与B两组之间PDGF-BB含量已无明显差异(P>0.05)。但仍略高于C组(P<0.05)(表5)。 表5各组肌腱组织中PDGF-BB浓度(ng/ml)(χ?,) 第3天 第1周 第2周 第4周 第8周 abA组 12.95?1.36 14.23?1.27 8.32?0.94 9.10?1.06 2.63?0.31 bB组 1.13?0.21 -- 2.07?0.48 3.85?0.39 2.72?0.26 aC组 -- -- 1.63?0.36 -- 2.25?0.44 ab注:表中数据为肌腱组织中PDGF-BB浓度A组为实验组，与其他两组相比P<0.05,P>0.05 讨论 【2】在肌腱的自然修复过程中，内源性机制常常延迟，外源性的修复占主导地位。为了达到短时间内增加肌腱自身强度并尽可能减少周围组织的增生的目的，只有通过增强肌腱的内源性愈合来实现，加快肌腱细胞自身的增殖，促进肌腱I型胶原蛋白的生成。PDGF-BB能够促进细胞的有丝分裂，对包括肌腱细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等多种细胞都有促进其 【3、4】生长的作用，同时还可以加速胶原蛋白的合成，尤其是I型及?型胶原蛋白。而I型胶原蛋白正是在肌腱中表达最为丰富的蛋白。 生长因子直接应用容易被体内蛋白水解酶所破坏,半衰期短，因此体内使用外源性生长因子常因水解而失活, 需不断给药才能发挥较好的效果, 但目前生长因子获得困难，难以广泛应用于临床，且外源性给药无法控制局部药物浓度及持续时间，靶向性较差。PDGF-BB是以一种剂量依赖的方式刺激DNA和细胞外基质的合成，只有一定浓度范围的该生长因子，才 【5】能发挥促肌腱细胞增殖的最大作用，这使的PDGF-BB在体内的使用受到限制。 基因转染是将目的基因通过分子生物学方法转染进正常组织细胞，并在正常组织细胞中获得表达的一种技术。它可以在靶区域长期稳定的表达目的蛋白，从而达到其他手段所不能 【6】达到的效果。Sabine等通过将PDGF转染入皮肤细胞后对创面的修复起到了积极的作用。 【7】Nakamura等将带有PDGF-BB的质粒直接注射至大鼠肌腱断端，发现具有促进局部血管化及胶原组织沉积的作用。证明了这种基因治疗的可行性。我们在前期的实验中已经证明，当PDGF-BB浓度在0-100ng/ml时，其浓度与促增殖作用呈正相关，并通过基因转染技术制备了 【8、9】。可稳定表达PDGF-BB基因的肌腱细胞 当将这种细胞注射到肌腱损伤部位，并在局部获得稳定持久表达的PDGF-BB，就可以达到促进肌腱愈合同时减少肌腱粘连的目的。本实验证明在早期给患处提供长期稳定的较高浓度的PDGF-BB(>10ng/ml)环境，可以促进肌腱细胞增殖，达到早期内源性愈合的目的。而在正常组织受损后中，只产生较低浓度的PDGF-BB，其主要作用是对中性粒细胞、单核巨噬 [10]细胞和成纤维细胞的趋化作用。从而造成肌腱断端处较多的成纤维细胞聚集，一定程度上反而促进了肌腱的外源性愈合，加重了粘连。本实验转染细胞在4周后逐渐失去PDGF-BB表达特性，组织浓度与对照组无明显差异，但此时组织已基本痊愈，术后8周时肌腱强度与对照组无明显差异，但粘连程度明显减轻。 总之,在肌腱断端靶向使用较高浓度的PDGF-BB能达到促进肌腱内源性愈合,防止肌腱粘连的作用。而通过基因转染的 办法 鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载鲁班奖评选办法下载企业年金办法下载企业年金办法下载 解决PDGF-BB给药的稳定性及有效性是一种行之有效的方法及发展方向。但是本实验中仍然存在一些问题，如异体细胞注射时引起局部炎症反应，可能会加重肌腱粘连;同时如何精确控制注射的转染细胞量以得到合适的PDGF-BB表达的量等。我们进一步的研究将采取适当的手段将PDGF-BB的表达更为稳定，同时消除细胞注射引起的负面影响，在增强肌腱愈合的同时，减少肌腱粘连的发生，从而提高肌腱修复效果。 参考文献 [1]. 汤锦波,侍德,石井清一.各种伤情下屈肌腱的愈合及粘连形成:肌腱愈合新理论系统的探讨.手外科杂志,1992,8(1):31,35. 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