胶原蛋白酶2
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胶原蛋白酶2,9检测
MMP Zymography assay kit
货号:M100010
描述:基质金属蛋白酶(MMP)以无活性的酶原形式分泌,活化后降解细胞外基质的胶原蛋白,又称胶原酶。通过影响细胞外基质,胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程,并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理生理过程、临床诊断和治疗中
1的意义日益受到重视 。
本试剂盒提供全套试剂,用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一种广为使
2用的、基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法,其灵敏度可达1 nM,高于ELISA方法 。其基本原理和程序是:制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶进行电泳,电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育,凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮区域,从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液,并提供MMP-2、MMP-9阳性对照物;同时采用无毒、极其灵敏的单步染色方法,在10分钟之内一步完成凝胶酶学显色,大大缩短了经典的长时间染色和脱色时间。可检测少至0.1~0.5 µl血液中的MMP-2、MMP-9酶谱及活性,检测灵敏度~1 nM。
试剂盒可进行50次
标准
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小胶检测,如果小胶加样孔为10~15个,则总计可检测500~750个样品。 用途: 检测MMP-2、MMP-9酶谱及活性。Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM
组成与储存 (50 assays)
1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml , ?20 ºC
2. positive mixture(取人、小鼠、大鼠或兔100ul全血自制)
3. 20 × Substrate G, 50 ml, ?20 ºC
4. 10 × Buffer A(wash buffer), 50 ml, 4 ºC
5. 10 × Buffer B( incubation buffer), 50 ml, 4 ºC 6. SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 ºC
检测步骤
1. 制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS-PAGE凝胶。将
20 × substrate融化,并90 ºC加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20 × substrate并使之稀释20倍,
混匀,然后再加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。
2. 阳性对照及待检测样品的前处理及上样:阳性对照:取人、小鼠、大鼠或兔100ul全血与100ul2 ×
SDS-PAGE non-reducing buffer等体积混合。待测样品则1:1稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (可
自行配制 2 ×:4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。
要点是切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可预试验确定加样量。应该加蛋白Marker。 3. 电泳:低电流恒流电泳,每一个小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。 4. 洗涤凝胶:取出凝胶,去除压缩胶。放入容器内,可先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入5ml 1× Buffer
A,室温漂洗凝胶2 × 15分钟。中间换液。
5. 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B,室温或37ºC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途
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常37ºC孵育1小时即可显示。如MMP活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜,注意防止液体蒸发。 6. 显色:倒掉Buffer B。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(详细步骤见SDS-PAGE凝胶蛋白
质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮
区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72
(MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。 7. 条带扫描:将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明,但凝胶背景并非真正全黑。解决办法:可
用非透射光扫描,或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示并尽量设置黑色。MMP条带则为白
色。这种背景黑条带白的格式是大量已发
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
的英文论文中最常见的格式。
说明
1. 10 mM EDTA完全抑制MPP活性。
2. 凝胶干燥:可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置室温快速干燥凝胶,作为永久记录保留。
参考文献:
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels
containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem. 1980, 102, 196–202 注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途
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注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途