SDS-PAGE电泳检测桑种子纯度的蛋白质提取液筛选

SDS-PAGE电泳检测桑种子纯度的蛋白质提取液筛选 SDS-PAGE电泳检测桑种子纯度的蛋白质 提取液筛选 2007;33(1)蚕业科学CANYEKEXUE95 SDS-PAGE电泳检测桑种子纯度的蛋白质提取液筛选 刘伟强谢特新林健荣 (华南农业大学动物科学学院,广州510642) 摘要为了利用蛋白质凝胶电泳检测桑种子纯度,对采用SDS—PAGE电泳及定量 分析的PO,EX3,ddHO以及 20%和30%2-氯乙醇等4种桑种子蛋白质提取液进行了筛选.结果表明,EX3为适 合SDS-PAGE电泳的桑种子蛋 白质提取液,其最佳提取用量,点样量分别为60,30L. 关键词桑种子;蛋白质凝胶电泳;纯度;蛋白质提取液 中图分类号$888.2文献标识码B文章编号0257—4799(2007)0l一0095—03 ? Researches0nScreeningofExtractingSolutionofMulberry SeedProteinsforPurityTestbySDS-PAGE LIUWei..QiangXIETe.-XinLINJian.-Rong (CollegeofAnimalSciences,SouthChinaAgricultureUniversity,Guangzhou510642,China) AbstractInordertotestthepurityofmulberryseedsbymeansofgelelectrophoresisofproteinandquantita- tiveanalysis,fourtypesofextractingsolutionofmulberryseedsbyPO4,EX3,ddH20andethanolchlorine (20%,30%),respectivelywerescreened.TheresultsshowedthatEX3wasthesuitablesolutionforextracting ofmulberryseedprotein.Itssuitableamountforextractingandsamplingwas60IlLand30UL,respectively. KeywordsMulberryseed;Gelelectrophoresisofprotein;Purity;Extractingsolutionofprote in 田间种植桑树是鉴定桑品种真实性和检测桑种 子纯度最为可靠,准确的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,但其检验周期长,且 易受环境及病虫害等因素的影响.DNA分子标记 检验虽分辨率高,但存在费用高,操作繁琐等缺点. 采用电泳分离的蛋白图谱检测农作物种子纯度已有 报道_1J.利用种子蛋白质电泳图谱鉴定种子纯度 具有不需将种子萌发,送检样品可及时进行分析,电 泳后的染色步骤相对简单等优点,因而利用电泳图 谱鉴定桑种子纯度的方法值得探讨.应用该方法检 测杂交桑种子纯度时,首先需建立杂交桑种子自身 的标准蛋白质图谱作为对照.为了建立准确,清晰 的标准蛋白质图谱,本试验对蛋白质凝胶电泳 (SDS—PAGE)中桑种子蛋白质提取液的种类进行了 筛选,并应用梯度法研究了提取液的用量及点样量. 收稿日期:2oo6一O5一o6 资助项目:华南农业大学校长基金项目(编号4300一K05115). 作者简介:刘伟强(1972一),男,广东,实验师,硕士研究生. E—mail:wqliu28@tom.com 1材料与方法 1.1桑品种及桑种子蛋白质提取的处理方法 供试桑品种为沙2X伦109,粤桑ll号.将供试 桑品种的种子冷藏30min后研磨,将研磨粉碎的单 粒种子置于离心管中,加入蛋白质提取液,室温下提 取1h后,置于旋涡混合器上混匀约1min,然后放入 冷冻离心机中l0000r/min离心l0min.取其上清液 用于电泳. 1.2SDS-PAGE电泳方法 参照文献[4]的方法,SDS-PAGE凝胶配制采用 不连续垂直电泳用的配方,其分离胶和浓缩胶的质 量分数分别为12.5%,5%,电压100V,电泳约3 h,采用考马斯亮蓝染色,扫描获得电泳图谱.主要 试剂丙稀酰胺,甲叉双丙稀酰胺,SDS,AP,TEMED, Tris,考马斯亮蓝G.250等由鼎国(广州)生物有限 公司进口分装,其余的试剂甘油,甲醇,冰乙酸,尿 素,乙二醇等从广州精科化玻有限公司购买. 蚕业科学 1.3蛋白质提取液的筛选 参照文献[5]的方法,将PO,EX,,ddHO以及 20%,30%的2-氯乙醇5种提取液各设5个处理,每 个处理点2个样品.PO提取液:将0.0388g K2HPO4,0.01056gKH2PO4,5.0mL甘油,0.2g DTr,0.076gEDTA溶于200mL双蒸水中.EX提 取液:将32.43g尿素,120IxL乙二醇溶于1000mL 双蒸水中.以上药品除2-氯乙醇为化学纯外,其余 均为分析纯. 1.4蛋白质提取液的定量分析 用经过筛选的提取液处理单粒桑种子,然后各 取40上清液进行种子的蛋白含量测定,设3个 重复.用紫外分光光度法测定,以牛血清蛋白 (BSA)作为标准蛋白,具体方法如下.首先用紫外 分光光度计在595nm波长下测定质量分数为 10%,20%,30%,40%,50%,60%的牛血清溶液,用 于测定沙2×伦109种子蛋白质含量的吸收值分别 为0.033,0.060,0.089,0.136,0.169,0.203,用于测 定粤桑11号种子的牛血清溶液的吸收值分别为 0.010,0.046,0.062,0.083,0.147,0.162.然后,根 据6个吸收值建立沙2×伦109种子的方程Y= 0.0035x一0.0074,R=0.9943;粤桑11号种子的 方程Y=0.003lx一0.0234,R=0.9619.最后在 595nm波长下测定各上清液的吸收值,根据方程可 算出各样品提取液提取的种子蛋白质含量. 1.5提取液用量的筛选 从选择的提取液中分别以60,70,80,90,100, 110,120,130,140IxL的用量来提取单粒种子蛋白, 点样量为25上清液,进行不同用量的梯度电泳. 1.6点样量的筛选 以最佳提取液用量处理单粒种子后,分别选用 18,20,23,25,28,30L的上清液点样量进行电泳. 2结果 2.1蛋白质提取液种类的筛选 用100IxL提取用量处理单粒种子后,取25L 的上清点样,从电泳图谱(图1,2)可见试验种子在 以20%,30%的2.氯乙醇作提取液时得到的蛋白质 条带不明显,以PO,EX,ddHO作提取液则都可 看到蛋白质条带,且条带数基本一致,而EX的染色 相对清晰,条带分离较好. 1,2.20%2-氯乙醇3,4.30%2-氯乙醇5,6.ddH2O 7,8.PO49,10.EX3点样量为0.25IxL(图2同) 1,2.20%ethanolchlorine3,4.30%ethanolchlorine 5,6.ddH2O7,8.PO49,10.EX3 图1不同提取液提取沙2×伦109种子蛋白质的电泳图谱 Fig.1EleetrophoretogramofSha2×Lun109seedproteins ofdifferenceextractingsolution 图2不同提取液提取粤桑ll号种子蛋白质的电泳图谱 Fig.2EleetrophoretogramofYuesang11seedproteinsof differenceextractingsolution 2.2蛋白质提取液的定量分析 表1所示的试验数据反映出经过筛选的 ddHO,PO,EX等3种提取液提取的桑种子的蛋 白质含量都较低,但用EX提取液提取的种子蛋白 质含量相对较高,与上述电泳带的清晰度相符,且种 子纯度的测定可在单粒种子的前提下进行,因而在 SDS.PAGE电泳中选择EX作为桑种子首选蛋白质 提取液. 2.3提取液用量的筛选 如图3所示,60用量的桑种子蛋白质条带 较清晰,但条带的清晰度有随着提取液用量的增加 而变弱的趋势.因此,在SDS.PAGE电泳中选择60 LEX,提取液较适宜单粒桑种子蛋白质提取. 第l期刘伟强等:SDS—PAGE电泳检测桑种子纯度的蛋白质提取液筛选97 6o7O8O901o0l10120l30l4U 提取液用量/L Amountofextractingsolution 提取液为EX,,点样量为25L TheextractingsolutionisEX3andsamplingamountis25p,L 图3不同提取液用量的桑种子蛋白质电泳图谱 Fig.3Electrophoretogramofmulberryseedproteinsof differenceamountofextractingsolution 2.4点样量的筛选 如图4所示,6个点样量都能测出桑种子的蛋 白质图谱,30的点样量的条带分离度相对较好, 且较清晰,故选择点样量为30L. 182O23252830 点样量/"L Amountofsample 提取液为Ex,提取液用量为6oL TheextractingsolutionisEXandextractingsolutionamountis60L 图4不同点样量的桑种子蛋白质电泳图谱 Fig.4Electrophoretogramofmulberryseedproteinsof differencesamplingamount 3讨论 本试验结果可知,用EX提取液提取的桑种子 蛋白质含量较高,电泳条带相对清晰一些,提取液用 量60IxL,点样量30L的效果较好.桑种子的质 量小,其脂肪含量较高(占33.4%),而蛋白含量较 低(只有25%)J,故能从种子中提取的蛋白质含量 也不高.提取桑种子的蛋白量和提取液用量,点样 量均会影响到电泳条带的清晰度,在SDS-PAGE电 泳中也表现出提取蛋白量多,提取液用量少,点样量 多时电泳条带则相对清晰一些.今后的工作期望能 在定量的电泳方法下建立生产上常用的杂交桑种子 标准蛋白质图谱,最终建立经济,简便,快速,实用的 电泳方法用于桑种子纯度的测定. 参考文献(References) [1]吴正三,陈明.作物种子纯度检验的电泳方法[J].种子, 1998,17(3):29—30 [2]侯颖,张琥瑛.应用蛋白凝胶电泳法鉴定玉米种子纯度[J].种 子科技,1999,(5):36—37 [3]SenguptaS,ChattopadhyayNC.Ricevarietalidentificationby SDS-PAGE[J].SeedScienceandTechnology,2000,28:871 — 873 [4]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版社,1999. 123—157 [5]赵婷.两系杂交水稻F种子纯度鉴定研究[D].[硕士学位论 文],广州:华南农业大学,2002 [6]吴娱明,施英,肖更生,等.桑籽营养成分研究[A].中国蚕学 会.全国桑树种质资源及育种和蚕桑综合利用学术研讨会论 文集[C].广州:中国蚕学会,2005.325—328