【word】 光合细菌的固定化及对养殖水体的净化作用

【word】 光合细菌的固定化及对养殖水体的净化作用 光合细菌的固定化及对养殖水体的净化作 用 234水产科技情报2011,38(5) doi:10.3969/j.issn.1001—1994.2011.05.005 光合细菌的固定化及对养殖水体的净化作用 陈颖孙红文张峻齐欣罗莹 (1天津市林业果树研究所,天津300112;2南开大学环境科学与工程学院,天津300071) 摘要:为了解固定化光合细菌对养殖水体的净化作用,分别采用海藻酸钠,PVA/海藻酸钠和NaCS微胶 囊3种不同材料对光合细菌进行包埋,并比较了包埋后的光合细菌对养殖水体的净化效果.结果表明:以 3种不同材料包埋的光合细菌,对养殖水体中氨氮,亚硝酸盐和COD的去除效果比对照组显着.以海藻酸 钠一cacl法包埋的光合细菌小球,对养殖水体中氨氮,亚硝酸盐和COD的去除效果较好,但抗冲击力和 机械性能较差;而以PVA/海藻酸钠一饱和硼酸法制备的光合细菌小球,传质性稍差;NaCS—PDMDAAC微 胶囊,因其膜较薄,故抗冲击力较差,但其中空的纯液态环境为细胞的生长提供了更大的空间,尤其是在水 处理10d后,被包埋的细胞对氨氮,亚硝酸盐和COD的去除效果明显. 关键词:光合细菌;固定化;海藻酸钠;PVA;NaCS—PDMDAAC微胶囊 光合细菌(photosyntheticbacteria,简称PSB) 为革兰氏阴性细菌,无芽孢.它们是利用光源和 二氧化碳维持自养生活的有色细菌.当有机物缺 乏时,能以硫化氢为供氢体,在有氧或无氧的水域 中均可生存,对环境的适应能力较强….它消耗 水中的小分子有机物,铵,硝酸盐,亚硝酸盐,在 鱼,虾等水产动物的养殖中能起到净化水质的作 用.此外,光合细菌的菌体无毒,营养丰富,蛋白 质含量高达65%,氨基酸组成齐全,并且含有丰 富的B族维生素及较高浓度的类胡萝素,辅酶Q, 叶酸,生物素和抗病毒物质,具有很高的饲料价 值,因而在水产养殖上有着广阔的应用前景. 但是,光合细菌在应用时受外界环境的影响 较大,抗不良环境冲击的能力差,因而水处理效果 不稳定j.为了解决这个问题,人们将目光投向 了固定化微生物技术. 固定化微生物技术是用化学或物理的方法将 游离细胞或酶定位于限定的空间中,并使其保持 活性,达到反复利用的效果J.固定化细胞技术 被应用到水产养殖中,多采用吸附和包埋的方法. 固定化细胞不仅能在鱼池中长期保留,稳定地发 挥净化水质的作用,而且细胞经固定化后比重增 加,对池水下层和底质中有机物的处理能力得到 增强. 固定化技术自20世纪80年代被应用到水产 养殖中后,研究人员不断寻找经济,稳定,传质性 好的固定化载体,在包埋载体上多采用以海藻酸 钠,PVA为代表的有机高分子材料.近年来,由 月上旬,以便6月底就能达到80尾/kg的上市规 格,然后在7月上旬放养南美白对虾.这样可在 1年内养殖两茬对虾,能显着提高海水围塘的综 合效益. 参考文献 [1]王吉桥,李德尚,董双林,等.鲈一中国对虾一罗非鱼混养的实 验研究[J].中国水产科学,2001,7(4):37—41. 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[6]朱世成,胡国宏,颜立成,等.池塘养殖对虾综合防病措施的研 究[J].水产科学,2002,21(6):18一l9. 水产科技情报2011,38(5)235 硫酸纤维素钠(NaCS)和聚二丙烯基二甲基氯化 铵(PDADMAC)两种水溶性聚合物电解质构成的 一 种全新的微胶囊受到了广泛重视,这种微胶囊 是由一层厚约20—100Ixm,物化性质稳定,具有 良好分子量截留性能的多孔性膜围成的中空微 囊J.该膜物理化学性质稳定,具有良好的生物 相容性,对微生物和动植物细胞没有毒性. 生物微胶囊技术已在细胞和酶的固定化,微 生物和动植物细胞的大规模培养,药物的控制释 放,抗癌药物的筛选,蛋白质等物质的分离等领域 中得到了广泛的应用L6J,但尚未见到在养殖水处 理中应用的报道.本课题拟将NaCS—PDADMAC 微胶囊技术引入到水产养殖的水处理中,研究用 NaCS—PDADMAC微胶囊包埋的光合细菌对养殖 水体的净化作用,并与海藻酸钠,PVA/海藻酸钠 包埋法作比较,旨在为新型包埋载体材料的开发 提供一些研究资料. 1试验材料 1.1菌种 光合细菌由天津市农业生物技术研究中心提 供. 1.2试验用菌液 光合细菌菌液以5000r/min离心,弃上清 液,洗涤数次,然后加无离子水制成浓度为1O个 /mL的菌液. 1.3试验用水 试验用水取白天津市林果所院内养殖鱼塘. 滤去枯枝落叶等大型悬浮物后煮沸5min,杀死水 中部分微生物和浮游生物后,分析水体中氨氮,亚 硝酸盐及COD的含量. 1.4PVA/海藻酸钠混合胶液 以lO%的PVA与3%的海藻酸钠按6:4的 比例混合均匀,备用. 1.5纤维素硫酸钠(NaCS) 将硫酸与丙醇按比例(1.95:1)配置成反应 液,反应液与纤维素按30:1的配比进行反应,反 应温度为一6?,反应时间150min.反应结束后 立即除去反应液,并用9O%的丙醇溶液洗涤物料 至pH>1.5.将清洗后的固体物料溶于去离子水 中,并用2O%的NaOH溶液中和,调节pH值到 9.3.抽滤,去除未反应的纤维素,滤液用无水乙 醇沉淀,离心并干燥沉淀后即得产物NaCS. 1.6试剂 海藻酸钠(食品级,山东晶岩生物公司),PD— MDAAC(分子量为200000—350000,Aldrich公 司),聚乙烯醇(PVA),硫酸(分析纯,天大科威公 司),丙醇(分析纯,天津华仪盛达公司),纤维素 (上海试剂二厂),乙醇(分析纯,天大科威公司), CaC1(分析纯,天津化学试剂一厂),硼酸(分析 纯,天津天河化学试剂厂). 1.7试验设备 78—1型磁力搅拌器,HZ一9212C型恒温振 荡器,无菌操作台,GL21M型高速冷冻离心机,光 照培养箱,光学显微镜,XMTB型恒温水浴锅,TU 一 1901型双光束紫外可见分光光度计,DHG一 9070A电热恒温鼓风干燥箱,YXQ—LS一50S11 型立式压力蒸汽灭菌器. 2试验方法 2.1包埋法 2.1.1海藻酸钠一CaCl:包埋法 将1mL光合细菌菌悬液与1mL4%的海藻 酸钠胶液充分混匀后,用注射器匀速滴入2%的 CaC1溶液中,磁力搅拌,收集小球,固定化24h, 得到直径为3,5mm的固定化颗粒,用水洗净后 备用. 2.1.2PVA/海藻酸钠一饱和硼酸包埋法 将1mL光合细菌菌悬液与1mLPVA和海 藻酸钠的混合液混匀,用注射器匀速滴入含2% CaC1:的饱和硼酸溶液中成球,磁力搅拌,收集小 球,固定化24h,得到直径为3,5mm的固定化 颗粒,充分水洗后备用. 2.1.3NaCS—PDMDAAC微胶囊包埋法 将1mL光合细菌菌悬液加入到1mL4%的 NaCS溶液中,混匀,在磁力搅拌器的低速搅拌下, 用注射器滴加到2%的PDMDAAC溶液中,磁力 搅拌,固定化10h,收集微胶囊,得到直径为3—5 mm的固定化微胶囊小球,用无菌水充分洗涤,洗 去表面残留的PDMDAAC后备用. 分别用水代替光合细菌菌悬液,按上述3种 包埋方法操作得到固定化小球作空白对照,以消 除包埋材料对水质的影响. 236水产科技情报2011,38(5) 2.2对养殖水体的净化 分别将1mL光合细菌菌悬液以及采用上述 3种方法包埋的光合细菌小球加入到1000mL试 验用水中(试验用水的pH值为6.5,7.0,氨氮的 初始浓度为0.5mg/L,亚硝酸盐的初始浓度为 0.06mg/L,COD的初始浓度为8.46mg/L),使水 中光合细菌的终浓度为10一10个/mL.于室温 (15,20cc),正常日光照射下敞口静置反应.分 别于1,2,5,10,15d后取样测定氨氮,亚硝酸盐, COD的含量. 2.3检测方法 (1)氨氮的测定方法:纳氏试剂比色法; (2)亚硝酸盐氮测定:盐酸萘乙二胺法;(3)化 学需氧量(COD)的测定:酸性高锰酸钾法”J. 2.4机械强度的测定 采用手指按压法直观比较其强度大小. 3结果与分析 3.13种包埋材料强度的比较 从外观上看,在分别用3种不同材料方法包 埋的小球中,以NaCS—PDMDAAC微胶囊包埋的 小球透明度最高,其次为以海藻酸钠一cacl法 包埋的小球,以PVA/海藻酸钠一饱和硼酸包埋 的小球透明度最差(图1). 海藻鼹铺(“1 墨 芎 海 藻 锄 也 秘I 删 陵 图1用不同材料包埋的光合细菌 从机械强度上看,用NaCS—PDMDAAC微胶 囊包埋的小球,耐受压力的程度最差.以海藻酸 钠一cacl与PVA/海藻酸钠一饱和硼酸包埋的 小球,开始时差异不大,但在水处理10d后,用 PVA/海藻酸钠一饱和硼酸法包埋的小球,其耐压 程度明显好于以海藻酸钠一CaCl:法包埋的小 球,在水处理15d后效果更为明显;而用NaCS— PDMDAAC微胶囊包埋的小球,有个别的粘连现 象(图2). 图2水处理15d后的NaCS—PDMDAAC微胶囊 在水处理10d后,以3种材质包埋的小球, 其菌液的溶胀效果均不明显,菌液无明显外泄. 15d后,用3种材质包埋的小球,其菌液均有一定 程度的溶胀,其中以NaCS—PDMDAAC微胶囊包 埋的小球表现得最为明显. 3.2固定化光合细菌对养殖水体中氨氮的去除 作用 光合细菌通过独特的光合作用直接消耗了水 中的氨氮,因此,用不同包埋材料固定化的光合细 菌小球均对养殖水体中的氨氮有一定的去除作 用,并且都高于光合细菌菌悬液的去除效果.水 处理2d后,固定化光合细菌小球去除氨氮的效 果明显增强.15d后,以海藻酸钠一CaCl:包埋 的固定化光合细菌小球的氨氮去除率最高,达到 74.6%;以PVA/海藻酸钠一饱和硼酸包埋的光 合细菌小球的氨氮去除率达到69.2%;NaCS— PDMDAAC微胶囊的氨氮去除率介于两者之间, 为70.2%;而光合细菌菌悬液在水处理15d后 的氨氮去除率只有47.8%.对照组水样的氨氮 浓度基本无变化. 0 , 避 穗 一ck mPSB黼懋液 望淹洲 一… 惑躲 一PSB微胶蜒 图3用不同材料包埋的光合细菌养殖对水体中 氨氮的去除效果 水产科技情报2011,38(5)237 3.3固定化光合细菌对养殖水体中亚硝酸盐的 去除作用 光合细菌主要通过反硝化过程去除水中的亚 硝酸盐.试验开始时亚硝酸盐的浓度略有升高, 5d后开始下降.10d后,以海藻酸钠一cacl包 埋的光合细菌小球对亚硝酸盐的去除率为50%, 以PVA/海藻酸钠一饱和硼酸法包埋的小球,去 除率为55%,而以微胶囊包埋的小球,亚硝酸盐 的去除率为45%.15d后,3种方法的亚硝酸盐 去除率分别为63.3%,68.3%和66.7%.直接 以菌悬液处理的水样,15d后亚硝酸盐的去除率 为51.6%,而对照组水样亚硝酸盐的浓度基本无 变化. 鲁 ? 艇 程 器 Ol25l0l5 州闷,d PSB漪懋液 一海藻酸钠定化 PsB 黼璧 十pSB微胶睫 图4用不同材料包埋的光合细菌对养殖水体中 亚硝酸盐的去除效果 3.4固定化光合细菌对养殖水体中COD的去除 作用 养殖水中的残饵及鱼,虾,贝等生物的排泄物 能完全分解并被光合细菌吸收利用,从而大大降 低水中有机物质的含量.以海藻酸钠,CaCl包 埋的光合细菌小球在进行水处理2,5,10,15d 后,COD的去除率分别达到29.0%,38.1%, 60.0%和70.0%;以PVA/海藻酸钠,饱和硼酸 包埋的光合细菌,COD的去除率分别为23.0%, 35.0%,54.0%和64.0%;以微胶囊包埋的小 球,处理2d后对COD的去除率达到25.0%,5d 后为38.0%,l0d后达到61.0%,15d后为 72.0%.用光合细菌菌悬液处理10d后,COD 的去除率为32.2%,15d后达到40.0%.对照 组的COD值则略有升高. — ?一ck %PSB蹦懋液 海澡酸钠删 定化PSB 一 ;潲蔼薄璧 图5用不同材料包埋的光合细菌对养殖水体中 COD的去除效果 4讨论 由图1和图2可以看出,在水处理过程中,3 种不同包埋材料的机械强度和稳定性表现出一定 的差别.其中,用海藻酸钠一CaCl:法包埋的光 合细菌小球传质性最好;用PVA/海藻酸钠一饱 和硼酸法包埋的光合细菌小球,机械强度和稳定 性表现得最为突出;而用NaCS—PDMDAAC微胶 囊法包埋的小球最易溶胀,并伴有粘连现象. 废水中的氨氮转化为硝酸盐的过程为硝化过 程,此过程需在好氧条件下进行,并以氧作为电子 受体.它包括两个基本的反应步骤:第一,由亚硝 酸菌将氨氮转化为亚硝酸盐(NO:一)的反应: 2NH4+302—N02一+2H+2H20.第二,由硝 化细菌将亚硝酸盐转化为硝酸盐(NO,一)的反 应:2NO2一+302__+2NO3一. 将硝酸盐或亚硝酸盐转化为N的过程为反 硝化过程.细菌的反硝化包括4个还原步骤,分 别由硝酸还原酶,亚硝酸还原酶,一氧化碳还原酶 和一氧化二氮还原酶催化完成.反硝化细菌利用 各种有机基质作为电子供体,以硝酸盐作为电子 受体进行缺氧呼吸.反应过程用下式表示(以甲 醇为有机碳源):(1)以硝酸盐为电子受体时,反 硝化菌6NO3一十302NO2一+2H20+4H;(2) 以亚硝酸盐为电子受体时,反硝化菌2NO一+ CH20H3N2+H20+CO2+20H一.. 由图3可以看出,在光合细菌的作用下,水中 的氨氮浓度逐步降低,尤其是在水处理5d后,氨 氮浓度明显下降.对比各个处理,3种固定化光 O98765432,O :,符g一0u 238水产科技情报2011,38(5) 合细菌对氨氮的去除效果均比对照组和菌悬液组 明显. 图4中,水中的亚硝酸盐浓度先略有升高,可 能是由于水中的硝酸盐首先转化为亚硝酸盐,从 而使亚硝酸盐在短时间积累.此种现象在水处理 的第5d开始缓解,亚硝酸盐浓度通过光合细菌 的反硝化作用逐渐降低. 在COD浓度的降解试验中(图5),3种包埋 后的光合细菌处理降解COD的效果比菌悬液组 和对照组要好,其中以NaCS微胶囊的处理效果 最好. 5结论 笔者在固定化试验中选择近年来最为常用的 海藻酸钠一CaCl和PVA/海藻酸钠一饱和硼酸 包埋法,并引入了NaCS—PDMDAAC微胶囊法, 并对三者的固定化效果进行了比较.用海藻酸钠 一 cacl:法包埋的小球具有良好的传质性,对养 殖水体中氨氮,亚硝酸盐和COD的去除效果较 好,但抗冲击力和机械性能不如用PVA/海藻酸 钠一饱和硼酸法制备的小球,后者由于使用了高 分子聚合物PVA,使膜变厚,因此传质性受到一 定的影响.而采用NaCS—PDMDAAC微胶囊技 术包埋光合细菌,膜较薄,抗冲击力较差,但其中 空的纯液态环境为细胞的生长提供了更大的空 间,尤其是水处理10d后,被包埋的光合细菌对 氨氮,亚硝酸盐和COD的去除效果明显. 采用上述3种固定化光合细菌,对氨氮,亚硝 酸盐和COD的去除效果均比以光合细菌菌悬液 直接处理的水样好,说明与游离细胞相比,固定化 细胞在水处理中有着明显的优势. 试验还发现,固定化细胞在水处理能力上有 一 个渐进的过程.这可能与细胞在凝胶或微胶囊 中的生长过程有一定的关系.对于包埋下的细胞 来说,其生长空间和生长所需营养成分的供给分 别受到固定化小球大小和膜通透性的限制.在水 处理的24h内,可能由于光合细菌生长缓慢,利 用水环境中的小分子有机物,铵,硝酸盐,亚硝酸 盐较少,因而表现出养殖水体中氨氮,亚硝酸盐和 COD去除效果不明显.随着细胞的生长进入指 数生长期,光合细菌对水质的净化作用便开始显 现. 由于NaCS—PDMDAAC微胶囊是空心小球, 因而在机械强度和溶胀程度上比海藻酸钠一 CaC1小球和PVA/海藻酸钠一硼酸小球都要差. 但因其中空的成膜特性,更有利于细胞利用营养 物质进行生长和繁殖,而且越到后期,对氨氮,亚 硝酸盐和COD的去除效果越明显. 由于时间和条件有限,本试验仅通过对养殖 水体中氨氮,亚硝酸盐和COD的检测来初步判断 固定化细胞对水产养殖水体的净化效果,而其作 用原理还需通过对硝酸盐浓度的检测进一步试验 验证. 有关NaCS—PDMDAAC微胶囊应用于水产 养殖水处理的研究尚未见报道,但从本试验的结 果可以初步看出,以NaCS—PDMDAAC微胶囊固 定化的微生物对水产养殖水体的净化有一定的效 果,并具有一定的优势.因此,有关NaCS—PDM— DAAC微胶囊在大塘中的应用及其对水生动物的 影响,还需开展系统试验进行深入研究. 参考文献 [1]魏玉利.光合细菌的培养及应用[J].生命科学仪器,2007,5 (3):27—30. 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