【word】 孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定的研究进展
孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定
的研究进展
广西科学GuangxiSciences2007,14(2):132~136
孕妇外周血中胎儿有核红细胞获取及鉴定的研究进展
ResearchAdvanceofObtainingandIdentifyingFetal
NucleatedRedBloodCellsinMaternalPeripheral
Blood
袁海,龙桂芳
YUANHai,LONGGui—fang
(广西医科大学第一附属医院儿科,广西南宁530021)
(DepartmentofPediarics,theFirstHospitalAffiliatedtoGuangxiMdicalUni
versity,Nanning,
Guangxi,530021,China)
摘要:从孕妇外周血中获取胎儿有核红细胞是安全,方便,易于被孕妇
接受的无创性产前诊断.提取孕妇外周血
中胎儿有核红细胞最理想的方法是首先富集孕妇外周血,用胚胎或
者胎儿血红蛋白抗体进行标记,识别,应用显
微操作技术得到单个有核红细胞,继而扩增单个有核红细胞的基因
组DNA,并进一步应用STR连锁
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
验证
为胎源性,进行遗传病诊断.
关键词:有核红细胞外周血胎儿孕妇产前诊断
中图法分类号:R714.55文献标识码:A文章编
号:1005-9164(2007)02—0132—05
Abstract:ObtainingfetalnucleatedredbloodceU(NRBC)fromperipheralbloodofpregnantwomen
isasafeandconvenientapproachofnon—invasiveprenataldiagnosis,whichi
seasilyaccepted.The
idealestmethodofobtainingitisdescribedasfollow:NRBCswereseparatedfrommaternal
peripheralblood,labledandidentifiedwithantibodiesagainstembryoorfetalcells.SingleNRBC
wasthencollectedbymicromanipulatorundermicroscopicobservationfollowedbythewhole
genomeamplificationofsinglecel1.Afterthis,STRlinkageanalysiswasusedtoverifythefetal
originforfurtherdiagnosisofhereditarydisease.
Keywords:nucleatedredbloodcell,peripheralblood,fetus,pregantwoman,prenataldiagn0sis
传统的产前诊断手段虽然诊断准确率较高,但是
对母儿具有危险性,使之长期以来只应用于具有遗传
病高发风险的孕早期和孕中期妇女,且不易为孕妇所
接受.多年以来,人们致力于寻求一种无创伤性的产
前诊断方法.孕妇外周血中存在胎儿细胞这一发现为
此项研究提供方向.孕妇外周血中已发现的胎儿细胞
有合体滋养细胞,胎儿淋巴细胞,胎儿粒细胞,胎儿有
核红细胞(nucleatedredbloodcell,NRBC)等uJ,其中
胎儿NRBC具有众多分离及诊断优势,是目前最受
关注的用于产前诊断的目的细胞[2叫].由于孕妇外周
收稿日期;2007—01—31
修回日期;2007—03—21
作者简介;袁海(1979一),男,硕士研究生,主要从事儿童血液病研
究工作.
*广西科学基金资助项目(桂科攻0015042).
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血中胎儿细胞数量稀少,如何得到足够数量的纯胎儿
细胞用于临床产前诊断一直是困扰医学界的难题.随
着科学技术的发展,胎儿细胞特异抗体表达的研究以
及胎儿细胞筛选,纯化,全基因组扩增技术的发展成
熟,使无创性产前诊断取得巨大进步,显示出广阔的
临床应用前景.
1~Jf1)LNRBC的数量及富集最佳时期
由于所采用的技术方法不同,富集NRBC的数
量及最佳时期也有差别.Bianchi等应用定量PCR
对孕妇外周血中胎儿NRBC进行定量,结果在9O例
孕46,XY胎儿的孕妇外周血中NRBC的平均数量
为19(o-91)/16ml,109例孕46,XX胎儿的外周血
中平均数量约为2(o-24)/16ml.国内马旭等[6对41
例孕6,14周的妇女连续每周采血1次,应用PCR
GuangxiSciences,Vo1.14No.2,May2007
技术检测血中Y染色体特异锌指蛋白基因(ZFY),
结果怀男胎的19例孕6周,ll周,14周孕妇ZFY的
检出率分别为51.3%,68.14,95.10,妊娠女胎
的孕妇无一例ZFY阳性,提示胎儿细胞进入孕妇外
周血循环的量随妊娠的进展逐渐增多,他们认为分离
胎儿细胞的最佳采血时间是孕14周.而Rodriguez
等[7应用双重密度梯度离心和MACS分离胎儿细
胞,FISH证实胎源性,表明胎儿NRBC从孕早期到
孕中期逐渐增高,认为孕15周是挑选胎儿NRBC进
行非损伤性产前诊断的最佳时期.
2胎儿NRBC富集与分离纯化方法
由于孕妇外周血中胎儿NRBC的数量很少,要
得到胎儿NRBC必需使用高效敏感的方法对其进行
富集与分离纯化.目前进行富集分选的方法主要有荧
光激活细胞分选法(fluorescenceactivatedcell
sorting,FACS),磁激活细胞分选法(magnetic
activatedcellsorting,MACS),电荷流式分离法
(chargeflowseparation,CFS),密度梯度离心分离法
(densitygradientcentrifugation)和RosetteSep分离
法.
荧光激活的细胞分选法又称流式细胞计数法,是
Bianchi于1990建立的,其原理是通过流式细胞仪测
定流式差的细胞悬液中萍个细胞所发出的散射光和
荧光等多种参数,然后通过细胞分选器将特定的细胞
从整个细胞体中分离出来[8].流式细胞分选法是目前
应用最广泛的细胞自动分析分选技术之一.其优点是
分离纯度高,缺点是价格昂贵,操作技术复杂,较费
时,不适于在临床推广.
MACS是1990年Miltenyi[9建立的,其原理是
用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞,在外加磁场
的作用下,磁激活细胞分选器可将样品中带磁与不带
磁的细胞分开,以达到分离纯化的目的.目前使用较
多的单克隆抗体为GlycophorinA,CD36,CD45和
CD71,Prieto等[1多次使用2B7.4单克隆抗体标
记NRBC,均能更好地收集NRBC.Yang等D33对孕妇
外周血用CD45,CD71标记的阴性和阳性免疫磁珠
分选,Kleihaur—Betke染色和FISH鉴定的结果显示,
该方法判定男胎的敏感度为100%,特异度为
91.7%,判断女胎的敏感度为91.7,特异度为
100.MACS设备简单,操作亦不复杂,分离速度
快,适用于作遗传分析.但MACS分选的依据只是细
胞表面抗原的不同,需要特殊标记的抗体,且细胞丢
失严重,必须结合其他的筛选方法才能得到一定纯度
的胎儿细胞.
广西科学2007年5月第14卷第2期
CFS的原理是利用细胞表面的电荷不同,在电
场力的作用下有不同的迁移速度而达到分离细胞的
目的.Wachtel等[1胡应用此法对16例孕妇外周血样
进行初步分离,发现每20ml血样中平均有2000个
NRBC,均经与染色体的荧光原位杂交证实.此法的
优点是分离迅速,分离过程不需要抗体,被分离的细
胞具有活性,但是分离出的有核红细胞纯度不高,欲
得到纯的胎儿细胞,还需与其他方法合用.
密度梯度离心法可获得不同密度的NRBC.密度
梯度离心法根据形成梯度的多少可分为双重密度梯
度离心法,三重密度梯度离心法和不连续密度梯度离
心法.双重密度梯度离心法和三重密度梯度离心法均
不易形成肉眼可见的有核红细胞层,分离效果较差.
而不连续密度梯度离心法对新鲜孕妇外周血进行离
心,有核红细胞层位于1.075g/ml和1.085g/ml之
间.这种方法操作简单,细胞比例高,价格低廉,适合
推广到临床.但大多数细胞经密度梯度离心后仍为母
源性,因此需要与其他方法如MACS,FACS或者显
微操作等合用,才能较好地分离出胎儿NRBC.
RosetteSep分离法的分离液是含有多种单克隆
抗体的单抗混合物,使非靶细胞与全血中的多个红细
胞交联,形成免疫玫瑰花结.这增加了非靶细胞的密
度,当进行密度梯度离心时,非靶细胞会随着红细胞
聚集沉淀,未被抗体标记的靶细胞即可被收集.此分
离不需要如MACS,FACS等任何其他特殊仪器设
备,收集的靶细胞可直接用于以后的研究.最近
Bischoff等[1]运用RosetteSep结合单密度梯度离心
法方法分别对81例孕妇外周血胎儿细胞进行分离并
用FISH及real—timePCR进行检测,结果令人满意.
3NRBC来源的遗传学鉴定
由于从孕妇外周血中富集到的NRBC有一部分
来源于母亲,因此需要对NRBC进行来源的遗传学
鉴定.目前所用细胞表面主要标识有CD71,CD36及
GPA(glycophorinA,血型糖蛋白A)受体.然而并非
所有的胎儿NRBC都表达CD71,同时孕妇外周血中
也有少量细胞表达CD71.单独应用CD71MCAB分
选胎儿NRBC纯度较低,GPA特异性较强[1,但可
引起靶细胞凝集而影响分离效果[1.细胞内标志有j:
珠蛋白,e珠蛋白,7珠蛋白[18,19].胎儿最早出现的血
红蛋白是HbGowerI(j:2e2)和HbGower?(a2e2),随
后出现HbPortland(j:.7.).在孕程12周后主要为
HbF(a272),而成人则以HbA(a2B2)为主.Albita[2叩发
现在正常人外周血中j:珠蛋白也可有所表达,而7珠
蛋白在成人外周血中同样有少量的表达,但是数量极
133
微,目前研究较多的是用珠蛋白抗体,分离胎儿
NRBC.但是对于a地中海贫血病人,外周血中可有
较多的珠蛋白_2?,而口地中海贫血患者外周血中
珠蛋白表达增多_2引,且妊娠也会使母体珠蛋白表
达增多_2引.相对于,珠蛋白,e蛋白在成人红细胞
中完全不表达.Choolani_2研究表明e阳性胎儿
NRBC容易与母体e阴性NRBC区分开,且在孕l2
周仍有1/2的e阳性细胞可被检测到.Mavrou等_25]
的实验结果也提示,e珠蛋白是很好的胎儿NRBC鉴
定标识物,是孕程早期阶段诊断识别胎儿细胞的有利
工具,可用于胎儿NRBC的鉴定.
此外,还可以对Y染色体特异序列进行PCR扩
增或用Y染色体特异序列的探针进行荧光原位杂
交引.这种方法受胎儿性别的限制.随着显微操作与
PCR技术的发展,使得挑取单个细胞进行PEP扩增
成为可能.通过挑取富集的单个细胞与母源DNA进
行连锁分析能确定有核红细胞的来源,这种方法不受
胎儿性别的限制.
NRBC鉴定的方法有荧光素原位杂交
(Fluorescenceinsituhybridization,FISH),引物原位
标记技术(primedinsitulabeling,PRINS),引物延伸
预扩增法(primerextensionpreamplication,PEP),多
重置换扩增(multipledisplacementamplification,
MDA),STR—PCR进行胎源性鉴别.
FISH是一种非放射性原位杂交法,它利用特殊
的荧光素标记DNA探针,在染色体制片,细胞滴片
或组织切片上进行DNA杂交,经免疫荧光显色,可
以检测细胞内DNA或RNA序列存在与否,其快速,
安全,灵敏度高,特异性强,使快速诊断染色体的异常
成为可能,已成为新的产前诊断的方法_2.
Babochkina[..认为由于母体内的高氧环境使得胎儿
NRBC发生皱缩,不易被FISH所识别.Shin等[293应
用五色荧光原位杂交,通过细胞分选标记X,Y,l3,
l8,2l号染色体,准确识别非整倍体妊娠.最近,在美
国应用电脑软件,开发了实用光谱影像诊断法
(appliedspectralimaging,ASI),应用skypaint特异
性探针作杂交,再以ASI系统成像,最后以skyview
光谱核型分析电脑软件运算处理频谱,可分辨出一般
摄影机或肉眼无法分辨出的影像颜色.此skypaint探
针可显示24种不同颜色,即彩色FISH.
PRINS技术是继原位PCR之后而创建的分子
细胞生物学新技术,用于细胞或染色体原位检测
DNA或RNA.PRINS技术将PCR技术和原位杂交
技术有机结合,兼有放大目的基因和定位的特点.最
新的国外研究将该技术应用于染色体异常,单拷贝基
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因的异常以及肿瘤相关基因变异等研究_3D]均有成功
报道,从而揭示了其强大的临床应用潜力.Krabchi[]
对l2例妊娠中期孕男性胎儿的孕妇,取3ml外周血
未经富集运用FISH和PRINS技术进行标记,通过
荧光显微镜识别胎儿XY细胞,可以得到2,6个胎
儿细胞.我国陈汉平等_3.采用PRINS,PEP和巢式聚
合酶链反应方法检测孕妇外周血中单个胎儿细胞的
性别决定区Y基因(SRY)基因片段的结果表明,
PRINS检测SRY基因的敏感性97.56,特异性
i00,在三种方法中最高,PEP技术加PCR方法检
测SRY基因的敏感性为97.399/5,特异性为
99.17,也远高于巢式聚合酶链反应的80和
87.5%.证实PRINS和PEP—PCR这两种检测技术
敏感性高,特异性强,适用干单细胞基因的检测.最
近,Krabchi_3妇又运用双色PRINS技术对孕妇外周血
中分离的胎儿细胞XY染色体进行不同颜色标记,其
鉴别效果与FISH相似,但在耗时和费用方面却优于
FISH.
PEP主要以15个碱基的随机寡核苷酸为引物,
在DNA聚合酶的作用下,通过多次热循环反应,使
原有的基因组拷贝数放大数十倍,取小份产物可以进
行多位点PCR扩增或重复扩增特异基因序列,以证
实实验结果_3引.有研究表明,单个拷贝的二倍体细胞
用PEP技术可使其789/5的基因组序列增加30倍以
上_3引.Sekizawa等_3首次成功地应用胎儿NRBC,经
过PEP进行全基因组扩增,对Duchenne型肌营养不
良症(DMD)进行产前诊断.此技术解决了孕妇外周
血中胎儿细胞数量少,难以成为临床实用的非创伤性
产前诊断方法的难题.
MDA能够提供高度均一完整的全基因组序列,
确保最低的位点扩增误差,使产物与模板的遗传序列
信息保持一致,是一种真正意义的全基因组扩增方
法_3引.在100/A反应体系中,从100fg到10ng的起始
模板扩增后的DNA产物都能一致地保持在20,
30/~g,十分稳定_3,且平均长度>lOkb,能更有效的
解决胎儿细胞模板量不足的问题.
STR(shottandemrepea,短串联重复序列)是由
长度为l,6个碱基的核心序列串联重复而成,由于
重复数目的差异而构成STR等位基因的遗传多态
性.采用STR的多态位点结合PCR来扩增获得STR
多态片段.STR位点扩增片段长度等位基因传递符
合孟德尔遗传规律,代表胎儿的DNA仅有一半与孕
妇外周血DNA基因型相同,另一半与父亲相同,则
可确定血浆中检出了胎儿DNA.这对确定细胞的来
源是否为胎源性有着重要的判断价值.该技术对男女
GuangxiSciences,Vo1.14No.2,May2007
性胎儿均能检测到,弥补了检测SRY基因鉴定胎儿
DNA受胎儿性别限制的缺陷,从而可以作为判断所
取细胞的来源.韦红英等L3对28例轻型地中海贫血
孕妇外周血中获取的298个NRBC进行PEP—PCR
后,运用STR--PCR进行胎源性鉴别,结果证实其中
胎儿NRBC130个,占43.6.
4结束语
孕妇外周血中胎儿细胞的发现为非侵人性产前
诊断提供了一个新的发展前景.目前最理想的提取孕
妇外周血中单个胎儿有核红细胞的方法是首先取孕
妇外周血进行富集,用胚胎或胎儿血红蛋白抗体进行
标记,识别,应用显微操作技术得到单个有核红细胞,
继以各种PCR技术扩增单个有核红细胞的基因组
DNA,并进一步应用STR连锁分析验证为胎源性,
进行遗传病的诊断.
无创性产前基因诊断方法目前己有了突破性进
展,但仍有一些问题有待不断探讨解决.比如,胎儿
NRBC在母外周血中的量及最佳富集时间,寻找敏感
的胎儿NRBC特异性标记避免母血污染,操作步骤
的简化以及如何降低实验费用使之广泛应用于I临床.
相信随着生物技术的成熟,从孕妇外周血提取胎儿
NRBC进行产前诊断将广泛应用于临床.
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(责任编辑:邓大玉)
GuangxiSciences,Vo1.14No?2,May2007