关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述

关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述 关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述 摘要:孤雌激活随着近年来体细胞克隆技术的兴起而成为了又一研究热点，而猪由于其生理结构与人的相似性，所以其卵母细胞的孤雌激活更具有特别的研究价值，文章就孤雌激活的概念、机理、方法、影响因素等方面全面论述了猪卵母细胞孤雌激活的研究概况。 关键词:猪;卵母细胞;孤雌激活 孤雌生殖(parthenogenesis)作为一种生殖方式在无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见，在鱼类、两栖类、爬行类和鸟类等脊椎动物中也存在孤雌生殖的现象，但哺乳动物在自然状态下则未见有孤雌生殖现象。孤雌生殖的关键是提高‎‎卵母细胞的激活率，通过人工模拟自然条件下卵母细胞的自然激活机理(卵母细胞的自发激活和精子穿入引起卵母细的激活)创造更多更好的激活方法，从而进一步提高卵母细胞的孤雌激活率，一直是孤雌生殖研究的重点内容，具有重要的研究价值。 一方面可把卵子活化的各个过程(如皮质反应、减数分裂的恢复和发育到第l次卵裂过程)分开来研究，对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要意义。另一方面，卵母细胞激活是细胞核移植和胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的关键环节，卵母细胞的激活率的高低直接关系到ICSl技术的效率，目前，卵母细胞激活率很低是核移植和胞质内单精子注射成功率低的重要原因之一。同时，由于猪的生理结构与人的诸多相似，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者，且猪的数量充足，妊娠周期短，产仔多，容易饲养，取材容易，充分满足临床需要，未来在生物医学方面有潜在的重要应用前景，这使猪的孤雌激活技术成为近年来的研究热点，这对于畜牧业和生物医学具有重大理论和实践意义。 1. 卵母细胞孤雌激活的概念 [1] 孤雌生殖是指无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生个体的。孤雌繁殖生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，而卵子在自然条件下的激活是由精子穿入刺激引起的，即由于精子的进入启动M ?期卵母细胞继续发育，这一过程称为卵母细胞的激活。卵母细胞的激活分为3种，即为自发激活(常见于行孤雌生殖的动物和老化卵母细胞)、精子激活(自然条件下有性生殖动物的精卵结合)和人工激 活。通过人工模拟自然条件下卵母细胞的激活机理，在体外也可以通过各种理化刺激使处于M?期的卵母细胞激活，即为卵母细胞的人工孤雌激活。 2. 卵母细胞孤雌激活的机理 2+ 自然条件下，受精引起卵母细胞激活后的主要事件包括细胞质内游离Ca浓度的升高、皮质颗粒胞吐和阻止多精受精、减数分裂的恢复和第二极体(PB2)释放、雌性染色体转化为雌原核、精子去致密转化为雄原核、雌雄原核内DNA复制、雌雄原核在卵子中央部位相互靠近、核膜破裂及染色质混合等。钙离子振荡和钙波是激活过程的初始信号，随后引起包括皮质颗粒(CG)释放、细胞内pH改变、母源mRNA的补充等一系列激活反应，最终导致原核形成、DNA合成起始 [2]和卵裂。卵母细胞M?期的维持与高水平的成熟促进因子(MPF)。活性有关MPF 2+的活性是由对Ca非常敏感的细胞静止因子(CSF)来维持的，CSF的作用是抑制停滞于M?期卵母细胞内的CyclinB的降解。卵母细胞受精或人工激活后，细胞 2+内Ca浓度迅速增加，使CSF的活性消失，cyclinB被降解，从而引起MPF的活性降低或消失，细胞离开M期，完成减数分裂并进行卵裂。不论是受精激活 2+2+或人工激活M?期卵母细胞都会发生的顺时性升高Ca，也就是说C的震荡引a 2+发的Ca是卵母细胞激活的特征性事件，由此通过相关信号转导路径并最终引发相关蛋白质的磷酸化和去磷酸化反应，从而启动发育。 3. 常见卵母细胞孤雌激活的方法 卵母细胞孤雌激活方法可归纳为物理刺激、化学刺激和物化联合处理3类。物理刺激包括机械刺激、温度刺激以及电刺激处理等;化学刺激包括酶刺激、离子载体处理、麻醉剂处理以及蛋白磷酸化抑制剂处理等;物化联合处理有电刺激 2+联合A23187(Ca载体);乙醇(EH)联合放线菌酮(CHX)、离子霉素(Ion)联合6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)等。目前，电刺激是应用最广泛的卵母细胞激活方法，此外乙醇、钙离子载体、6-DMAP、CHX(放线菌酮)等也用于卵母细胞激活。对于猪卵母细胞的激活而言，有使用化学试剂激活卵母细胞的报道，但大多学者仍倾向于使用电激活，并认为电激活足以使猪卵母细胞充分激活。但是采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体，影响其发育。因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来，使得孤雌激活胚胎为二倍体。 3.1 物理激活 物理激活方法中，机械刺激和温度刺激，因其操作繁琐，稳定性和重复性差，且孤雌激活率偏低，较少被人们采用。相对而言，电刺激激活方法因简便易行、稳定性、重复性较好，且集激活和融合为一体，而被广泛应用。其原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改 2+变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞(使细胞内外(介质)中Ca进入细胞， 2+并使胞质内Ca浓度升高，从而引起卵母细胞的激活。电脉冲引起的微孔大小受 [3]电脉冲强度、脉冲宽度、电脉冲次数、电激液类型等条件的影响。Vitullo等 2+提出，控制电脉冲参数，模拟出正常受精过程中浓度节律性Ca脉冲升高，可复 [4]制出正常受精过程中的一系列变化。据张德福等报道，在猪卵母细‎‎胞激活过程中，进行一次电脉冲，其激活率和激活后孤雌胚发育效果均高于施以多次电脉冲 [5]2+刺激。Sin等则发现通过培养液调节Ca浓度水平比通过改变电脉冲强度和持 [6]续时间更有效。吴中红等通过用电激活得出其最佳场强和脉冲时程为130V/mm，作用80us的情况下，其囊胚发育率为(20(12?8.18),，而且发现多次 [7]脉冲并不比单次脉冲的激活效果好。李光鹏等以体外成熟的猪卵母细胞为材料，以乙醇、电脉冲和氯化锶为人工刺激条件，研究了蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)对猪卵母细胞的孤雌激活效果的影响。结果表明，乙醇、电脉冲和，SrCl2均可使猪母细胞激活，而电脉冲的激活效果最好。当分别与CHX联合使用时，激活率显著高于单独的乙醇、电脉冲或SrCl2刺激。说明，CHX与乙醇、电脉冲及SrCl，联合使用对猪IVM卵母细胞激活具有显著的协同促进作用。 2 3.2 化学激活 乙醇是发现较早的一种化学激活剂，其机理在于乙醇可以改变卵母细胞膜的 2++2+稳定性，使钙库的C释放出来，同时增加细a胞外Ca2的渗入，从而胞质内‎‎Ca浓度升高引起卵子活化。乙醇对卵母细胞的激活主要是引起的形成，细胞膜IP3 2+通过IP3受体介导C释放。目前经过大a量的实验己经证实:乙醇激活卵母细胞一般采用了7,,8,的培养液作用5,7 min可取得较好的激活效果，长时间处理 [8-9]会降低激活率。大量研究表明，单纯的乙醇刺激激活率较低，只有联合其他激活方法后，激活率才会有所提高。离子霉素(Ionmycin,Ion)近年来发现的一种高 2+效Ca载体，已被广泛地应用于哺乳动物卵母细胞的激活中。Ion与钙离子载体 2+2+A23187不同的是，Ion并不直接引起的跨膜转运Ca，而是动员细胞内的，Ca 2+2+依次触发Ca内流，引起细胞内Ca升高，从而造成卵母细胞的激活，与乙醇相 2+2+比，由于它仅动用钙库内的，所以引起的CaCa波动较为平缓，因而效率更高。2+2++Sr与Ca属于同族的二价阳离子，是目前已知唯一能引起胞内多重升高的Ca2‎‎ 2+2+二价阳离子，Sr能诱发胞质内一系列C浓度的升高a，并且能使激活的卵子达 2+2+到原核阶段。Sr对卵母细胞的激活作用可能是通过细胞膜上的通道进入细Ca 2+胞内，并进入钙库(内质网和线粒体)，置换出内源释放入胞质Ca中，使胞内游 2++[0-11]离的Ca浓度增加，进而介导了依赖Ca2多重升高的‎‎皮质反应。另外，蛋白质合成抑制剂CHX(放线菌酮)和蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP(6一二甲氨基嘌呤)也用于卵母细胞的孤雌激活，CHX主要抑制卵母细胞维持在M?期所需要的MPF和CSF的合成，进而使卵母细胞内MPF活性迅速下降，卵母细胞脱离M Il期，完成第2次减数分裂导致卵母细胞激活。CHX可使小鼠和牛卵母细胞发生激活，但单独使用CHX不能使猪IVM卵母细胞活化，说明猪卵母细胞对CHX不敏感，只有与其他刺激因素联合使用时才能起协同促进作用。由于在卵母细胞成熟和受精过程中涉及到多种蛋白质的磷酸化和去磷酸化，所以，作为一种重要的蛋白质磷酸化抑制剂6-DMAP常用于卵母细胞的激活中，它通过抑制β34蛋白第l61位酪氨酸的磷酸化和cyclinB的磷酸化使MPF活性下降。细胞分裂由M II中期向末期II发展。同时6-DMAP还抑制纺锤体形成时微管蛋白的磷酸化进而 [12-13]抑制了极体的排出，但对DNA的合成没有抑制作用。此外，细胞松弛 素B(CB)、透明质酸酶、乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal，THI)和二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)等其他激活剂对卵母细胞也有一定的激活作用，但效率较低，须与其他激活剂联合使用才能提高激活率和发育率。 3.3 理化联合激活 单一的激活剂或激活方式产生的激活率和发育率往往比较低，因此，目前不少学者普遍采用复合激活法来激活卵母细胞，但有关复合激活卵母细胞的效果比较的研究还比较少，不过还是取得了一定的进展，现已知道联合激活比单一激活的激活率和孤雌胚发育率都要高。李光鹏等报道，单独使用乙醇、电脉冲和氯化锶激活猪卵母细胞，其激活率分别为11.9,，61.3,，41.9,，而将它们与放线菌酮(CHX)联合使用，则其激活率分别升高到27.8,，81.1,，74.5,。吴中红等 [14]报道，离子霉素和乙基汞硫代水杨酸钠激活体外成熟的猪卵母细胞，其卵裂率和囊胚发育率分别为58.43,，l2.26,和61.60,，5.12,，而离子霉素与6-DMAP联合使用以及乙基汞硫代水杨酸钠与二硫苏糖醇(DTT)联合使用，则其卵裂率和囊胚发育率分别为68.81,，21.28,和86.67,，l9,。不同组合方式其激活效果也不同。在孤雌激活研究中，一般采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚大多为单倍体，影响其发育，因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来进行激活。由此可见，几种激活方法的联合使用，特别是能够诱发胞内钙波的激活方法与蛋白质磷酸化抑制剂联合使用，不但可以提高卵母细胞的激活率，而且还能促进原核的形成和孤雌胚胎的发育率。 4. 影响卵母细胞孤雌激活效率的因素 哺乳动物卵母细胞孤雌激活受多个方面因素的影响，最主要的是受激活方法和激活剂的控制，不同的激活方法和激活剂的选择，对卵母细胞的孤雌激活率、卵裂率级囊赔率均有较大程度的影响。其次，卵母细胞的成熟质量对其孤雌激活率也有重要影响，一般来讲，成熟质量越好的卵母细胞其孤雌激活率也就越高，孤雌激活胚的发育率也就越高，所以尽可能的优化卵母细胞体外成熟培养的条件，提高卵母细胞体外的成熟的质量可提高体外激活效果。另外，卵母细胞体外成熟时间长短对卵母细胞孤雌激活也有一定程度的影响，体外成熟培养时间的延‎‎长，可引起老化卵的孤雌激活发生，在鼠、兔和牛的研究中，均发现随卵龄的增加激活率上升。张箐等也证实随着培养时间的延长，猪卵母细胞的卵裂率升高，但也并非是体外成熟时间越长越有利于体外受精和卵母细胞的激活:卵龄和激活的关系目前尚不完全清楚，有待进一步研究，可能是老龄卵母细胞CyclinB的降 2+解途径对于细胞内释放更为敏Ca感所致。最后，卵母细胞激活过程中的培养液的选择、激活时间、激活温度等对卵母细胞的孤雌激活效果均有一定的影响。 5. 孤雌激活胚的的类型和体外发育 孤雌活化卵在一定的培养条件下可以开始卵裂并发育。正常受精时，M?期卵母细胞将有一半的染色质以第二极体的方式排出，而在孤雌激活中，由于刺激因素、刺激强度、培养液类型和渗透压等等因素的不同往往使第二极体不能排出。因此，不同激活方法所形成的孤雌胚核型有差异。据研究表明，孤雌激活胚主要 [16]有以下5种核型:?激活卵第二极体未排出，由2个混合的单倍体原核组成一 个二倍体核，称为杂合二倍体(heterozygous diploid);?激活卵第二极体排出，发育成一个单倍体原核，称为均质单倍体(uniform haploid);?激活卵第二极体排出，其雌原核加倍形成纯合二倍体(homozygous diploid);?激活卵迅速分裂成2个均等的卵裂球，一个含雌原核，一个含第二极体，构成嵌合单倍体(mosaic haploid);?激活卵激活后完成第2次成熟分裂时未排出第二极体，出现异常延迟分裂，构成嵌合单倍体。一般说来，孤雌胚可完成着床前的早期发育而形成形态正常的囊胚，体外条件下少数二倍体孤雌胚能发育至前羊膜腔甚至圆筒期，但是孤雌胚附植后发育到一定阶段便发生死亡，这可能是由于孤雌胚的细胞质和细胞核的功能存在一定程度的缺陷。对内源性基因和外源性导入基因表达特性的研究发现，来源于父母的基因在配子发生过程中发生修饰作用，从而使二者在发育中 [17]具有不同的功能。雌雄原核间存在染色体不同修饰说明雌雄原核间存在互补作用，它们的共同存在和不同表达对胚胎正常发育具有重要作用。试验证明，孤 [18]雌胚的成分限于形成原始外胚层系，即胚体和卵黄囊中胚层;雄核胚的成‎‎分限于形成滋养层和原始内胚层系。雌核胚未能发育成个体，也可能是雌核胚的内细胞团不能形成卵黄囊内胚层所致。另外，与正常受精胚胎相比孤雌胚体内外发育能力均较差，孤雌激活卵的卵裂率和囊胚形成率均低于正常受精卵。此外，所有类型孤雌胚的发育速度都比正常受精胚慢，均质单倍体的卵裂尤其慢。不同类型孤雌胚发育能力亦相同，二倍体孤雌胚的生活力超过均质单倍体和嵌合单倍体。 6. 卵母细胞孤雌激活研究的问题与展望 现阶段，猪卵母细胞体外孤雌激活的研究之所以还不很令人满意，究其原因，一方面是卵母细胞体外成熟(IVM)率和质量并未达到对其作进一步研究的要求，需要在现有的基础上对体外成熟加以改进;另一方面是卵母细胞IVM后的孤雌激活率低，激活质量差，导致激活后发育阻滞或异常发育。所以综合来看，这两方面需要研究解决，比如用一些方法激活的孤雌生殖胚囊胚发育率低、同一方法同一物种因研究者的不同往往结果差异也很大，因此有必要对其继续进行研究。并且随着哺乳动物体外受精、胚胎体外生产、转基因和动物克隆等高新技术的不断应用和开发人们对具有受精能力和发育潜力的高质量卵母细胞的需求量的日益增加，卵母细胞的孤雌激活的应用与研究前景十分广阔。 参考文献 [1] 邓满齐, 范必勤. 小鼠卵激活过程中胞质游离Ca2+ 的变化及孤雌发育的研究[J]. 实验生物学报，1994，27 :289-293. 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