金鱼H1组蛋白基因及其N端片段的克隆、表达及抗菌活性

金鱼H1组蛋白基因及其N端片段的克隆、表达及抗菌活性 金鱼H1组蛋白基因及其N端片段的克隆、 表达及抗菌活性 袖医学工程学杂志zoo6 ;z3(3),609~614BiomedEnJg'0;'o,o,' 金鱼HI组蛋白基因及其N端片段的克隆, 表达及抗菌活性 魏泉德余新炳LiraHoSungChaHyungJoon 1(中山大学医学院病原生物学室,广州510089) 2(韩国蒲项工科大学化学工程系暨分子与生命科学部) 摘要用RT—PCR方法从金鱼体内成功分离得到编码HI组蛋白的基因,基因登录号AY184811.该基因与来 源于大西洋鲑鱼的抗菌蛋白一H1组蛋白有极高的同源性(78).将全长基因及其N端(2—38氨基酸)序列成功克隆 于毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K并表达;表达产物初步 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 有抗菌活性.结果表明,金鱼H1组蛋白为一种新发 现的抗菌蛋白,其N端来源肽 (AEVAPAASAPPAKAPKKKSAAKAKKAGPAVGDLIVKA)为抗微生物肽.金鱼 H1组蛋白及其来源肽在金鱼先天免疫防御中发挥作用. 关键词抗微生物肽H1组蛋白金鱼毕赤酵母RT—PCR Cloning,ExpressionandAntibacterialActivityofHistoneH1 andItsN-terminalPeptidefromCarassiusauratus WeiQuande.YuXinbing.LimHoSung.ChaHyungJoon. 1(DepartmentofPathogenicBiology.MedicalCollegeofSunYat—startUniversity.Guangzhou510089,China) 2(DepartmentofChemicalEngineering&DivisionofMolecularandLifeSciences.Po hangUniversityof ScienceandTechnology,Pohang790-784.Korea) AbstractInordertodeterminewhetherH1histoneproteinsareassociatedwithinnateimmuneantimicrobial responseingoldfish.weextractedthetotalRNAfromthehemocytesofgoldfish(Carassiusauratus),designed3 pairsofprimersbasedonthepreviousantimicrobialpeptidesequencesfromfishandperformedRT-PCR.Among3 obtained-PCRproducts,weidentifiedanovelhistoneH1codingsequenceof576bpwhichbelongstothehistone H1familyandis78homologouswiththeaminoacidsequenceofhistoneH1fromSalmonsalarthathadbeen foundwithanimportantroleinsalmondefensesagainstinfectiouspathogens.TheH1histoneofgoldfishcontained 3predictingcleavagesitesthatdividedtheproteininto4parts.Wesuccessfullyclonedandexpressedthewhole CDs(NoATG)ofH1histoneanditsN-terminalpart(2-38aa)inPichiapPIC9Kexpressionsystem.Theproducts ofH1histoneanditsN-terminalderivingpeptide(AEVAPAASAPPAKAPKKKSAAKAKKAGPAVGDLIVKA) showantimicrobialactivity.TheresultssuggestedthattheH1histonefragmentreportedinthispaperisanovel antimicrobialpeptidefoundingoldfish.H1histoneplaysanimportantroleininnateimmuneresponsesofgoldfish. KeywordsAntimicrobialpeptides(AMPs)HistoneH1CarassiusauratusPichiapastorisRT- PCR 1前言 抗微生物肽(Antimicribialpeptides,AMPs)是 先天性免疫的重要效应分子,有广谱抗微生物活 性u,除了抗细菌,真菌及病毒的特性外,还显示有 抗肿瘤和促进伤口愈合的特性,因而引起研究者广 ?通讯作者.E—mail:quandew@hotmail.tom 泛的兴趣.在过去的2O年中,已有超过800种 AMPs从动植物,细菌分离出来[2]. 鱼能在微生物丰富的水生环境中生活,可能是 用其先天免疫系统作为第一道防线来抵抗微生物的 入侵,其特异性免疫系统在结构上较哺乳动物及两 栖动物简单,且在鱼秧阶段或低温环境下不完全有 效L5],因此非特异性的杀菌物特别是AMPs可能对 鱼类特别重要.已从鱼类分离约有几十种AMPs,而 6lO生物医学工程学杂志第23卷 组蛋白来源的AMPs在鱼类扮演着重要角色L2]. 本研究从金鱼分离出576bp的HI组蛋白编码基 因,其表达产物及N端来源片段显示抗菌活性.该 基因序列与来自于大西洋鲑鱼的抗菌蛋白一H1组蛋 白有极高的同源性L6],现报道如下. 2材料和方法 2.1动物及样本采集 取重约20,40g的金鱼3只,剖开腹部,用装 有18ga/l英寸针头的1ml结核菌素注射器心脏 穿刺取血,注射器内预先吸入100/al抗凝缓冲液 (0.45MNaC1,0.1Mglucose.30mMsodium citrate,26mMcitricacid,10mMEDTA,pH 4.6).血液体积最终共约300,500/al,然后按1:4 加含140mM巯基乙醇的异硫氰酸胍缓冲液 (RLTbuffer,Qiagen,用力抽吸数次匀浆. 2.2PCR引物 根据从鱼中已分离的AMPs(Salmogairdneri 的HI组蛋白,Hybridstripedbass的Picidinl及 Winterflounder的Pleurocidin家族) 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 3对引 物,引入EcoRI和AvrII酶切位点,Oligo—d(T)锚 定引物为Roche公司RACE试剂盒所带引物,用于 合成cDNA第一链及PCR(见表1). 表1PCR扩增所用的引物 Table1PrimersusedforPCRamplification 2.3总RNA提取 RNA提取用RNeasyMiniKit(Qiagen~,Cat. No.74104)进行,按说明书操作,提取金鱼总RNA, 加样于0.8琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,紫外 分光光度计测得RNA含量为19.4~g/ml,储存于 一 80?备用. 2.4RT—PCR 合成cDNA第1链用EnhancedAvianRT— PCR试剂盒(Sigma,Cat.No.RTPCR一20),按说明 书操作.10l反应体积中加5/al总RNA做 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ,1 /alOligo—d(T)锚定引物(10/aM)合成cDNA第1 链,然后以cDNA为模板,用表1中的各对上下游 引物做PCR,50/al反应体积中加cDNA2.5l,上下 游引物(20/aM)各1l,10XBuffer5/al,dNTP(10 /aM)1/al,TagDNA聚合酶0.5/al;条件为95~C2 min;然后95?30S,53?45S,68?60S共35循 环;68?延伸6min. 2.5PCR产物克隆及测序 PCR产物于琼脂糖凝胶分离,用QIAEX~II 凝胶纯化试剂盒(Qiagen~,Cat.No.20021)回收, 克隆于pGEM—Teasy载体(Promega),用Promega 公司的试剂盒(VizardPlusSVMiniprepsDNA purificationsystem)抽提质粒,双酶切及PCR鉴 定,由DNA自动测序仪(ABIprismmodel377, PerkinElmer)完成测序,测序用M13通用引物. 2.6序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 在GenBank,组蛋白数据库,SwissProt,NR andMonth数据库用BIAST程序做核酸及蛋白质 的同源性搜索分析,VectorNTI软件做cDNA测序 结果的载体序列剔除,阅读框架及蛋白质翻译分析; 氨基酸组成,蛋白质分子量及等电点预测.序列对齐 分析用CLUSTAIX;翻译所得蛋白质的信号肽及 剪切位点用SingalP分析;AntheprotV5.0软件用 于蛋白质结构,理化性质蛋白水解酶裂解位点分析. 结构域家族在ProDom数据库检索分析. 2.7表达质粒构建 根据测序所得金鱼H1组蛋白序列,重新设计 亚克隆引物,用引物GCGAATTCGCAGAAGTC GCACCAGCTG和ATGCGGCCGCTTAGGCTT TGCTGTCTTGG扩增全长序列去掉启始密码子 ATG,保留终止密码子(即2—191aa),用引物 GCGAATTCGCAGAAGTCGCACCAGCTG和 第3期魄泉德曹金忸Hl组蛋白齄饵盈其N端片段的克廛,裘逃及抗菌活性 ATGCGGCCGCTTA(;GCTTTAACGATCAGAT( 扩增N端2-38aa(见图3).引入EcoRl和NotT酶 切位点,以测序克隆为模板PCR.将PCR产物分别 克隆于酵母Pichia表达载体pPIC9K(见图1),重组 质粒转化E.c1]liI'OP10.PCR方法筛选阳性克隆. 双酶切鉴定.然后3'AOX]and5'AOX1通用I物 测序确定阅读框架是否披正确克隆. 围1t组酵母丹秘最达戴谇的橱是 FiglConslrt,ctlonlJichlaexpressionrecombinant 2.8表达产物 表达程序按]nvitrogen公司舶Multicopy Pichiaexpression试剂盘实验步骤操作首先从E. coliTOP10提取表达质粒,用BglI】酶切使之线型 化,产生毕赤酵母株GS115中的MuIS基因型;电穿 孔法转染GS115,用舍G418的培养基筛选含重组 子并用PCR法鉴定;阳性克隆于25mlBMGY培 养基.置于250ml三角烧瓶中3,3Ct300r/nlirJ)培 养18h,收集转化菌重悬于100mlBMMY培养基 并置于500ml烧瓶30振荡培养d,然后每h 加0.5的甲醇诱导表达,4d后收集上清做抗菌活 性初步鉴定,烧瓶用2层纱布覆盖以保证氧气供应 充足 2.9SDS—PAGE 取培养上清lml加等量样品液(05M/pH6.8 的TrisHCI.,10甘油;5SDS,5_士巯基乙 醇,0.25溴酚兰),于100C5rain.离心后加样于 15SDS一聚雨烯酰胺凝胶.电泳后银染. 2.10抗菌活性测定 琼脂单扩散法:IJ1{培养基中ISll1琉脂特+加 热融化,冷却至d5C别加入约6×10'cels/hi[大腑 杆菌,倒人平皿,待冷凝后打直径约4nlrn孔并在孔 中加入表达产物,37c过夜.观察孔周围抑菌带. 2.11核酸序列登录号 3.1RT—PCR结果 用金鱼RNA,引物pf1一pf2所做RT—PCR得 到产物(pfl2G)600bp及680bp2条带.经测序证实 为同一基因,均得到组噩白H1编码序列{引物p/3 +pf4无产物(pf34G);引物pf5+pf6得到产物 (pf56G)约lj0bp(见图2) MaktPII2(fp1"34(Il】1"56G 国2金鱼RTPCR结果 1DNAmarker:24盘衄C1]NA为挺扳之R1__PCR物 Fig2TheeleelrnphoresisresullofRT-PCR0ngMdfish(12fA'rgel 1.ane1DNAmarker:l_anP2一1.prr:f?nfRIPCR 3.2PeR产物克隆及测序 PCR产物均成功克隧于pGEMTeasy栽体并 测序.结果所有PCR产物均获得编码序列,但根据 Pf5一Pleurocidin)引物所得PCR产物与引物来 源肤编码序列无同源性或相似结构域.仅从金鱼得 到与Pfl+2引物(H1histoo.e)来源蛋白质有高度 同源性的序列 3.3金鱼HI组蛋白序列特点 编码序列长576bp,其翻译之蛋白质分子量为 19.^KD.等电点为n.20j;氨基酸38,39,58,59 及9{,9j中各有一潜在酉6j切割位点,因而将其分为 4部分(见图3);全长序列与来褫予大西洋蛙鱼 (Atlamiesalmon)的抗菌蛋白H1组蛋白极为相 似的序列,而N端氨基酸与之有约83同源性(见 图d)被克隆表达的N端2—38氪錾暖分子量为3.5 KD,等电点为l0.22,T)H一7的电荷为5.76 3.4ProDom结构域同源搜索结果 与H1组蛋白家族c(;186-120高分配对.结构 录 登 卧 的 白 蛋 组 鱼 金 得 所乩 验果 实n 本结 号3 兰至??… 一 第3躺魏柬镄等金鱼H1蛆蛋白基因及其N端片段的克鹰,表选及抗茁括性6l3 1 越 ilJ?????I i. 围6表迭产蜘的抗菌着性检测 Fig6Theantibacterialactivilyorexpressle.prl~lucts~ains! i lN37-peptidej2pP9KplasmidcontroI{jH1his:one 4讨论 组蛋白H1及其来源片段可能在金鱼抵抗细菌 的免疫反应中起重要作用.本研究从金鱼血细胞扩 增出576bpH1组蛋白cDNA序列,其翻译之蛋白 质分子量为i9.4KD.等电点为11.205;氪基酸38 39,58—59及94—95中各有一潜在酶切割位点,因而 可将其分为四部分:全长序列与米源于大西洋鲑鱼 (Atlanticsalmon)的抗菌蛋白一Hl组蛋白极为相 似,而N端氪基酸与之有约83同源性被克隆表 达的N端2—38氨基酸(N37)分子量为3.5KD,等 电点为10,22,pH一7的电荷为5.76.全长及N端 37氨基酸【均不含M)克隆于毕赤酵母表达载体 pPIC9K并成功表达.产物显示抗菌活性 组蛋白是染色体内的主要蛋白质,其功能是协 助折叠及包装DNA所有的组蛋白均是细胞的基本 蛋白质,含有相当数量的赖氨酸和/或精氨酸.目前 还不清楚组蛋白是被分泌,还是来源于在疾病过程 中被损坏的宿主细胞活性碎片].银早就已知道组 蛋白的杀菌特性].但直到最近才有组蛋白或组蛋 白来源的片段(主要是H1或H2B)杀微生物效果的 完整报道出现从蟾蜍得到的有抗微生物活 性的抽提物中存在特定的组蛋白片段;从鲶鱼 (catfish)得到的抗微生物肽buforinI和II以及类 似肽parasin,均起源于组蛋白H2A的N端'", 而其皮肤的抗微生物活性归功于组蛋白类似阳离子 蛋白质;从鼠巨噬细胞也分离出抗菌蛋白为组蛋 白]因此组蛋白可能在体内扮演着重要舟勺保护性 角色. 组蛋白H1来源的AMPs在鱼类扮演着重要角 色,.从大西洋鲑鱼发现的抗菌噩白质是来源于 组蛋白H1;H1组蛋白存在于鲶鱼的绒毛上皮细 胞表面及胞浆[】,人工台成的大西洋鲑鱼H1组蛋 白N端26aa肽HSDF一1(Ac—AEVAPAPAAAAP AKAPKKKAAAKPKK)和HSDF一2(AEVAPA PAAAAPAKAPKKKAAAKPKK—NH2)缺乏抗微 生物V.anguiltarumandA.salmonicida的活性,但 可增加溶菌酶的活性及增强抗微生物肽pleurocidin 的活性口据此可推测28aa脯的存在可增强甚至 协同其它组蛋白片段,其它鱼类天然抗生素的活性 来源于鲑鱼H1组蛋白(rainbowtrout)c端69个氨 基酸的片段更显示广谱抗G及G菌活性].而本 研究从金鱼得到的H】组蛋白基因全长及N端37 氨基酸表达产物均有抗菌活性,且与上述端26aa 肽及c端69aa肽有较高的同源性,属于Hl组蛋白 家族,可能在金鱼先天免疫中扮演重要角色.而N 端8氨基酸(259aa)肽也将被进一步研究是否有 抗菌活性 绝大多数的AMPs为6.个氨基酸以内的短 肽,带正电荷.本研究从金鱼组蛋白H1来源的肽 37符合此特性.天然的AMPs很难大量分离,基 因工程技术是大量生产AMPs的有效途径原核表 达抗菌肽可能由于糖基化等修饰的差异使原本有活 性的AMPs变得无活性,即便有活性亦会杀死表达 菌林本身,而毕赤酵母表达大部分AMPs可避免此 问胚,且成本大大低于哺乳细胞表达系统,易于操 作.本研究用毕赤酵母成功表达有活性的抗菌肽,为 AMPs的大量生产提供模式. 综上,本研究表明.金鱼H1组蛋白来源的端 37aa片段是一种新发现的AMP,H1组蛋白在金鱼 先天免疫中起重要作用;组蛋白来源的短肽将是寻 找新的抗菌肽的一个重要来源 参考文献 BomanHG.Innateimmunity 1mmufloIRev.2000:I73{5 2Fernandes】M.MolleGtKempGD.ct?,Isolationand charaeterisationofon~orh)ncinI1.ahistoneHl—derived 日ntimicrobiaIpeptidefromskinsecretionsofrainhowt. 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InfectImmun,1998;66l3255 (收稿:2004—04—05修回:2005—03—29) (上接第600页;ContinuedfromPage600) 由表3可知,盐酸恩丹西酮缓释片的释药动力 学符合Higuchi方程.本实验是以亲水性聚合物一 HPMC为骨架材料制成的亲水凝胶骨架片,将3批 样品的体外释放度平均值用Peppas方程进行拟合, 求算其释药指数n为0.5476,在0.45,0.89之间, 说明药物释放机制为非Fick扩散,即骨架溶蚀和药 物扩散的综合效应[5.6].该骨架片遇消化液首先表面 湿润形成凝胶层,表面药物向消化液中扩散;凝胶层 继续水化,骨架溶胀,凝胶层增厚延缓药物释放;片 剂骨架同时溶蚀,水分向片芯渗透至骨架完全溶蚀, 药物全部释放.其释药特征表现为先快后慢,这是由 于凝胶层逐渐增厚而使释药逐渐减慢所致,这对于 临床使用该药物有一定益处.口服后,血药浓度迅速 达到治疗浓度,而后的缓慢释放用于维持治疗浓度. 参考文献 LijY.DongE.LiH.eta1.Studiesonthefactorsinfluencing metforminhydrochloridereleasefrommatrixtabletsandthe optimizationofformulation.JournalofShenyang PharmaceuticalUniversity,2003}2O(2):89[李嘉煜,董娥. 李华等.盐酸二甲双胍缓释片释药因素考察及处方筛选.沈阳 2 3 4 6 药科大学.2003}20(2):893 MooreJW.FlannerHH.Mathematicalcomparisonof dissolutionprofiles.PharmaceuticalTechnology.1996~June:64 ZhengF.ShiLY.WangH.Thefactorsofdrugreleasefrom HPMCmatrixtablets.JournalofBaojiCollegeofArtsand Science(NaturalScience).2002}22(3)l197[郑峰.史丽颖.王 辉.羟丙基甲基纤维素凝胶骨架片体外释药的影响因素.宝鸡 文理学院(自然科学版).2002}22(3):197] FanZT,WangXW.ZhaoZH,eta1.Thestudyonpreparation anddissolvingcharacteristicsofsustainedreleasetabletsof dextromethorphanhydrobromide.ChineseJournalofHospital Pharmacy.1999}19(1o):598[范振亭.王晓文.赵中华等.氢溴 酸右美沙芬缓释片的制备及释放度研究.中国医院药学杂志, 1999;19(1o)t598] LuB.Newtechniquesandnewdosageformsofdrugs.Beijing: PeopleMedicalPublishingHouse,1998;309—313[陆彬主编.药 物新剂型与新技术.北京;人民卫生出版社,1998:309—313] ZhaoCS,CuiSM,GuoXL.eta1.Thestudyonthefactorsofthe releasemechanismoffenoprofencalciumfromhydrophillic sustainedreleasematrixtablets.JournalofShenyang PharmaceuticalUniversity.2001;18(4)t239[赵春顺.崔升森. 郭晓蕾等.非诺洛芬钙亲水凝胶缓释骨架片释药机理影响因素 考察.沈阳药科大学,2001}18(4):239] (收稿t2004—04—26修回;2004—1i-19)