中药山药中多糖成分提取、分离、含量测定及对胃肠功能的影响

中药山药中多糖成分提取、分离、含量测定及对胃肠功能的影响 姓名：汪岩    学号：S2010210  专业：中药学 山药为薯蓣科薯蓣属植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎。山药生用功偏补肾生精，益肺肾之阴，麸炒则长于益脾和胃，益肾固精[1]。临床上麸炒山药主要做为滋阴或补阳的臣药，功偏补益[2]。补益药的药理研究主要包括免疫学研究[3]，山药多糖具免疫调节作用[4]，对对胃肠的功能具有一定的影响。本实验研究以大黄造脾虚模型小鼠，研究山药多糖成分对胃排空率及肠推进率的影响，同时以胸腺指数和脾脏指数作为衡量模型动物体内免疫水平的基本指标，考察山药麸炒前后多糖成分补脾健胃作用及相关免疫指标的变化，为进一步阐明山药补脾健胃作用的可能机制。 1 仪器、材料与山药多糖的提取 1.1仪器与试药 分析天平；蒸发仪；离心机；紫外分光光度计。 大黄（注明购买地点、批号）；阿托品（注明厂家、生产批号）；生理盐水（注明生产厂家、批号）；酚红（厂家、批号）；淀粉酶（厂家、批号）；墨汁；NaOH；其它试剂为分析纯。 1.2动物 有生产许可证和使用许可证的小鼠80只，其中雌雄各半，体重比较均衡。 1.3山药多糖的提取 取山药药材500g，加水冷浸12h，水煎煮1.5h，两次，合并水煎液，加入2%新鲜配制的淀粉酶溶液于60℃保温5min，目的是出去淀粉。再进行抽滤，滤液浓缩至体积为500ml，以95%乙醇醇沉至含醇量为80%，静置过夜，抽滤，滤渣依次经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，50℃真空干燥既得山药多糖（粗多糖）。 1.4大黄水煎液的制备 取大黄饮片50℃热风干燥，然后称取500g，加入8倍量水冷浸12h后，水煎煮1.5h，两次，合并滤液，最后将滤液浓缩至浓度为1g生药材/ml，储存备用。 2精制山药多糖的分离 将山药粗粉50 g ，置索氏提取器中，经石油醚( 60～90℃) 回流提取，弃提取液，药渣挥干石油醚，再用80％乙醇回流提取，以除尽单糖，低聚糖及醇溶性杂质，药渣挥干溶剂后，加500 ml水于90℃，提取，合并提取液。抽滤浓缩， 用S e v a g法除去蛋白质。取除去蛋白质溶液流水透析8小时，除去小分子杂质，透析液浓缩加95％乙醇使含醇量达80％， 冰箱静置24小时，滤过，残渣先后用无水乙醇，乙醚，丙酮依次多次洗涤，60 ℃烘干，即得精制山药多糖。 3山药与麸炒山药多糖含量测定 3.1供试液的制备 取粗多糖5 mg ，精密称定，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得。  3.2 对照品原溶液的制备 称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解， 并稀释至刻度，即得。 3.3 检测波长的确定 精密移取对照品原溶液、样品溶液、蒸馏水各2 mL，分别加人5％苯酚1 mL，摇匀后迅速加人7mL浓硫酸，混匀，1～2min后于沸水浴中加热30min，冰水浴中冷却至室温，在 200～800nm间扫描。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，对照品原溶液、样品溶液在484nm处有最大吸收，且此处空白溶液无干扰，因此确定检测波长为484nm。  3.4 标准曲线的绘制 精密移取对照品原溶液0，1，3，5，7，9mL，分别置50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容， 得各浓度对照品溶液。精密移取上述溶液各2 mL，分别加入5％苯酚1 mL，摇匀后迅速加入7 mL浓硫酸，混匀，1～2 min后于沸水浴中加热30 min，冰水浴中冷却至室温，于484nm波长处测定吸光度值，以含量C(mg／mL)对应吸光度A回归绘制标准曲线，得其回归方程为Y=12．633x一0．0137，r= 0．9994，线性范围为0．0096～0．0912mg／mL。 3.5 方法学考察 3.5.1 精密度试验 精密移取0．05mg／mL的无水葡萄糖对照品溶液2mL，共5份，按标准曲线项下方法操作测定吸光度值，得RSD为2．11％，表明精密度良好。  3.5.2稳定性试验 精密移取供试液2mL，按标准曲线项下方法操作，每10min测1次吸光度值，到1h后改为每30min测1次，测定值在180min内保持稳定，表明供试液在180min内稳定。  3.5.3重复性试验 取麸炒山药1g(平行5份)，精密称定，按粗多糖制备方法制得粗多糖，取粗多糖5mg， 精密称定，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即得供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，测定吸光度，得RSD为2．52％，表明该方法重复性良好。  3.5.4加样回收率试验 取山药制品粗多糖，5份，每份5mg，精密称定，各精密加人1mg无水葡萄糖对照品， 其余参照供试品制备方法，作为加样回收供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，测定吸光度，得平均回收率为102．84％，RSD为2．96％。 3.6含量测定 精密移取供试液2mL，按标准曲线项下方法操作，于484nm处测定吸光度值，得山药生品总糖含量为72．63％，得率为4．91％；麸炒品的总糖含量为76．44％，得率为5．73 ％。  4 多胃肠功能影响的实验方法[5,6]与结果 4.1小鼠胃排空实验 取小鼠40只，随机分为4组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、中药组，每组10只，雌雄各占一半。给药方式见下表： 灌胃 组别 生理盐水 大黄水 煎液 阿托品 山药多糖 空白组 是 否 否 否 模型组 否 是 否 否 阳性对照组 否 是 是 否 中药组 否 是 否 是           连续灌胃给药15天，最后一天24h小鼠禁食不禁水，末次给药2h后，每只小鼠灌胃0.5ml酚红液，15min后处死小鼠，迅速开腔摘取全胃，置于5ml的0.1mol/L氢氧化钠中剪开，充分洗涤，洗涤液离心15min，于560nm处测定吸光度值，作为胃内残存酚红量，计算投入酚红量为0．5mL酚红液加入5mL的0．1mol/L 氢氧化钠溶液中的吸光度值。 计算胃排空率：  胃排空率（%）=（投入酚红量-胃内残存酚红量）/投入酚红量×100% 摘取胸腺及脾脏，分别称重。 结果显示：中药组能显著抑制模型小鼠的胃排空率。 4.2 肠推进试验 取小鼠40只，随机分为4组，分别为空白组、模型组、阳性对照组、中药组，每组10只，雌雄各占一半。给药方式见下表： 灌胃 组别 生理盐水 大黄水 煎液 阿托品 山药多糖 空白组 是 否 否 否 模型组 否 是 否 否 阳性对照组 否 是 是 否 中药组 否 是 否 是           连续灌胃给药15天，最后一天24h小鼠禁食不禁水，末次给药2h后，每只小鼠灌胃5%印度墨汁0.2ml，20min后处死小鼠，迅速开腹，从幽门至回盲部止，取小肠全长平铺于纸上，测量幽门至炭末前沿和幽门至回盲部的距离，按公式计算小肠推进率。摘取胸腺及脾脏，分别称重。 小肠推进率（%）=幽门至炭末前沿距离/幽门至回盲部距离×100% 结果显示：山药多糖能显著抑制模型小鼠小肠推进率，且胸腺指数及脾脏指数增加； 5 讨论 本实验建立脾虚泄泻小鼠模型，研究山药多糖成分对胃排空率及肠推进率的影响，同 时以胸腺指数和脾脏指数作为两个衡量模型动物体内免疫水平的基本指标。从实验结果观察：山药多糖成分能显著抑制模型小鼠的胃排空率及肠推进率，胸腺指数及脾脏指数均有一定增加。而阳性药硫酸阿托品其作用机制是阻断M胆碱受体，所以，其脾脏指数与胸腺指数与模型组相比基本无差异。因此，我们初步推测免疫调节可能是山 药多糖补脾作用的机制之一。因此， 可能还存在其它补脾机制。有关其具体的作用机制有待 于进一步深入研讨。  参考文献： [1]冉懋雄，郭建民．现代中药炮制手册[M]．北京：中国中医药出版社．2002：252—254．  [2]彭怀仁．中华名医方剂大全[M]．北京：金盾出版社，1990：174—180．  [3]陈奇．中药药理研究方法学[M]．北京：人民卫生出版社，1993：706—7l2．  [4]赵国华，李志孝，陈宗道，等．山药多糖的免疫调节作用[J]．营养学报，2002，24(2)：187—188．  [5]陈奇．中药药理研究方法学[M]．北京：人民卫生出版社，1993：331-341． [6]王晓明，易 杰，廖世新，等．脾虚动物模型的客观评估[J]．中华中医药杂志，2006， 21(7)：406—408．