【doc】巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望

【doc】巴斯德毕赤酵母 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达系统的研究进展和前景展望 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前 景展望 第27卷第5期 2010年10月 生物学杂志 JOuRNAL0FB10L0GY doi:10.3969/j.issn.1008—9632.2010.05.073 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景 Vo1.27No.5 ()ct.2010 展望 娄瑞娟,罗利龙一,张霞,张瑞刚,宋水LIJ (1.河北工业大学化工学院,天津300100;2.河北省生物研究所,石家庄050051; 3.石家庄市第二中学,石家庄050051) 摘要:巴斯德毕赤酵母经过近二十来年的发展,已经成为表达外源基因的优秀表达系统之一.成功地表达了许多 重组异源蛋白.从表达菌株,表达载体等方面详细综述了毕赤酵母表达系统的优点,如:营养要求低,可高密度发 酵,遗传稳定性高等; 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了可能影响巴斯德毕赤酵母表达系统的相 关因素,这些因素包括外源基因的特性,基因拷 贝数,产物稳定性及发酵策略等,结合这些因素和具体实践经验,就如 何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量 进行了阐述;讨论了该表达系统存在的不足之处并且展望了其发展 前景. 关键词:巴斯德毕赤酵母;表达系统;外源基因;高效表达 中图分类号:Q935文献标识码:A文章编 号:1008—9632(2010)05—0073—04 ResearchprogressandprospectsonPichiapastoris LOURui-juan,LUOLi—long 一,ZHANGXia,ZHANGRui—gang,SONGShui—shan (1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin300100;2.Hebei InstituteofBiology,shijiazhuang050051;3.TheSecondMiddleSchoolofShijiazhuang,Shijiazhuang050051,China) Abstract:Inrecent20years,Pichiapastorishasdevelopedintoahighlysuecessfulsystemfortheproductionofavarietyofforeign genesandexpressvariousrecombinantheterologousproteins.TheadvantagesofPichiapastorissuchaslownutritionaldemands,high— densityfermentation,highgeneticstabilityandseveralfactorsincludingPichiapastorisstrains,expressionvectorsweredescribedin thispaper,Impactedfactorsassociatedwithcharacteristicsofheterologousge ne,genedosage,stabilityofproductsandfermentation strategieswereanalyzed,aswellasstrategiesforimprovingexpressionlevels. Moreover,theproblemswithregardtounwantedglycosy— lationsandproteolytiedegradationoftheexpressedrecombinantproteinwer ediscussed.Finally,futureaspectsoftheuseofthePichia pastorisexpressionsystemwerealsoreviewedhere. Keywords:Pichiapastoris;expressionsystem;heterologouSgene;highlevel expression 酵母作为一种表达外源基因的宿主菌,既具有操 作简单,生长快等特点,又具有真核细胞的翻译后修饰 加工系统.在表达某些基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 产品时,可以大规模 生产,从而有效地降低成本.常用的酵母表达系统有 酿酒酵母表达系统,甲基营养型酵母表达系统和裂殖 酵母表达系统.其中,尤以甲基营养型酵母表达系统 中的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统最为常 用,它具有其他表达系统所无法比拟的特点:如自身分 泌的背景蛋白少,糖基化程度低,对营养要求低,可采 用廉价的培养基,易于高密度发酵等.因此,巴斯德毕 赤酵母作为一种现代分子生物学研究最重要的工具模 型,越来越受到研究学者的关注. 1毕赤酵母表达菌株 毕赤酵母作为一种甲醇利用型酵母菌,自20世纪 80年代年开发以来,通过不断的研究,至今已有多个 种属被开发出来,主要包括Candida和Pichia两个种 属,共有30余种,其中尤以毕赤酵母发展最快,研究最 清楚. 目前,用于外源基因表达的毕赤酵母菌株为In— vitrogen公司构建,主要有NR—RL—Y11430.SMD1165. SMD1168,KM71,MC100—3,GSI15,其中NR—RL—Y11430 为野生型,携带较多的AOX基因,需要大量的甲醇诱 收稿日期:2009—08—2l;修回日期:2009—09—16 基金项目:国家自然科学基金资助(项目编号:30970030);河北省自然科学基金资助(项目编号:C2006000707) 作者简介:娄瑞娟(1984一),女,硕士研究生,主要从事微生物技术研究; 通讯作者:宋水山,研究员,博士生导师,主要从事微生物技术研究,Email:shuishans@hotmail.coin. 73 第27卷第5期 2010年10月 生物学杂志 J0URNALOFB10L0GY 导,大规模发酵生产中存在火灾隐患,所以常用的表达 菌株通常为其余的几种,他们都是通过对野生型NR— RL—Y11430的改造而得到的,通常会缺失一种或几种 AOX基因.研究证明,AOX基因缺失的菌株比野生型 菌株更容易表达外源蛋白.而且这些表达菌株在组氨 酸脱氢酶位点(His4)发生突变,因而只能在含有组氨 酸的培养基中生长,而所有的表达质粒都有His4基 因,与宿主菌形成互补,利用这一特点可以在不含有组 氨酸的葡萄糖培养基(MD培养基)上筛选转化子.但 是GSI15和KM71存在一定的低频率自发突变,因此 平板筛选阳性重组子存在假阳性情况. GS115同时含有两个基因编码醇氧化酶基因 (AOXI,AOX2),其甲醇利用能力和野生型一样. KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)发 生突变,不能在缺乏精氨酸的培养基中生长,而且,它 的AOXI基因被酿酒酵母的ARC.4基因取代,只能依 赖利用甲醇能力弱的AOX2来表达AOX基因. MC100—3的两个基因编码醇氧化酶基因(AOX1, AOX2)都被剔除,完全不能存含有甲醇的培养基上生 长. 蛋白酶缺陷型菌株SMDI165和SMDI168含有 AOX1基因,能在甲醇培养基以野生型速率生长.然 而,基因组中缺失编码蛋白酶A(pev4)和(或)编码蛋 白酶B(prb1)的基因,因而可以减弱蛋白酶对外源蛋 白的降解作用.但是蛋白酶缺陷型菌株牛长缓慢,导 致外源蛋白的产量不高. 2毕赤酵母表达载体 2.1载体的结构和特点 用于转化酵母细胞的表达载体均为能在大肠埃希 氏菌和酵母细胞中表达的”穿梭”质粒.典型的巴氏 毕赤酵母表达载体中含有乙醇氧化酶基因5AOX1启 动子,多克隆位点(MCS),3AOX1终止子,组氨酸脱氢 酶基因(His4)营养缺陷型筛选标记和复制起点(ori), 分泌型载体还含有信号肽序列.如:pPICZct和 pPIC9K的—factor序列.毕赤酵母中没有稳定的天然 质粒,所以携带外源基因的重组载体必须整合到酵母 染色体才能实现外源基因的表达.一般来说:整合方 式有单交换和双交换两种.单交换整合,即在His4或 5AOX1位点将质粒线性化,然后通过单交换方式整合 到酵母染色体上,这种情况下AOX1基因仍然保留,所 以产生的转化子的表型为Mut+(methanolutilization plus,甲基营养利用型).双交换整合,即外源基因通 过重组替换了AOXI,使得酵母不得不依靠转录调控 弱的AOX2基因,从而导致对甲醇的利用能力下降,产 生的转化子的表型为Muts(methanolutilizationslow,甲 74 VnI.27No.5 Oct,2010 基营养缓慢型).但是,通过单交换整合方式发生的同 源重组所形成的单拷贝转化菌株具有更强的遗传稳定 性. 2.2筛选标记 酵母表达载体的选择标志主要包括his4,shble(用 zeocin筛选),kan(用G418筛选),adel,口rg4,ura3等, 这些筛选标记可用来筛选目的重组子高拷贝转化子. 目前,筛选策略一般是先利用his4基因和宿主进行互 补,通过不含组氨酸的培养基来筛选出阳性重组子,再 利用重组子对不同浓度的抗生素G418或zeocin的抗 性来筛选高拷贝数重组子.目前,Lin—eereghinoJ等… 打破常规,他们构建了新的表达载体pKANB和 pKANaB,这些载体上含有修饰过的Tn903kan基因,通 过对G418的抗性直接筛选出酵母转化子,而且表达载 体小(pKANB为4250bp),操作方便. 2.3启动子 2.3.1pAOX 毕赤酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养 基中生长,主要是因为细胞中含有甲醇代谢所必须的 酶,如醇氧化酶(AOX),过氧化氢酶,二羟丙酮合成酶 等.AOX是甲醇代谢过程中利用的第一个酶,而 AOX1基因是利用甲醇的第一个酶基因,也是毕赤酵 母表达中使用最广泛的启动子,它的表达是在转录水 平被调控的.AOX2基因与AOX1基因的编码序列相 似有92%的同源性,蛋白质产物则有97%的同源性. 在甲醇培养中,带AOX2的菌株比带AOX1的菌株生 长的缓慢得多.尽管如此,采用pAOX2表达外源基因 也有成功的报道. 2.3.2pGAP 三磷酸甘油醛(GAP)是一种组成型表达启动子, 不涉及甲醇,操作简单.表达载体pCAPZ和pGAPa利 用GAP作为启动子,它们无需甲醇诱导就能表达外源 基因.Menendez等认为pGAP作为启动子诱导外源 蛋白的表达量与pAOXI相当. 在构建重组毕赤酵母时,根据表达外源蛋白的特 点和需要,也可以同时利用pAOX1和pGAP构建表达 载体和重组细胞.吕中原等在利用重组毕赤酵母表 达s一腺苷甲硫氨酸(s-Hdenosylmethionine,SAM)合成 酶(sAMsynthetase,SAMS)时,同时采用了pGAP和 pAOX两种启动子,从而提高了表达产量. 2.3.3pFLD1 依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动子(pFLDI)是一 种高水平表达的诱导型启动子,它可以利用甲醇或甲 胺诱导FLD1表达外源蛋白,此时葡萄糖或甘油可代 替甲醇做为碳源. 第27卷第5期 2010年10月 一s%一瓤,?…t}蛾堍?一?#n”一t强一琏 生物学杂志 JOURNALO17,BIOLOGY 2.3.4plCL1 柠檬酸裂合酶启动子(plCLI)是一种能以甲醇为 唯一一碳源诱导型启动子,它能够在毕赤酵母中高效表 达葡聚糖酶.但是,关于它能否在毕赤酵母中启动外 源蛋白表达及其诱导表达条件,还需要进一步的研 究:. 2.4信号肽 对于分泌型表达载体,如pPIC9k,载体上还有一 段信号肽序列.通常可供酵母选择的信号肽分为两 类:酵母自身的信号肽和基因本身的信号肽.胞外常 用的且最为有效的信号肽是O/.因子前导肽序列(d—fac— tor).虽然外源基因自身的信号肽也能介导目的蛋白 的分泌,但是,有结果表明自身信号肽可能要优于外源 蛋白信号肽’.而且信号肽具有选择性. 3外源基因的高效表达 3.1外源基因的特性 外源基因的特性是决定表达成败的首要因素. (1)外源基因序列中5一UTR(untranslatedregions,非翻 译区)过长或过短都不利于蛋白质的最优化生产.高 效表达的AOX1的mRNA的前导肽长度为114个氨基 酸,且含有丰富的A+U.因此异源蛋白合成最理想 的条件是5r_UTR应尽可能靠近AOX1基因的mRNA, 并保持一致.(2)控制A+T的含量.A+rr的含量在 30%,55%之间最佳,因为过高的A+T有时会造成转 录的提前终止.(3)密码子的使用.酵母在密码子的 使用上存在偏爱性. 3.2基因拷贝数 适当增加目的基因整合到酵母染色体上的拷贝数 是提高外源基因表达量的基本策略.但是,整合过多 的外源基因的拷贝数可能导致重组DNA的不稳定. 目前筛选多拷贝转化子大多采用抗生素的方法,利用 基因剂量效应,分别依靠G418或zeocin的抗性水平来 快速筛选出高拷贝的整合转化子.通过southernblot 或real—timePCR分析外源基因拷贝数.但是这两种方 法前者费时费力,后者对扩增的外源基因有要求 (<200bp),吴丽娟等在传统的PCR方法基础l,建 立了分析外源基因在毕赤酵母基因组中整合数的高通 量定量分析方法,从而简化了实验操作,节约了时间. 3.3产物的稳定性 对于分泌性表达,蛋白酶降解目的蛋白是影响表 达量的一个重要因素.为_r防止这种情况,目前通常 采用的方法有以下几种:(1)调整培养基的pH值. (2)对于一些不稳定的蛋白,可以通过降低培养温度 来尽量避免目的蛋白被降解.(3)控制比生长速 率.(4)添加蛋白酶抑制剂或维生素来抑制或减少 Vo1.27No.5 Oct,2010 _?}一0:m|4 蛋白酶的分泌.(5)选用蛋白酶缺陷型菌株 SMD1163,SMD1165和SMDl168亦可避免表达产物的 降解.(6)突变外源蛋白基因的个别位点,改变其蛋 白序列中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏. 3.4发酵策略 3.4.1温度 温度对毕赤酵母发酵产物的活性,发酵液的物理 性质及生物合成方向等都有影响,温度升高,反应速率 加大,生长代谢加快,但温度过高,又会使酶易因热而 失去活性,菌体易于衰老,发酵周期缩短,影响产物的 产量.因此,必须选择合适的温度.发酵生产中,一般 采用变温发酵策略,即诱导表达时的温度要比菌体生 长时的温度低.. 3.4.2pH值 毕赤酵母生}?的pH值范围比较宽,因此应当选 择适宜外源蛋白表达的pH值.如真菌免疫调节蛋白 LZ_8在pH值5.8时表达量最低,随着pH值逐渐增加 到8.0,表达量达到最高270mg/I”.对于同一lL程 菌,其生长和表达的最适pH值也不相同. 3.4.3溶氧量 甲醇代跚过程中需要很高的溶氧量,因此在发酵 过程及时补充毕赤酵母代谢所需要的氧气对于外源蛋 白的产量是至关重要的,一旦溶氧受到限制,外源蛋白 的表达量也将会受到限制. 3.4.4甲醇的浓度和监测 在发酵过程中,需要定期补加一定量的诱导剂甲 醇以补偿甲醇的挥发和消耗.?般液体培养时,补加 甲醇的终浓度达到0.5%即可.但是具体情况需要根 据试验而定.在用甲醇诱导毕赤酵母表达碱性果胶酯 裂解酶的过程中,甲醇的终浓度达到0.8%时,酶的产 量增加最明显”.对于大规模发酵生产来说,通过在 线或离线检测甲醇的浓度至关重要,目前检测甲醇浓 度的方法有3种:(1)根据溶氧控制甲醇流加.(2)通 过气象色谱控制甲醇流加.(3)甲醇1_r油混合流加. 4前景展望 近年来,毕赤酵母表达系统应用的范围越来越广 泛,自20世纪80年代初到现在,人们已经用毕赤酵母 表达体系成功表达_r500多种蛋白,包括疫苗,激 素,干扰素,抗菌肽,酶,膜受体蛋白,细菌毒索及其衍 生物等.涉及的领域包括水产行业,饲料加:1=二业以及 动物传染病的防治等.有的产品甚至已经形成 商品规模化生产,并取得了专利.Invin’ogen公司不断 开发的快速表达试剂盒,多拷贝表达试剂盒和经典表 达试剂盒既完善了该表达体系又为科研工作者提供了 方便. 75 第27卷第5期 2010年l0月 生物学 J0URNAL0F 尽管如此,毕赤酵母表达系统也存在着一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 , 如对于某些蛋白的分泌并不能达到理想的效果,而且, 毕赤酵母的糖基化程度比哺乳动物偏大,而且糖基化 途径与人不同,从而影响了其表达的蛋白的结构和功 能,过去的20多年里,有很多研究者致力于毕赤酵母 的N一糖基化改造过程中.王越等成功构建了敲 除仪一l,6一甘露糖转移酶基因的巴斯德毕赤酵母,和野 生型相比,大大降低了蛋白质的糖基化程度,从而为酵 母的糖基化工程提供了基础.另外,分泌产物表达不 均,信号肽加工不完全,表达产物降解等,这都在一定 程度上限制了毕赤酵母的应用. 同时在大规模发酵生产中,如何最优化甲醇的流 加和及时在线监测甲醇的浓度也是科研工作者面临的 一 个难题. 我们相信,随着发酵 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 的不断完善和对巴斯德 毕赤酵母的深入研究,巴斯德毕赤酵母必将不负众望, 展现更美好的未来. 参考文献: [1jLin—eereghinoJ,HashimotoMD,MoyA,ela1.Directselectionof Pichiapastor~expressionstrainsusingnew(24l8resistancevectors [J].Yeast,2008,25(4):293—299. 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