甘草根茎乙醇提取物抗菌活性研究

甘草根茎乙醇提取物抗菌活性研究 甘草根茎乙醇提取物抗菌活性研究 第26卷 Vo1.26 第2期 No.2 植物研究 BULLETINOFBOTANICALRESEARCH 2006年3月 Mar.,2006 甘草根茎醇提取物抗菌活性研究 壅,- 陈丽艳施晓光付玉杰候春莲王微刘君星 (东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040) 研究了甘草根茎乙醇提取物对5摘要本实验采用琼脂扩散法和微量肉汤稀释法, 种细菌( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,大肠杆菌和绿脓杆菌)和2种真菌(白色念珠茵和 黑曲霉)的抗茵活性.结果表明,甘草根茎乙醇提取物对革兰氏阳性茵非常敏感,而对革兰氏阴 性茵和真菌不敏感,80%乙醇提取物对革兰氏阳性茵的MIC范围为0.156,0.312mg?mL,,而 l0%乙醇提取物对革兰氏阳性茵的MIC范围为0.625,1.250mg?mL,,表明甘草根茎抗茵活性 成分在高浓度乙醇中溶解度较大,为临床上应用甘草根茎醇提物作为抗茵制剂提供了科学依据. 关键词甘草;乙醇提取物;抗茵活性 Theantimicrobialactivityofethanolicextractsfromthe licorice(GlyeyrrhizauralensisFisch.)roots ,f CHENLi—YanSHIXiao—GuangFUYu—JieHOUChun—LianWANGWeiLIUJun— Xing (KeyLaboratoryofForestPlantEcologyofMinistryEducation,NortheastForestryUniversity,Harbin150040) f AbstractTheethanolicextractsfromlicorice(Glyc),rizauralensisFisch.)rootswereexaminedfor antimicrobialactivityagainstfivebacteria(Staphylococcusepidermidis,Staphylococcusaureus,Bacillus subtilis,Escherichiacoli,Pseudomonas}aeruginosa)andtwofungi(Candidaalbicans,Aspergillusni— gar)byusingdiscdiffusionmethodandbrothmicrodilutionmethod.Resultsshowed,ethanolicextracts fromthelicoricerootsexhibitedhighsusceptivityagainstgram— positivebacteria,whilenosensitivitya— gainstgram— negativebacteriaandfungi.TherangeofMICof10%ethanolicextractagainstgram-posi, tivebacteriais0.156,0.312mgmL,.whilethatof80%ethanolicextractis0.625, 1.250mg?mL,.Theresultsindicatedthatantibacteriallyactivecomponentsoflicoricerootscandis solvedinhigherconcentrationethanolm, oreeasily,whichprovidesscientificbasisfortheapplicationof ethanolicextractsfromthelicoriceroo , t.ssantibacterialpreparationinclinic. Keywordslicorice;roots;ethanolicextracts;antimicrobialactivity ' 甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)是种多年 生豆科植物,是我国特有的传统中药,它在我国治 疗疾病己有2500多年的历史,被历代名区尊为众 药之王.甘草中含多种化学成分,主要成分是甘草 酸和甘草黄酮.甘草及其提取物在医药,食 品,化妆品等行业中有着广泛的应用.据报道,甘 草具有抗溃疡,抗菌,抗炎,解痉,降血脂,镇痛,抗 律失常,抗病毒,抗肿瘤等作用,甘草根茎也 作为添加剂及调味品被用在烟草,糖果,牙膏及饮 料中.随着科学技术的发展,新技术和新理论 基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET--04-0316),哈尔滨市科技攻关 计划项目(2004AA3CS172~)和黑龙江省自然科学基 金重点项目(zJN04-03) 作者简介:陈丽艳(197l一),女,硕士研究生,从事植物次生代谢产物研究. 通讯作者:E-mail:fuyujie1967@yahoo.COIiq.C/1 收稿日期:2005一ll一3l 植物研究26卷 的不断涌现,对甘草的研究也在不断地广泛深入. 关于甘草的提取及化学成分的研究,国内外已有大 量的报导,近些年,甘草的活性研究已成为关注的 焦点ts...为了进一步开发利用甘草植物资源, 本研究对甘草根茎乙醇提取物的抗菌活性进行对 比研究,为甘草制剂的进一步研制及其在临床上 的应用提供试验依据. 1仪器和材料 1.1主要仪器 DL—CJ-2N超净工作台,DK-98—1电子恒温水浴 锅,SHB—Ul循环水式多用真空泵,RE62AA旋转蒸 发仪水浴槽,LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭 菌器,HZQ—F全温振荡培养箱. 1.2药材与试剂 3年生甘草根茎饮片由黑龙江大庆甘草种植 基地提供,经本室聂绍荃教授鉴定为乌拉尔甘草 GlycyrrhizauralensisFisch..牛肉膏,蛋白胨,琼脂 等皆为生化试剂.无水乙醇和二甲基亚砜均为分 析纯试剂. 1.3菌种及培养条件 表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis),金 黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢 杆菌(Bacillussubtilis),大肠杆菌(ck枞coli) 和绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa),白色念珠菌 (Candidaalbicans)和黑曲霉(AspergiUusnigar)均 购自于黑龙江省微生物研究所.前三种为革兰氏 后 阳性菌,大肠杆菌和绿脓杆菌为革兰氏阴性菌,两种为真菌.除黑曲霉用察氏培养基于28~C培养 5d外,其余菌种均于营养琼脂培养基37~C培养 24ht?. ? 2试验方法 2.1植物提取物的制备 取干燥的甘草粉30g,分别用10%和80%乙 醇溶液在80cI=水浴上回流提取,固液比为1:10,分 两次提取,每次2h.合并滤液,前者浓缩至约50 mL,用200mL无水乙醇沉淀,放置过夜,滤过,滤 液用旋转蒸发仪蒸干,称重,然后用10%DMSO溶 液使其溶解并用灭菌蒸馏水稀释至一定体积. 80%乙醇提取物直接浓缩至干,操作同前. 2.2菌悬液的制备… 将上述供试菌种用适宜的斜面活化后,以无菌 水制成含菌数约为10.cfu?mL菌悬液. 2.3抗菌活性实验 2.3.1甘草乙醇提取物抑菌直径的测定 抑菌直径的测定采用琼脂扩散法?川.用无 菌棉签蘸取10.cfu?mL的试验菌悬液,在营养 琼脂平板表面均匀涂抹3次,然后绕平板边缘涂抹 一 周,盖好平皿,室温干燥5rain,滤纸片(直径 6.0mm)平放于无菌平皿内160?干热灭菌2h,每 片滴加甘草的不同浓度乙醇提取液(100,200 mg?mL)20,开盖室温自然晾干,用无菌镊 子取样片轻轻贴放于平板表面,每个平板贴3片试 验样片,1片无菌生理盐水对照片.各实验菌株在 相应的培养条件下培养.测量抑菌直径,实验重复 3次. 2.3.2甘草乙醇提取物MIC及MBC的测定 MIC及MBC的测定采用微量肉汤稀释 法?J.MIC(MinimalInhibitoryConcentration)为 最小抑菌浓度,即药物与一定浓度的菌液作用后, 能够抑制可见菌生长的最低浓度,MBC(Minimal BactericidalConcentration)为最小杀菌浓度,即在 MIC基础上,从每管吸取l0溶液,点于固体培 养基上,继续按MIC培养条件下培养,以杀灭 99.9%细菌数量的最低浓度为最小杀菌浓度.采 用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水稀释系列浓 度(0.0782,40mg?mL),在96孔板上每孔加 100wL不同浓度的药液和100wL菌液,使最终菌 液浓度为1,5×10'cfu?mL,,以无菌生理盐水 加菌液做为阳性对照,每个实验重复3次. 3试验结果与讨论 3.1甘草乙醇提取物的抑菌直径 通过上述抑菌直径试验,获得了甘草根茎 10%和80%乙醇提取物的抑菌直径试验结果,见 图1和图2所示.图1为甘草根茎乙醇提取物对 两种菌的抑菌图像直观图,图2为甘草根茎乙醇提 取物对5种细菌(表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌, 枯草芽孢杆菌,大肠杆菌和绿脓杆菌)和2种真菌 (白色念珠菌和黑曲霉)的抑菌直径试验结果. 由图1可以看出,甘草根茎80%乙醇提取物 对同一种细菌其抑菌直径比甘草根茎10%乙醇提 取物的抑菌直径大.由图2可以看出,两种提取物 都对革兰氏阳性菌敏感,而对革兰氏阴性菌及真菌 不敏感.对两种革兰氏阴性菌及两种真菌的抑菌 直径与滤纸片的直径相等,都是6.0m脚,没有扩 散;而对三种革兰氏阳性菌敏感性较强,甘草根茎 2期陈丽艳等:甘草根茎乙醇提取物抗菌活性研究 10%乙醇提取物(100mg-mL)对表皮葡萄球 菌,金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌的抑菌直径分 别为10.58.2,I1.0mm,80%乙醇提取物(10o mg?mL)对相应的三种菌的抑菌直径分别为 I2.7,I1.3,14.7m甘草根茎10%乙醇提取物 (200mg?mL)对以上三种的菌的抑菌直径分别 为12.0,?.0,J1.5.80%乙醇提取物(200 mg?mI_)对相应的三种菌的抑菌直径分别为 I4.7,14.3,18.01Tim.=由此可见,同一浓度的甘草 根茎80%乙醇提取物比lO%乙醇提取物的抑菌活 性强,同一醇提取物的抑菌活性,其浓度越大,抑菌 活性越强. B 图l甘草的抑菌图像 A与B为对表皮葡萄球菌的抑蘸图像:A甘草10%乙醇提取l物f100mE?m1...BU 革80%乙醇提取物(100mg-ml..】;c与D时 枯草芽孢杆菌的抑菌凹像:c:廿卓10%己醇提取物(2OO…1),D甘草80啦乙醪提取物(2t30rag?mL..) Fig.IInhibldonpictures(,reLharmlicextracI】rtI】If~ot'iceIx~ols AandB:lnhibilkmpLLt.a'anlsSlaphyh~:n?…epldemlidis:Aw10%elhan~lHx1?00nrg?…I一).B…80%ethanolitexlm~l fl(mm8-【_);c趼?In:lnhj1tI1硼pielu~s10*Bm~illusstthtillis:i:was10%thamdieext[aI,lc200rag?mL一).B80%than. olleextm(If200mg?mll.1 喜 毛 晕 A:100?-?1Lelhanoli~ex1t.B:200rrrg??lllethan?dic…lT【 Se-epklernudL~;Sa.…l;. Bncdb~fE陆:E,如rk'hicedi;Pa.…?删蜘:.?di daalfiicamAn^xdlm? 3.2甘草乙醇提取物的MIC和MBC 通过MIC和MBC试验,甘草乙醇提取物的 MIC和MBC见表】所示. 由表】可看出,甘草根茎乙醇提取物对革兰 氏阳性菌抗菌活性较强.而对革兰氏阴性菌及真菌 在20mg—mL范围内没有抗菌作用,同时还可以 看到,甘草根茎80%醇提物比10%醇提物的MIC 及MBC小,10%乙醇提取物对表皮葡萄球菌,金黄 0864^108642 232植物研究 色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌的MIC分别为1.250, .250和0.625mg?mL,,对应的MBC分别为 1.250,2.500,1.250'mg?mL,;而80%乙醇提取 物对三种相应的革兰氏阳性菌的MIC分别为 0.313,0.313,0.156mg?mL,对应的MBC分别 为0.625,0.625,0.156mg?mL,,由此可以看 出两种提取物的MBC等于或2倍于相应的 MIC. 表1甘草根茎乙醇提取物的MIC和MBC结果 Table1MICandMBCofethanolicextractsfromlicoriceroots(mg?mL一') 通过两种提取物的抗菌活性的对比研究,结果 显示甘草根茎两种乙醇提取物都对三种革兰氏阳 性菌(金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,枯草芽孢 杆菌)比对革兰氏阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌) 及真菌(白色念珠菌及黑曲霉)的抗菌活性强,在 2Omg?mL的浓度范围内对革兰氏阴性菌及真 菌的MIC,MBC未检出.同时,甘草根茎80%乙醇 提取物比10%乙醇提取物的抗菌活性强,这是因 为不同浓度乙醇所提取的化学成分及含量不同而 导致抗菌活性不同?,抗菌活性高的活性成分更 易溶于高浓度的乙醇中.通过本研究可以得出,甘 草根茎乙醇提取物具有良好的抗菌活性,尤其对革 兰氏阳性菌更敏感,而80%乙醇提取物比相应的 10%乙醇提取物的抗菌活性更强.因此根据甘草 根茎乙醇提取物的抗菌特性,可以选择高浓度乙醇 的甘草根茎提取物作为临床感染性疾病的选择性 用药,同时本研究也为甘草资源的综合开发利用提 供了科学依据. 参考文献 1.徐子硕,甘草及其制剂中化学成分测定方法进展[J]. 中草药,1994,25(7):385—386. 2.NomuraT,FukaiT.Phenolicconstituentsoflicorice(Gl3"- cyrrhizaspecies)[J].ProgressintheChemistryofOrganic NaturalProducts,1998,73:1—140. 3,沈金灿,卢素格,甘草提取物的液相色谱质谱联用分析 [J].现代中药研究与实践,2004,18(增刊):16—18. 4.王浴生,邓文龙,薛春生.中药药理与应用[M],(2 版).北京:人民卫生出版社,2000:248—248. 5.李铁民,梁再赋.甘草提取物及其衍生物的抗病毒研究 现状[J].中草药,1994,25(12):655—658. 6.黄彩云,谢世荣.甘草水提液抗实验性心律失常的作用 [J].大连医科大学,2003,25(1):13—15. 7.Eun—HyeJoa.Sung?HoonKim.Chemopreventiveproper— tiesoftheethanolextractofChineselicorice(Glycyrrhiza uralensis)root:inductionofapoptosisandG1cellcyclear— restinMCF.7humanbreastcancercells『J].CancerLet— ters,2005,230:239—247. 8.ChungWT,LeeSH,ChaMS,eta1.Biologicalactivities inrootsofGlycyrrhizauralenaisFisch[J].KoreanJournal MedicineCropScience,2001.9:45—54, 9.TimCushnieTP.LambAndrewJ.Antimicrobialactivi【v offlavonoids[J],InternationalJournalofAntimicrobialA— gents2005,26:343—356. 10.HaraguchiH,TanimotoK,TamuraY,eta1.Modeofanti— bacterialactionofretrochalconesfromGlycyrrhizaittllat0 [J].Phytochemistry1998,48:125—129. 11.周正任.医学微生物学[M],(6版).北京:人民卫生出 版社,2003:135—137. 12.HernrndezT,CanalesM.Compositionandantibacterial activityofessentialoilofLantanaachyranthifoliaDesf. (Verbenaceae)[J].JournalofEthnopharmacology,2005, 96:55l一554. 13.ChandrasekaranM,Venkat~saluV.Antibacterialandanti. fungalactivityofSyzygiumjambolanumseeds[J],Journal ofEthnopharmacology,2004,91:105—108.