【doc】右旋糖酐酶防龋作用的实验研究

【doc】右旋糖酐酶防龋作用的实验研究 右旋糖酐酶防龋作用的实验研究 ?IB'? ? 龋病防治研究? 中华口腔医学杂志1991年第26卷筹6期 右旋糖酐酶防龋作用的实验研究 北京1:1腔医院1:1腔医学研究所 中国科学院擞生物研究所 李玉晶赵宝荣葛葡华 刘凌波杨玉琴 程秀兰孙晋武 囊要本研究应用右旋糖酐酶进行了变健菌人工苗斑的定量比较和扫描电镜观察. 说明右挂禧酐酶 具有显着的抑制和分解菌斑的作用动物致龋实验证明此酶能有效地抑制龋齿的 发生和发展.右旋糖酐 酶不仅能较多地分解水溶性葡聚桔.而且能分解多量水不溶性葡聚糖.对以上两种 多糖的有数分解是右 旋糖酐酶消除苗斑.预防龋齿的作用机制. 关键词右旋糖酐酶娄牙苗斑龋齿 变形链球菌是主要的致龋菌,在口腔内遇 判蔗糖时,菌体表面能合成葡聚糖等细胞外多 糖,这些多糖物质可以将大量细菌粘附于牙齿 表面,形成玎二菌斑.因此,分解这些多糖是消 除牙菌斑,预防龋齿和牙周病的重要 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 . 本研究采用右旋糖酐酶(Dcxtranas~)进行 了多项实验,观察此酶对珂二菌斑的抑制,分解 作用和预防龋齿的作用,为临床应用此酶预防 龋齿和牙周病提供了科学依据. 材料和方法 本研究所用的右旋糖酐酶f中国科学院搬生物研 究所提供)屉用漩紫拟青霉8523苗液澄酵提取的在 实验室用蔡氏漏斗滤制成无菌酶液备用.实验前用 8omogyi-Nelson法检验酶活力,以右旋糖酐为底物. 测定生成的还原糖量,定每分钟产生1?m0l还原糖 所需要的酶量为一个酶活力单位.用此法测定本研究 中所用的酶原液的酶活力为330u/mI[1.进行下述四 项实验. 1.右旋糖酐酶对人工苗斑作用的定量比较t将 国际C型变链菌接种于TSB增菌液中.37~C.鹌小 时镦氧培养后离心,清洗,用生理盐水调菌液.使光 密度值(OD)为0.5备用. 用踺康离体前牙20十,在颊侧釉质中制备成2O 个4×6×2mq1_的釉质片,每个牙片用不锈钢丝固定 于试管塞上,釉质片与管塞一起经超声洗涤1o分钟一 75乙醇中浸搀一小时,生理盐水冲贽后备用.灭茸 后釉片甜组做如下处理. 第一组.l0个釉质片分别置人装有10ml蔗糖培 养基中.加oD为0.5的变链菌液0.5ml. 第二组10个釉质片分别置人装有10ml蔗糖培 养基中.加入OD为0.5变链苗液0.5m1.再加入 右旋糖酐酶液1.0ml,使试管中液体酶活力单位为 30u/mL. 以上两组试管均经37~C.镦氧培养6关.每隔一 天换培养基.实验结束后取出釉质片用洁治器分别 彻底刮取牙片上垒部牙菌斑,细心收集在已知重量的 滤纸上真空干燥.24小时后再称重.记录纯牙菌斑 干重,用统计学方法处理,比较两组菌斑的平均干 重. 2.右旋糖酐酶对人工牙苗斑作用的扫描电镜现 察取正畸减数双兜牙:l7个.选颊面无裂隙,无映 损,无白斑的郭位为实验医用不锈钢丝将牙分别悬 吊干装有l0ml蔗糖培养基中.另外备试管内加OD 为0.5变链苗液0.5ml.17个牙分四组处理. 第一组.5十平,每个试管加入30u/m]右旋糖 酐酶液1ml,后经48小时撒氧培养. 第二组5个牙,先经48小时徽氧培养.再置人 30u/m1酶液5ml中授泡20分钟. 第三组一2个牙.先经鹌小时微氧培养后,再置 人330u/ml酶液5ml中浸泡20分钟. 眭t犏码100050 第四组:5个牙,经d8小时微氧培养后做对照. 实验处理后17个牙:标本经戊二醛一锇酸双固定 法翻备扫描电镜标本.临界点千燥t喷金t最后用 JM一35扫描电镜在20kV条件下观察变链菌附着牙: 面的情况. 3.右旋糖酐酶分解葡聚糖量的比较:取d0个试 譬,分别装入蔗培培养基5ml,OD为0.5的变链菌 靛0.5ml,标奉分两组. 第一组20个试管,每个试管分别加入30u/mL 酶液0.5ml. 第二组,20个试管,不加醇液. 垒部试管经37微氧培养d8小时后测定褐聚糖 含量. (1)水不溶性葡聚糖(下称IO)量的测定t停止培 养后两组各取10个试管,离心,清洗,真空干操后 用NaOH溶解,用酚一硫酸珐测定各试管内IG的含 量[". (2)总葡聚糖(下称TG)量的测定.两组各余10 个试管在停止培养后,分别加入75的己醇2ml,半 小时后离心,清洗,真空干燥,再用上述方i軎分别测 定TG含量. (3)可溶性葡襄糖(下稚SG)量按T0一IG:s0 方兰得出. a.右旋糖酐酶对动物龋齿的作用:选生后23天 Wistar大自鼠38只舟为二组,雌雄各半,分笼喂 养体重在36~52g实验从断乳之日(生后23天) 开始给我室的标准致龋食物】,每周接种一次变链茁 (国际血清c型).每天取30ulml右旋糖酐酶液lOO ml和不合酶蒸馏k90m】,分别培实验组和对照组. 先用酶液和蒸馏水涂攘两组大鼠上下磨牙二的颊,舌, 雅面,剩余的蕊渡和蒸疆7k分别给两蛆动物饮用.经 83天实验后处死六自鼠,然后在立体显微镜下检直井 统计龋齿发病情况动物的龋齿分度诊断同人,井计 算, 备组动物龋齿发病卑=查檠曩i臻 备组动物龋均查暴羞暑{嚣 结果 1.右旋糖酐酶对人工菌斑作用的定量比 较:实验结束后从不加酶培养基中取出釉质牙 片,可见袁面有多量牙菌斑附着,呈絮状或穗 状,已看不到牙片原来表面;从加酶培养基中 取出的釉质片表面仅见有极少量物质贴附.两 组牙片上菌斑干重溯定结果:加酶组与不加酶 组分别平均为3.O3mg和13.45mg.加酶组 牙片上附着的牙菌斑明显比不加酶组少,菌斑 抑制率可达77.4.两组经统计学检验(P< 0.001),说明右旋糖酐酶确有阻止细菌附着 表面的作用. 2.右旋糖酐酶对人工菌斑作用的扫描电 镜观察:第四组牙标本在不加酶培养基中有多 量变链菌附着于牙表面,成簇状,菌链较长, 菌体之间有多量基质,有的部位多稽基质呈条 索状或包裹着菌体(图1). 第一组牙标本从含酶培养基中取出后可见 牙面大部分区域有少量变链菌附着,个别部位 有成群细菌但基质较少(图2). 第二纽牙标本在30u/ml酶液中浸泡2O 分钟后,剐可见牙面上变链菌数目减少,散 在分布,基质很少,可见多处正常釉质外露 (图3). 第三组牙标本经330u/ml的酶液处理过 的牙面上变链菌和多糖基质更少(图4). 观察结果说明,右旋糖酐酶不仅可以抑错 变链菌粘附牙齿表面(第一组),而且可以使已 粘附于矛表面的菌斑分解脱落(第=组).高 浓度酶液(330u/m1)的这一作用更显着(第三 组) 3.右旋耕酐酶分解葡聚糖量的比较两 组培养基中TG量的测定结果,加酶组与对照 组分别平均为677.52g和1413.4g;IG量 加酶组与不加酶组分别平均为499.08和 859.0g. 按TG--IG~SG方法可以得到可溶性葡 聚糖(SG)量.加酶组的SG为178.44g.g,对 照组SG为554.4g 可溶性葡聚糖量与不溶性葡聚糖量之比在 加酶组为SG:IG:O.36:1I不加酶组为SG: IG一0.65:1 本实验结泉经统计学检验说明,加酶培养 基中产生曲TG,IG,SG均比不加酶培养基 中明显减少(P<O.ooi).可溶性葡聚糖在加 酶培养基中比不加酶的分解量多. 4.右旋糖酐酶对动物龋齿的作用:两组 动物实验患龋情况见附表. 附衰右旋糖酐酶Y:,l'Wistar大鼠龋齿作用 两组动物龋均经检验P<o.001,有非 常显着性差异说明右旋糖酐酶有显着抑制龋 齿的作用. 讨论 自1968年Fitzgerald发现右旋糖酐酶具 有阻止菌斑形成的作用以来,国外学者们进 行了许多实验研究和临床现察].本研究将右 旋糖酐酶放在培养基中,结果可见变链菌在牙 面上形成的牙二菌斑量比不加酶的牙面明显减 少,抑制率可达7'/.4%.从而证明右旋糖酐 酶有抑制牙菌斑形成的作用由扫描电镜现察 结果说明右旋糖酐酶能使已粘附到牙二面的牙菌 斑分解脱落,证明此酶有消除菌斑的作用.本 研究的动物实验结果看到此酶可使大鼠龋齿的 发生发展受到抑制,从而证明右旋糖酐酶有抑 制牙=菌斑,预防龋齿的作用. 过去有些学者认为右旋糖酐酶只能水解水 溶性的口一1.6糖苷键葡聚糖,而对与牙菌斑 形成有密切关系的不溶性的口一1.3糖苷键的葡 聚糖(变聚糖)则投有作用.本研究结果不支持 这种看法.本研究定变链菌培养基内加酶后 不仅葡聚糖总量,可溶性葡聚糖均比不加酶明 显减少,而且水不溶性葡聚糖量在加酶培养基 中也比不加酶显着减少.逸说明右旋糖酐酶对 水不溶性葡聚糖也有明显分解作用.二上捷之 等也曾报道,右旋糖酐酶也可以溶解水不溶性 葡聚糖lO.产生这一结果的机制尚待进 一 步研究.目前一些生物化学方面的研究指 出,水不溶性和可溶性葡聚糖均含有口一1.3糖 苷键与a-1.6糖苷键,只是两种键在其分子中 的比例和数量不同.右旋糖酐酶切断口一1.6糖 苷键,可以使两种葡聚糖均发生降解,形成短 链的异麦芽糖和葡萄糖.使多糖粘附细菌的能 力减弱或消失,新菌斑的形成被抑制,并使已 形成的菌斑分解脱落.因而作者认为:本研 究中扫描电镜的观察结果是右旋糖酐酶这一作 用的有力证明.动物饮用右旋糖酐酶液后龋齿 明显减少,是有效地抑制和分解菌斑的结果. 因此临床上推广应用此酶抑制牙二菌斑,以预防 龋齿和习=周病是有广阔前途的. (本文图1,4见插剪第19页) 参考文献 1.孙晋武.右旋糖吾干酶产生苗的筛选及其酶学性质的比较 i旰究.微生格1988;28.43. 2,张惟杰.复告多糖生化技术.第1版.上海科学技术出 版杜,1987:84. 3.李玉晶,等.龋齿的动物模型及其应用.实验动曲科学 1986~3:81. 1.孙晋武.右旋糖酐酶殛其应用.生物工程进展1986; l:26. 5.赵荧.右旋糖酐酶.生物科学动态1988,4:16. 6.T=izou0kada.Studyo[1theinhibitorysadde— compositioneffectsofchaetomlumgraci]edextra. naseonvitropiaqttcproducedbystfepIOc0ccu目 mutltns.J0saka0dont1982I45:190. 's9年9月9日收稿1091年8月l6日肇簧}