包裹nr2b重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析
包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析 包裹NR2B重组质粒免疫脂质体的制备及其特征分析
作者:施勇, 吴庆婷, 朱海艳, 李厚达【摘要】 目的: 制备包裹pcDNA3.1 NR2B重组质粒的免疫脂质体。方法: 采用逆相蒸发法, 制备含pcDNA3.1 NR2B质粒的脂质体, 并与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体(mAb OX26)相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、 粒径、 包封率及偶联抗体的分布进行初步检测研究。结果: 所获得的免疫脂质体近球形、 平均粒径低于100 nm、 包封率达30.4%、 偶联抗体呈均匀分布。结论: 成功地制备了免疫脂质体, 为应用于体内试验奠定了基础。 【关键词】 NR2B 免疫脂质体 特征 脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体, 可以延长包裹物的作用时间、 降低毒性, 具有一定的靶向性[1, 2]。免疫脂质体则是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体, 具有主动靶向的功能[3, 4], 为抗肿瘤和基因治疗提供了新的思路。本研究中采用逆相蒸发法将真核表达质粒pcDNA3.1 NR2B有效地包封在脂质体中, 形成纳米级颗粒, 并且与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体的单克隆抗体(mAb OX26)相连, 形成免疫脂质体, 并对其形态结构、 粒径、 包封率、 及偶联抗体的分布和数目进行了初步检测。 1 材料和方法 1.1 材料 pcDNA3.1 NR2B重组质粒由本室保存; POPC(1 palmitoyl 2 oleoyl sn glycerol 3 phosphocholine)、 Distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE)
PEG2000、 DSPE PEG2000 maleimide购自Avanti公司; DDAB(didodecyldimethylammonium bromide)购自Fluka公司; 薄膜挤出器购自Avestin公司; 旋转蒸发仪购自巩义予华公司; Sepharose CL 4B为Pharmacia公司产品; 限制性内切酶购自Fermentas公司; 质粒小量提取试剂盒购自V GENE公司; DNaseI和exonuclease III购自TaKaRa公司; 质粒大量提取试剂由孙怀昌教授馈赠; 其他试剂为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 重组质粒pcDNA3.1 NR2B的扩增制备 用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA, 经BamH I酶切鉴定。将菌种大量培养, 大量提取质粒DNA。经10 g/L琼脂糖电泳检测其纯度, 并用紫外分光光度计测定其A260/A280值,
根据A260/A280比值估算其纯度, 根据
公式
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DNA浓度=A260×50 mg/L×稀释倍数, 计算其质量浓度。 1.2.2 免疫脂质体的合成及抗体的偶联 采用逆相蒸发法将POPC、 DDAB、 DSPE PEG2000及DSPE PEG2000 maleimide按一定比例溶解于氯仿中, 用旋转蒸发仪蒸发除去有机溶剂, 置水浴超声波仪处理5 min, 加入一定量质粒DNA在42?水浴和干冰中反复冻融, 并连续几次通过100 nm薄膜挤出器, 未包裹入脂质体的质粒用DNaseI和exonuclease III 37?
作用1 h, EDTA终止反应, 琼脂糖CL 4B柱分离包裹质粒DNA的脂质体和被核酸酶降解的DNA, 琼脂糖凝胶电泳检测。mAb OX26经修饰巯基化后与包裹质粒DNA的脂质体室温下轻摇连接过夜, 再次用琼脂糖CL 4B柱分离未连接的抗体和免疫脂质体。 1.2.3 脂质体的形态结构和粒径观察 取适量脂质体用3 g/L磷钨酸负染, 再滴至专用铜网上, 自然风干, 用透射电子显微镜观察脂质体的形态结构和大小。 1.2.4 免疫脂质体的特征分析 将收集到的未连接的抗体和免疫脂质体分别包被板子, 以HRP标记的羊抗小鼠IgG为一抗做直接ELISA实验, 以确定免疫脂质体是否已连接上抗体; 用5 g/L SDS破坏免疫脂质体的膜表面结构, 对其释放内部包裹的物质进行琼脂糖凝胶电泳观察; 同时将免疫脂质体与10 nm胶体金标记的抗小鼠IgG在0.018 mol/L Tris CL(pH,8), 3 g/L BSA, 170 mL/L甘油缓冲液中孵育1 h, 直接在透射电子显微镜下观察, 通过与mAb OX26特异性结合的抗小鼠IgG上胶体金的显色, 间接确定免疫脂质体上连接的抗体数目和分布。 2 结果 2.1 质粒DNA的提取 小量提取的pcDNA3.1 NR2B质粒经酶切电泳鉴定其相对分子质量(Mr)约为9800 bp, 与预计相符。大量提取的质粒DNA经电泳和紫外分光光度计测定, 其质量浓度约1.2 g/L, A260/A280比值约为1.89, 表明提取的质粒DNA纯度较高。 2.2 透射电镜观察脂质体的形态结构及粒径分布 由透射电镜照片可见, 制备的脂质体为粒径均匀的球状或近球状的小囊泡; 粒径分布范围从30 nm至150 nm, 平均粒径低于100 nm(图1)。 图1 脂质体的电镜图(×100000)(略) 2.3 脂质体琼脂糖凝胶电泳分析 将相同质量的质粒, 经反复冻融的脂质体, 通过100 nm薄膜挤出器的脂质体以及经核酸酶消化的脂质
体同时置于5 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 紫外灯下观察。经过DNaseI和exonucleaseIII处理, 未包裹入的DNA已被分解, 而脂质体能够抵抗核酸酶的降解。
同时通过Gel pro analyzer 4.0 software软件比较凝胶图中DNA的条带亮度, 可以较为准确地算出总DNA量和未包裹入脂质体的DNA量(图2), 根据包封率=,(总DNA量,未包裹入脂质体的DNA量)/总DNA量×,100%, 可得pcDNA3.1 NR2B质粒的包封率大约为30.4%。
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