噬菌蛭弧菌分离与纯化

噬菌蛭弧菌分离与纯化 1.采样,虾池水 底泥 虾池周围排水沟水 底泥 2.培养基,自来水或天然陈海水琼脂,双层琼脂平板 下层为1.0% 上层为0.5%琼脂。 宿主菌培养基,胰蛋白胨10g/L 酵母膏5g/L NaC1 10g/L PH=7.0-7.2 浸出液,1/10YP浸出液即 酵母膏0.03g/L 蛋白胨0.006g/L 用于将蛭弧菌从平板中浸出。 3.宿主菌及菌悬液制备 用于分离培养计数蛭弧菌宿主菌六株,副溶血弧菌 鳗弧菌 溶藻弧菌 嗜水气单胞菌 施氏假单胞菌 大肠杆菌 8 9 宿主菌菌悬液制备,,通常培养基中宿主菌的浓度采用10-10 cfu/mL， 斜面活化 2ml无菌水洗菌苔 4×4.5-5.0L/10L 4000 r/min离心 30-37? ? 4×100ml/500ml三角瓶 ? 30-37? 18-20h ? 30 min,去上清液 18-20h 180-200 r/min 180-200 r/min 无菌自来水洗涤一次 30-37? 18-20h 离心一次,去上清液 加无菌水定浓或 100-105?灭活10min 后集中沉降 24h去上 洗一次弃上清 清液 液,加入无菌水或生 理盐水调至 1210cfu/m L添加量 0.2%或调至 3× 10 10cfu/mL,添加量 15-20% 4.富集培养 100ml水样/250ml 5 ml宿主菌液 8 菌浓度达10Cfu/m1 ? 富集菌悬液 八层纱布扎口 PH7.0-7.6 25-28? 24-48h 注,虾池水 排水沟水富集培养后菌斑数量高于直接培养,池底泥反而减 少。 5.分离纯化 双层琼脂分离法,将1.0-1.5%琼脂注入无菌平皿,10 ml左右，,静置2-3h,分别注入0.5ml不同的梯度稀释菌液,然后将溶解后,0.5%琼脂，分装试管,5ml/只，置于45-50?水浴锅中,加入0.2ml浓宿主菌,蛭弧菌的计数,0.5ml蛭弧12菌液和0.2ml宿主菌,宿主菌浓菌液浓度10cfu/mL，,充分混均,趁热注入下层培养基上,均匀,25-30?,倒置5-7天,连续观察。 双层琼脂平板法培养蛭弧菌,24h有菌斑出现,一般48-72h出斑率高,直到5-7d,出现几种不同类型的斑,多数呈圆形,菌斑清晰,边缘整齐透明,菌斑大小随时间延长而增大并相互融合变得模糊。热死菌悬液出斑时间短,48h出斑，,菌斑清晰。在热死宿主菌生长蛭弧菌,再接种于活的宿主菌琼脂平板仍能恢复其生长scope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient State-owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research 特性和裂解活力。 菌斑纯化,用直径1-2mm吸管吸取或将菌斑挖出不同类形单菌斑置于1-2 ml,灭菌自来水或海水,1/10YP或1/500NB，中28?浸泡30min,然后用浸出液作双琼脂平板或梯度稀释作平板28? 2-3天形成二代菌斑,三代菌斑,出现菌斑形态均匀一致,取多个纯化噬菌斑置于4.0-6.0?条件下保存。 液体增殖试验, 95ml无菌水/250ml 蛭弧菌液 5ml蛭弧菌浸出液 ? 25-28?110 r/min 0.2ml宿主浓菌液 5-7天 PH7.0-7.6均匀 3-5天菌悬液转清 八层纱布扎口 经验数据,宿主菌液添加1/500即0.2% ,对培养基，蛭弧菌最10 佳生长条件,宿主菌浓度10 cfu/mL。 NaC1 3.0% PH7.0-7.2 25-30? 110 r/min 象其它细菌一样需要适量的NaC1保持渗透压外,还需要一定钙镁离子,当使用自来水 培养基时水中含阳离子的浓度基本保证蛭弧菌的需要, 海水种应考虑盐类作用。 天然海水作培养基比人工配制蛭弧菌的检出率高10倍,天然海水中存在不明促进因子。 6.蛭弧菌培养物保存方法 6.1灭菌自来水软琼脂保存法, 6.1.1培养基,琼脂4-5g/L 自来水1L PH7.4-7.6 加热溶解后分装试管,121? 20-30 min灭菌备用。 6.1.2菌悬液的制备, 宿主大肠埃希氏菌C600菌悬液的制备克氏瓶或茄型瓶斜面培养 30-37? 18-24h 用蒸馏水或自来水洗涤并结合接种环刮下菌苔,经离心沉淀制成3-4×9 10cfu/mL菌悬液。 蛭弧菌菌悬液的制备, 自来水宿主双层琼脂25-28? 2-3天菌斑,,当蛭弧菌平板形成融成片菌斑时，灭菌自来水洗涤上层琼脂,静置2-3 h,上清液即为蛭弧菌菌悬液。 6.1.3菌斑检查与计数 取4?保存蛭弧菌-宿主软琼脂0.5-1.0ml 置于2-3 ml灭菌自来水25-28?浸泡4-6 h,以自来水宿主双层琼脂平板检查菌斑形成并计数。 6.1.4蛭弧菌培养物的保存 蛭弧菌接种于自来水宿主双层琼脂25-28? 2-3天,取单菌斑数个于灭菌自来水中浸泡4-6 h,吸取上清液0.5-1.0ml和宿主菌悬液0.3- 0,5ml加到8ml自来水软琼脂长颈试管中,混均,25-28? 18-20 h,取出4?冰箱保存。每隔2-3月检测菌斑形成数目。 自来水软琼脂保存蛭弧菌培养物至少保存3-5月,转种一次不影响生活力。 6.2灭菌自来水中保存法, 3 -59将适量,10-10cfu/mL，蛭弧菌,大肠杆菌,2×10cfu/mL，菌悬液,混均,涂布于自来水琼脂平板表面,待干, 25-28? 40-48h时,待形成可见融汇成片菌斑时,加入5-10 mL灭菌自来水,浸泡1-2h洗下表面培养物。吸取洗液于三角瓶中,静置2-4h取上清液,检测上清液中蛭弧菌的数量，,取上清液分装在长 owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-obacco and other more efficient Statea focus on marketing the Government civil servants, official staff of public institutions, telecommunications, electricity, target customers, consumer loan customers: with scope this document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 t2 颈试管中,4?冰箱可存活。4-8月,在保存期间无需添加高浓度的宿主菌。 附, 1.蛭弧菌冻干粉活化与培养 冻干粉活化,1.0g冻干粉 100ml宿主菌稀释培养基25-28? 24-48h 110 r/min蛭弧菌培养, 9 80ml培养液加20ml宿主菌 配制宿主菌含量6×10cfu/mL 活化菌液接种量5% 10 ,5ml ， 25-28? 110 r/min 5-7天,3-5天转清。收获浓度3×10cfu/mL 2.噬菌蛭弧菌微生态制剂生产 ,专利， 2.1宿主菌制备 蛋白胨30g/L 酵母粉10g/L NaC1 10g/L PH=7.0-7.2 120L/500L发酵罐 200 r/min 2.0立方米/小时,4小时后连续流加50%葡萄糖液,每15 min加入20mL共加1L,18-20h得宿主菌发酵液,8000 r/min离心,15min.菌泥用灭菌自来水清洗三次得菌泥,-20--15?冻成干粉520g备用。 2.2 .噬菌蛭弧菌微生态制剂 0.05 g/L冻干粉 20mg/L氯化钙 20mg/L氯化镁 PH=7.0-7.2,100-105?灭7菌 10-15min,蛭弧菌接种量3%,10，,33? 24h。通过转速和通气量维持溶9氧量70%。 蛭弧菌数可达1.3-1.5×10cfu/mL. owned enterprises staff, finance, insurance, education, scientific research-telecommunications, electricity, tobacco and other more efficient State tions,customers, consumer loan customers: with a focus on marketing the Government civil servants, official staff of public instituthis document applies to all branches of the Bank's personal loans (not including personal loans and fund loans). 2.2 target scope 3