DH5a感受态制备
E. coli DH5a热击感受态制备
方法
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一. 1. 于不加抗生素的LA平板上划单克隆;
2. 挑取单克隆于10~15ml LB中活化12h。
二(1. 取活化菌液5ml至250ml LB(1:100~1:50)中摇活约3h(37?，200rpm);
2. 2h后每15min测OD值，至OD=0.5，置于冰上15min，同时预冷离600600
心管、MgCl、CaCl; 22
3. 菌液于4?，6000rpm离心10min(离心机要预冷); 4. 弃上清，50ml冷的0.1M MgCl重悬菌体(原体积的1/5); 2
5. 4?，6000rpm离心10min;
6. 弃上清，125ml冷的0.1M CaCl重悬菌体(原体积的1/2)，于冰上静置2
20min;
7. 4?，6000rpm离心10min;
8. 小心移上清，将菌体用25ml冷的0.1M CaCl重悬(原体积的1/10)，加2
入5ml甘油混匀后每管150ul分装，-80?保存。
需准备的材料(以250mlLB摇菌为例)
0.1M CaCl >150ml 2
过滤后备用 0.1M MgCl >50ml 2
甘油 >2ml
500ml离心管 >2个
10/5ml枪头 >6个
湿热灭菌 150/250三角瓶 >4个
1.5ml离心管 >50个
LB 250ml/1L三角瓶
By JYH By JYH
E. coli DH5a电击感受态制备
1. 划线培养DH5a单菌落，在LA培养基上培养12~20h，挑单菌落至3ml
SOB中，37?培养12h;
2. 取2.5ml菌液加入到250mlSOB中(1:100)，37?摇活3h，待菌液刚变
浑浊后置于冰上30min;
3. 将菌液加入250ml离心管中，4?，8000rpm离心10min; 4. 弃上清，倒置于吸水纸上，加入250ml ddHO重悬菌液，4?，5000rpm2
离心8min;
5. 重复步骤4
6. 弃上清，倒置于吸水纸上，每瓶加250ml 10%甘油重悬，4?，5000rpm
离心8min;
7. 弃上清，倒置吹干，加入3ml 10%甘油重悬;
8. 每管分装66/33ul，-80?保存。
准备灭菌材料:
SOB/LB
dHO 2
10%甘油
500ml离心管
10/5ml枪头 >6个
1.5ml离心管
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