牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较

牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较 牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较 第31卷第4期延边大学农学 2009年12月JournalofAgriculturalScienceYanbianUniversity Vo1.31No.4 Dec.2OO9 牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较 姜成国,林涛.,尹多,李钟淑,方南洙. (1.延边州畜牧总站,吉林延吉133000;2.延边大学农学院,吉林龙井133400) 摘要:分别采用挤压去核法,盲吸去核法和点击去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核操作,在 操作时间,成功率,去核率及重组胚后期发育等方面进行比较.结果表明,去核率上,盲吸法低 于其他2种方法;去核成功率上,挤压法和点压法高于盲吸法;操作耗时上,挤压法和盲吸法耗 时较短;3种方法所构建的重组胚卵裂率以及囊胚发育率均差异不显着.因此,挤压去核法是 一 种较适合延边黄牛卵母细胞去核的有效方法. 关键词:卵母细胞;去核方法;核移植 中图分类号:$823.811.32文献标识码:A文章编号:10O4—7999(2009)04—0238—05 受体卵母细胞的去核对整个体细胞核移植效率来说是非常重要的步骤.各种去核方法 已被广泛应用在体细胞核移植上,好的去核方法可以避免重组胚的非整倍性发育和受体胞 质的遗传干扰等,另外受体卵母细胞去核不完全还可能造成自身孤雌激活[1],影响核移植的 整体效率.因此,核物质的定位和去除是受体卵母细胞去核的最大障碍.去核方法主要有物 理机械性去核法和化学性去核法[2].到目前为止,体细胞核移植中卵母细胞去核的过程主要 还是通过显微操作机械性的去除核染色质来获得受体胞质.这些机械去核法主要包括盲吸 法L3],半卯去核法_4],切割去核法[5],高速离fl,去核法lL6等.机械的去核方法都存在较高的技 术要求,如果方法选择不当或操作不熟练,可能会对受体细胞质的微结构造成严重伤害[7J', 且浪费操作时间;如果卵母细胞在不利的环境下长时间曝露就有可能产生有害的活性物 质[8],进一步影响重组胚的发育[9].为了提高延边黄牛体细胞核移植的整体效率,本试验针 对几种机械去核方法进行研究比较,试图找出一种操作简便,省时,去核准确的适合延边黄 牛卵母细胞去核的最佳方法. 1材料与方法 1.1药品 所用药品FBS购自鼎国生物试剂公司,其它均购自Sigma公司. 1.2卵母细胞的来源及体外成熟 延边黄牛卵巢取自延吉市屠宰场,置于生理盐水保温杯中,4,6h内运至实验室,收集 卵丘卵母细胞复合体(COCs).用冲卵液(95TCM一199?-5%FBS)洗净,放人成熟液(90 TCM一199-4-10FBS一0Fg/mLPMSG)培养小滴中,在38.5?,5CO2,最大饱和湿 收稿日期:2008—12一]0基金项目:国家自然科学基金项目(30860184)振兴东北老工业基地项目(发改高技2004 … 2057);州校合作项目(延大科合字2005—06). 作者简介:姜成唇(1966…).男(朝鲜族),吉林龙井人,延边州畜牧总站高级畜牧师.方南洙为通讯作者. Tel:0.;33,326;639,E—mail:nzfang@ybu.edu.cn 第4期林涛,等:牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较239 度的培养箱中成熟培养. 1.3供核细胞的准备 处理好的延边黄牛耳尖部组织块进行原代培养(培养基为含15FBS的DMEM),待 有细胞游离出来后去掉组织.将成纤维细胞与上皮细胞系进行分离纯化,成纤维细胞进行传 代培养.在注核前进行血清饥饿培养,培养好的成纤维细胞用胰蛋白酶消化,待细胞收缩变 圆时,加入含10oAFBS的DMEM培养液终止消化.将细胞吹打成悬液,吸取沉淀细胞用显 微操作液洗3遍后放人注核操作液中以供注核. 1.4卵母细胞的去核 将成熟培养20~22h的卵丘卵母细胞复合体置于含有0.19/6透明质酸的磷酸缓冲液 (PBS)中,漩涡震荡6,7min,去除卵丘细胞.挑拣形态正常,细胞质均匀且排出第1极体的 卵母细胞用于去核. 1)挤压法就是将排出第1极体的卵母细胞移入到含有5#g/mL细胞松弛素B(CB) 的PBS显微操作液中平衡15min,用操作针将卵母细胞的极体固定在时钟的3点位置,将 去核针调整到极体的正上方,并且针尖压在透明带上,在透明带上切出一个小切口之后用去 核针至上而下轻轻挤压卵母细胞,挤出极体及其附近少量的细胞质E如]. 2)盲吸法卵母细胞固定同上,用斜口去核针刺人透明带,吸除极体及其附近少量的 细胞质,以达到去核的目的. 3)点击去核法参照董雅娟[1的方法,用带尖的去核针在靠近极体一侧的透明带上 做切口,然后用去核针点击卵母细胞透明带一侧,挤出第1极体及其附近的细胞质. 1.5去核率的检测及操作成功评定 1)去核率的检测将部分去核操作后的卵母细胞移人到Hochest33342染色剂中处理 15~20rain后,在荧光显微镜下观察去核情况(图1,其中,A:去核完全的卵母细胞,B:未去 核的卵母细胞). 图1去核操作后的卵母细胞 Fig.1Oocyteafterenucleating 2)操作成功评定每次去核过程中,极体及其周围少量细胞质被成功去除后,细胞膜 及细胞质完好,并且可以用于下一步实验的受体卵母细胞评定为成功.图2为去核成功的卵 母细胞,其中,C:去核后细胞膜破裂,胞质分散,D:点击法去核时.针尖很容易进入透明带 内,刺破细胞膜,E:为透明带切口时,细胞膜被切破,胞质挤出时分散. 240延边大学农学第3l卷 图去核操作不成功的卵母细胞 Fig.2Oocyteofaperatedfaic 1.6卵母细胞核移植 将供核细胞注人到卵母细胞的卵黄周隙中,使其与细胞膜紧密地贴在一起,以便融合. 融合采用电融合方法,即用间隔为1S的1100V/ram,20ffs2次直流电脉冲诱导供核细胞 与去核卵母细胞相融合. 1.7重组胚的激活及体外培养 融合培养1h后重组胚用离子酶素(5m)预激活处理5,7min,用6一DMAP(2ram) 洗3,4遍,放人6一DMAP小滴中激活培养3,5h.激活后用培养液(95CRlaa+5 FBS+0.39,6BSA)洗3,4遍,放入培养液小滴中培养.48h观察卵裂率,每隔48h观 察发育 率.72h时更换培养液(95CRlaa+5%FBS+O.3BSA+0.3g/LGSH),半量换液. 1.8统计分析 数据经SPSS14.0进行统计,方差分析,多重比较检验数据差异性,显着 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 为(P<0.05). 2结果与分析 2.1不同去核方法对延边黄牛卵母细胞去核总体效率的影响 不同的去核方法对延边黄牛卵母细胞去核操作的结果表明,挤压法和盲吸法去核平均 耗时最少,挤压法在操作成功率上最高;去核率方面盲吸法低于挤压和点击去核法(表1). 表1不同去核方法对延边黄牛卵母细胞去核总体效率的影响 Table1Influenceofenucleationoverallefficiencybydifferentmethodsofenucleation forYanbianYellowCattleoocytes(s.%) 2.2不同去核方法对延边黄牛卵母细胞核移植效果影响 由3种去核方法所构建的重组胚在后期发育上的情况可知(表2),虽然挤压法和点击 去核法在卵裂率和囊胚率上较高,但是与盲吸法差异不显着. 第4期林涛,等:牛卵母细胞显微操作机械去核方法的比较241 表2不同去核方法对延边黄牛卵母细胞核移植效果的影响 Table2Influenceofnucleartransplantationbydifferentmethodsofenucleationfor yanbianyellowcattleoocytes 3讨论与结论 选择一种较好的去核方法是提高体细胞核移植效率的前提条件.盲吸法虽然操作简捷, 速度快,但去核率较低,可能是因为在去核过程中参照第1极体为去核标志,但第1极体随 着卵龄的增加与核物质的相对位置发生改变,从而影响去核效果[1,此法去核率低还可能 和用去核针吸取细胞质的范围小有关.另外,采用盲吸法时,去核针直接刺入透明带进入细 胞质,破坏细胞质内的微结构,对重组胚的进一步发育不利.挤压法和点击法有些相似,都是 Willadsen法的衍变法,2种方法在去核率上基本相似,所得到的囊胚率差异不显着,但是挤 压法的操作速度快于点击法.挤压法采用自上而下挤压受体卵母细胞,对细胞造成的伤害较 小,操作耗时短,整体去核效率较高;而点击法在用去核针直接点击透明带时,去核针尖很容 易进入透明带中,造成受体细胞的崩溃,同时也浪费操作时间.后来有人用钝性的针去点击 透明带[1]取得了较好的效果,但操作过程需要换针,耗时长,影响操作速度. 在显微去核操作过程中,受体细胞长时间暴露在可见光下,可以增加活性氧簇(R0S)物 质的产生,细胞氧化以及DNA链的断裂等_1.ROS中的O卜有可能穿过细胞膜进人细胞 质内,破坏核酸和脂类膜的分子结构.小鼠胚胎卵暴露在外界环境如果大于5min足以导致 H.O:增加_1.如果去核操作时间过长,受体细胞在可见光下暴露的时间就越长,这样对重 组胚的发育不利.因此,操作过程中缩短操作时间非常必要.本试验通过对几种去核方法的 比较,综合各方面考虑,挤压法不论在去核率,操作成功率还是去核时间及后期重组胚发育 上都好于其它方法,是一种适合延边黄牛卵母细胞去核操作的实用方法. 参考文献: 1]DominkoT,ChanA,SimerlyC,eta1.DynamicimagingofthemetaphaseIIspindleandmat ernal chromosomesinbovineoocytes:implicationsforenucleationefficiencyverification,avoid anceof parthenogenesis,andsuccessfulembryogenesis[J].Bio1.Reprod,2000,62:15O一154. [2]FulkaJR,RobertM.NoninvasivechemicalenucleationofmouseoocytesEJ].Mo1.Repor dDev, 1993,34:427—430. E3]McGrathJ,Solter,D.Nucleartransplantati0ninmouseembryosbymicrosurgeryandfusi onFJ]. Science,1983,220:1300一l302. L4_ 一 iWilladsonSM.Nucleartransplantati.ninsheepembryos~J].Nature,1986,320:63—65. F5一 sPeuraTT,LewisIM. Theeffectofrecipientoocytevolumeonnucleartransferincatlle[J].Mol ReprodDev,1998,50:185—191. 242延边大学农学第31卷 f-6] [7] [8] YangCH,YanagunachiR,YanagimachiH,eta1.MorphologyandFertilizabilityofZona—freehamster eggsseparatedintohalvesandquartersbycentrifugation[J].BiolReprod,1989,41:74l一752. GreisingT,JonasL.Theinfluenceofenucleationontheultrastructureofinvitromaturedand enucleatedcattleoocytes[J] NakayamaT,NodaY,Goto productionofoxygenradicals [9]王士勇,李钟淑,金庆国,等 2008,3O(3):192一l96. . Theriogen.1ogy,1999,52:303—312. Y,eta1.Effectsofvisiblelightandotherenvironmentalfactorsonthe byhamsterembryos[J-].Theriogenology,1994,41(2):499--510. 共培养对延边黄牛重组胚体外发育的影响[J].延边大学农学, [1O]李井春,方南洙.延边黄牛卵母细胞去核方法的研究[J.中国牛业科 学,2006,32(5):19--22. [11]董雅娟,柏学进,李建栋,等.牛体细胞核移植技术[J].中国兽医,2002,22(4):347— 350. [12]杨月春,李钟淑,王士勇,等.延边黄牛体细胞克隆融合条件的研究[J].延边大学 农学,2009, 31(3):l53—158. [13]杨月春,李钟淑,金一,等.延边黄牛体细胞克隆激活条件的研究[J].延边大学农 学,2008, 30(1):26—3O. [14] [15] [16] [17] RoblJM,SticeSL.Prospectsforthecommercialcloningofanimalsbynucleartransplantatio n [J].Theriogenology,1989,31:75--84. 张德福,刘东,汤琳琳,等.猪卵母细胞去核方法的改进[J].中国兽 医,2006,26(5):574--577. BeehlerBC,PrzybyszewskiJ,BoxHB,eta1..Formationof8一 hydroxydeoxyguanosinewithin DNAofmousekeratinocytesexposedincultureofUVBandH202[J].Carcinogenesis,1992, 13: 2003—2007. GotoY,NodaY,MoriT,eta1.Increasedgenerationofreactiveoxygenspeciesinembryoscul — turedinvitro[J].FreeRadicalBiolMed.1993,15:69—75. Comparisonofmicromanipulationmechanicalenucleation methodsofbovineoocytes JIANGCheng-guo,LINTao.,YINDuo,LIZhong—shu,FANGNan—zhu2* (1.AnimalHusbandryCentralofYanbianState,YanjiJilin133000,Chi口; 2.AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,LongjingJilin,133400,Chi7z口) Abstract..OocytesofYanbianYellowCattlewereenucleatedbymethodsofsqueezingenu— cleation,blindenucleationandpoint— hittingenucleation,thencomparedinoperatingtime,a— chievementrate,enucleationrateandproportionofreconstitutedembryos.Theresults showedthatblindenucleationwaslowerthantheothertwowaysinenucleationrate.High— ersuccessratewereobtainedusingsqueezingenucleationandpoint,hittingenucleation. The shortertime— consumingmethodsweresqueezingenucleationandblindenucleation;thereis nosignificantdifferenceincleavagerateandblastocystrate.Therefore,themethodsof squeezingenucleationwasapracticalenucleationmethodofYanbianYellowCattleoocytes. Keywords:oocyte;methodofenucleation;nucleartransp1antation