顶空固相微萃取-气相色谱-质谱定量分析大豆分离蛋白风味物质

顶空固相微萃取-气相色谱-质谱定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 大豆分离蛋白风味物质 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱定量分析大豆分离蛋 白风味物质 //.paper.edu.cn - 1 - 中国科技论文在线 气相色谱-质谱定量分析大 顶空固相微萃取- 豆分离蛋白风味物质 焦亚培，华欲飞** 作者简介:焦亚培(1988-)女，硕士，粮食油脂与植物蛋白 通信联系人:华欲飞(1962-)，男，教授，粮食油脂与植物蛋白 (江南大学食品学院，无锡 8><#004699'>214122) 5 摘要:用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)对大豆分离蛋白 的挥发性成分进 行研究，选定具代表性的 7 种挥发性物质。分别以纯水和大豆分离蛋白作 为基质，加入内标 物对 7 种特定风味物质的萃取条件进行了优化，建立了相关的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线，最后应用于商用大 豆分离的挥发性风味物质的定量。实验结果表明:测定大豆分离蛋白挥发性成分的最佳分析10 条件为，萃取头类型为 DVB/CAR/PDMS-50/30μm;蛋白浓度 3% (m/v);萃取温度 50 ?; 萃取时间 30 min;搅拌速度 750 r/min;标准曲线的 R2 介于 0.9502 和 0.9991 之间，斜率范 围介于 0.0391 和 3.6366 之间，不同基质条件下，标准曲线的斜率会发生变化;不同商用大 豆分离蛋白中挥发性物质含量有较大的差别，风味品质有明显差异。 关键词:食品加工技术;固相微萃取-气相色谱-质谱;大豆分离蛋白;风味成分;定量分析 15 中图分类号:S 农业科学 Quantification of the Selected Odorant Volatile Compounds in Soy Protein Isolates using HS-SPME-GC-MS JIAO Yapei 1 , HUA Yufei 2 20 (1. Food School, Jiangnan University,Wuxi <#004699'>214122; 2. Food School,Jiangnan University, Wuxi <#004699'>214122) Abstract: A headspace solid-phase micro-extraction gas -mass spectrometer chromatography (HS??SPME??GC??MS) methodology for the quantification of 7 typical off-flavor components in soy protein isolates (SPI) was developed. Factors which influencing HS??SPME such as: fiber 25 coating, extraction time and temperature, stirring rate, protein concentration were studied. The optimized results were obtained under following conditions: 50/30μm DVB/PDMS/CAR fiber, 30 min extraction time at 50?. Standard curves were established for 7 compounds both in aqueous solution and soy protein solution: R2 were between 0.9502 and 0.9991, slopes were between 0.0391 and 3.6366, Finally, contents of the selected volatile compounds in several 30 commercial soy protein isolates were determined. Key words: soy protein isolates; off-flavor; HS-SPME-GC-MS; volatile compounds; quantitative analysis 0 引言 35 大豆分离蛋白(soybean protein isolates，SPI)是一种重要的植物蛋白产 品，与动物蛋白相 比，其氨基酸评分(PDCASS)较高[1]。大豆分离蛋白的蛋白含量可达 90, 以上[2]，消化利 用率可达 93,,97,。大豆分离蛋白被广泛用在各个领域，例如肉制品， 烘焙制品，乳制 品和其他功能性食品等。但是，大豆蛋白异味成分的存在是制约其更广泛应 用的重要因素 [3-5]。大豆蛋白异味成分可能是由于脂肪氧合酶催化多不饱和脂肪酸氧化而产生的副产物[6]。40 Lei 和 Boatright[7]报道，大豆蛋白的主要异味成分有己醛，2-庚酮，辛醛，2-壬酮，1-辛烯-3- 酮，3-辛烯-2-酮，苯甲醛，2-戊基吡啶等，另外 Yuan[8]选择己醛，2-戊基呋喃，1-辛烯-3- 酮，己醇，1-辛烯-3-醇，壬烯醛，反,反-2,4-癸二烯醛作为豆浆的特征异味成分研究其在加 //.paper.edu.cn - 2 - 中国科技论文在线 热工艺中含量变化。 在食品体系中，风味物质的收集方式对测定结果非常重要。常见的方法有静态顶空[8-10]，45 动态顶空[11,12]，固相微萃取[11-14]和溶剂萃取[15]等方法。固相微萃取与其他方法相比有独特的 优势，如灵敏度高，操作简单化，选择性高，无溶剂影响[16,17]等，广泛使用于挥发性物质的 分析。Ducki[18]用顶空固相微萃取方法定量 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 了可可制品中的挥发性物质，并做了相关条 件的优化。本文中首先对市售的不同种类的大豆分离蛋白存在的共同的特征异味成分进行了 研究，选定代表性的 7 种物质，用 2-甲基-3-庚酮作为内标物，确定其最适合的萃取条件，50 建立相关标准曲线，进行了定量分析，并对大豆分离蛋白的风味进行了初步 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和方法 1.1 材料 标准物:己醛(hexanal) , 2-戊基呋喃(2-pentyl furan)，1-辛烯-3-酮(1-octen-3-one)，己醇 (1-hexanol)， 1-辛烯 3-醇 (1-octen-3-ol)，苯甲醛 (benzaldehyde)，反 ,反 -2,4-癸二烯醛55 ((E,E)-2,4-decadienal)，2-甲基-3-庚酮(2-methyl-3-heptone)，均购自西格玛-奥德里奇公司，纯 度均高于 98%;甲醇，水(色谱级);NaCl (分析级)。风味物质含量极低的大豆分离蛋白(实 验室制备)。商用大豆分离蛋白 6 种，分别购自杜邦郑州蛋白有限公司(Supro 760)，不 二富吉科技有限公司(SPI 1700), 谷神科技有限公司(SPI 6000) , 哈尔滨 高科技股份有限公司 (SPI D), 南通光合生物科技有限公司 (SPI 690) , 山东万德福实业有限公司 (WDFPRO 60 950F)。编号分别为 SPI.1-6。均在 4 ?密封保存。 1.2 HS-SPME 固相微萃取所用萃取头(PDMS-100μm, CAR/PDMS-75μm, DVB/CAR/PDMS-50/30μm, PA-80μm)和萃取装置均购自 Supelco。首次使用前，萃取头于 250 ?老化 1 h。萃取温度选 择范围为 30-70 ?，萃取时间范围 10-60 min，搅拌速度范围 0-1500 r/min，蛋白浓度为 0-3%65 (m/v)。 1.3 GC-MS 美国 Agilent 公司 7890A 气相色谱仪及 Agilent 5975C MSD 检测器 , 30m×0.25 mm×0.25μm DB-5MS 色谱柱;升温程序:起始温度 40 ?，保持 3 min;以 6 ?,min 上升 至 120 ?;再以 10 ?,min 上升至 220 ?;进样口温度 250 ?;载气:He;氦气流速 1.5 mL70 ,min;不分流方式。质谱条件:离子源 EI 源，离子源温度 200 ?，接口温度 250 ?，电子 能量为 70 eV，扫描范围 m,z 为 50.0,500.0，采集方式 Scan。 1.4 标准曲线的建立 7 种标准物和内标物分别配制为 500 mg1-1 的储备液，溶剂为甲醇。实验中将取 7 种标 准液混合并逐步稀释至所需浓度，后加入内标，保持内标浓度为 0.5mg1-1。分别用纯水和大75 豆分离蛋白作为基质，建立标准曲线，横坐标为标准物质浓度，纵坐标为此物质峰面积与内 标峰面积之商(Ac/Ais)。 1.5 样品处理 取商用大豆分离蛋白，配制为浓度为 3%(m/v)。HS-SPME-GC-MS 条件为优化后的 条件。每个样品重复测定 3 次。 80 //.paper.edu.cn - 3 - 中国科技论文在线 1.6 数据处理 样品中各未知挥发性成分的定性由计算机检索与 NIST08 标准质谱库匹配求得，统计匹 配度均大于 800 左右的挥发性成分;挥发性成分定量分析采用峰面积归一化法。 2 结果与讨论 2.1 大豆分离蛋白中挥发性物质的鉴定 85 分别测定 6 种商用分离蛋白在蛋白浓度 3%(m/v)时的挥发性成分。实验使用 50/30 μm DVB/PDMS/CAR 萃取头，30 ?下萃取 30 min。发现 26 种物质为其共有的典型的风味物质， 包括醛类，酮类，醇类，呋喃类等，图 1 为 SPI1 大豆分离蛋白的离子图谱。选定其中具有 代表性的 7 种物质，如图编号，它们的峰面积较大，且具有独特的风味特征，可用以进行定 量分析。 90 图 1 大豆分离蛋白挥发性成分总离子流色谱图 注: Hexanal, 2-pentyl furan, 1-octen-3-one, 1-hexanol, 1-octen-3-ol, benzaldehyde, (E,E)-2,4-decadienal 分别对95 1-7 应编号 2.2 大豆分离蛋白中挥发性物质的鉴定 2.2.1 固相微萃取头的选择 根据萃取头的灵敏度和选择性，对 4 种萃取头 (PDMS-100μm， PA-85μm， PDMS/CAR-75μm， DVB/PDMS/CAR-50/30μm)进行了优化。图 2 显示的为 3%(m/v)SPI1，100 50 ?萃取 30 min 时各物质所对应的响应值(峰面积)。可以看出，DVB/PDMS/CAR-50/30 μm 的效果最好。75μm PDMS/CAR 萃取头对于苯甲醛响应值较高，而对反,反-2,4-癸二烯醛 响应值不高。Achouri[13]发现相对于 CWAX/DVB 和 PDMS/DVB ，CAR/PDMS 萃取头更适 合用于豆浆中风味物质的鉴定。另外，CAR/PDMS 适用于低分子量的化合物，而 PDMS/DVB 更适用于较高分子量的化合物，而 DVB/PDMS/CAR 包含有 3 种涂层，更适用于我们所选择105 的 7 种分子量差异较大的物质。 //.paper.edu.cn - 4 - 中国科技论文在线 0.00E+00 5.00E+05 1.00E+06 1.50E+06 2.00E+06 2.50E+06 3.00E+06 3.50E+06 4.00E+06 he xa na l IS 2- pe nt yl fu ra n 1- oc te n- 3- on e 1- he xa no l 1- oc te n- 3- ol be nz al de hy de (E ,E )- 2, 4- de ca di en al 峰 面 积 ( Ac ) 100μmPDMS 85μmPA 75μmPDMS/CAR 50/30μmDVB/PDMS/CAR 图 2 不同萃取头的萃取效果 2.2.2 蛋白浓度的选择 从图 3 可以看出， 在有蛋白存在的情况下(即使是 0.5%的蛋白浓度)，2-pentyl furan, 110 1-octen-3-ol 和 (E,E)-2,4-decadienal 的 Ac/Ais (该挥发物峰面积与内标物峰面积之比)急 剧减小，而其他 4 种物质的 Ac/Ais 的下降趋势没有很明显且多在 1%的浓度时达到平衡。这 -pentyl furan, 1-octen-3-ol 和 (E,E)-2,4-decadienal 这 可能由于)，2 3 种物质和蛋白之间的结 合作用比其他 4种物质明显。考虑到大豆蛋白在水中的溶解度和分散性有限及GC的检测限， 选择 3%的蛋白浓度用于之后的分析。 115 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 1 2 3 4 5 6 蛋白浓度(m/v)% 响 应 值 比 值 ( Ac /A is ) hexanal 2-pentyl furan 1-octen-3-one 1-hexanol 1-octen-3-ol benzaldehyde (E,E)-2,4- decadienal 图 3 不同蛋白浓度对萃取效果的影响 2.2.3 萃取时间的选择 由于不同物质的挥发性强弱及对萃取涂层的亲和能力不同，萃取时间对纤维涂层的挥发 性物质吸附量影响较大。从理论上来说，在一个无限长的时间内，萃取头上吸附量最终会达120 -pentyl 到平衡。从图 4 可以看出，在最初的 20 min 时 hexanal 和 2furan 的 Ac/Ais 急剧减 小，而 1-octen-ol 和 (E,E)-2,4-decadienal 却有显著的增加。而在 30 min 后，几乎所有的物 质的 Ac/Ais 值达到平衡，所以 30 min 是一个较适合的时间。 //.paper.edu.cn - 5 - 中国科技论文在线 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 10 20 30 40 50 60 响 应 值 比 值 ( Ac /A is ) hexanal 2-pentyl furan 1-octen-3-one 1-hexanol 1-octen-3-ol benzaldehyde (E,E)-2,4- decadienal 时间(min) 图 4 萃取时间对萃取效果的影响 125 2.2.4 萃取温度的选择 5 可 以 看 ， 2-pentyl furan, 1-octen-3-one, 1-octen-3-ol, 从 图 benzaldehyde 和 (E,E)-2,4-decadienal 的 Ac/Ais 值对温度变化较敏感。在 60?甚至更高的温度下 (E,E)-2,4-decadienal 的 Ac/Ais 值仍有急剧的增加。但温度的升高会使 2-pentyl furan 的 Ac/Ais 值减小，过高的温度同样会使蛋白性质发生改变，故选择 50?作为萃取温度。 130 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 20 30 40 50 60 70 80 响 应 值 比 值 ( A c /A is ) hexanal -pentyl furan 2 1-octen-3-one 1-hexanol 1-octen-3-ol benzaldehyde (E,E)-2,4-decadienal 温度(?) 图 5 萃取温度对萃取效果的影响 2.2.5 搅拌速度的选择 选择 0-1500r/min 的搅拌速度考察对 HS-SPME 过程的影响。图 6 可以看出，搅拌速度 对 Ac/Ais 值的影响并不明显。这可能是由于搅拌速度增加时，Ac 和 Ais 都有所增加，而135 Ac/Ais 值变化不大。这说明在用内标法时，挥发性成分从液相扩散至气相的快慢并未对结 果造成很大影响。最终我们选择 750 r/min 的搅拌速度。 //.paper.edu.cn - 6 - 中国科技论文在线 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 搅拌速度(r/min) 响 应 值 比 值 ( Ac /A is ) hexanal 2-pentyl furan 1-octen-3-one 1-hexanol 1-octen-3-ol benzaldehyde (E,E)-2,4- decadienal 图 6 搅拌速度对萃取效果的影响 2.3 标准曲线的建立 140 混合标准溶液中，除 1-hexanol 外每种检测物的浓度是相同的， 1-hexanol 在 4 倍于其 他物质的浓度下，才能达到检测限和定量限，故提高至其它检测物浓度的 4 倍。另外，随机 改变每种检测物的浓度，建立一组标准曲线。7 种物质的标准曲线如表 1 所示。 表 1 标准曲线的各项参数 145 注:a 为截距, b 为斜率，R2 为线性回归系数。 Aq. Sol.为纯水溶液中加入 7 种检测物; Pro 3 %为 3 % (m/v) 的大豆分离蛋白溶液 比 较 纯 水 及 蛋 白 溶 液 中 的 标 准 曲 线 ， 2-pentyl-furan, 1-octen-3-one 及 (E,E)-2,4-decadienal 的斜率出现显著降低，其它物质的斜率变化不太显著。这可能是由于不 同物质结构及性质不同，与大豆蛋白之间的结合作用不同。斜率降低显著的物质与蛋白之间150 作用似乎更强一些。R2 Compound Range of concentrations (mg1-1) a b R 2 Aq. Sol. Pro 3% Aq. Sol. Pro 3% Aq. Sol. Pro 3% hexanal 0.05-2.00 +0.0105 +0.0209 0.3406 0.3428 0.9930 0.9979 2-pentyl furan 0.05-2.00 -0.0153 -0.0114 2.7266 1.4961 0.9985 0.9947 1-octen-3-one 0.05-1.00 -0.0044 -0.0023 1.8218 0.0391 0.9930 0.9894 1-hexanol 0.20-4.00 -0.0045 -0.0042 0.1191 0.1271 0.9502 0.9880 1-octen-3-ol 0.05-2.00 -0.0027 +0.0043 0.8721 0.8510 0.9991 0.9986 benzaldehyde 0.05-2.00 -0.0055 -0.0091 0.6881 0.5653 0.9983 0.9941 (E,E)-2,4-dec- -adienal 0.05-1.00 -0.0064 -0.0109 3.6366 0.8621 0.9864 0.9928 //.paper.edu.cn - 7 - 中国科技论文在线 2.4 商用大豆分离蛋白中挥发性物质测定 在相同的检测条件下:50/30μm DVB/PDMS/CAR 的萃取纤维涂层，50?下萃 取 30min， 搅拌速度为 750 r/min，蛋白浓度为 3% (m/v)。250?下解吸 5min。样品 为 SPI.1-SPI.6。结合 表 1 标准曲线，得出 6 种商用大豆分离蛋白中 7 种检测物的含量如表 2 所示: 155 表 2 商用大豆分离蛋白中的挥发性物质含量 compound sample(mg1-1) SPI.1 SPI.2 SPI.3 SPI.4 SPI.5 SPI.6 hexanal 0.54a 0.35c 0.15f 0.19e 0.30d 0.39b 2-pentyl furan 0.10b 0.11b 0.09 0.09c 0.08e 0.13a 1-octen-3-one 0.07c 0.07b 0.08a 0.06d 0.05f 0.06e 1-hexanol 0.06d 0.05e 0.06d 0.07c 0.07b 0.10a 1-octen-3-ol 0.10b 0.08e 0.10c 0.09d 0.10 0.14a benzaldehyde 0.10c 0.100b 0.07d 0.05e 0.05f 0.10a (E,E) -2,4-decadienal 0.13a 0.12b 0.12b 0.12b 0.11c 0.11c 注:平行测定 3 次，a,b,c,d,e,f 代表每一行中数值的显著性差异(p < 0.05) 所选 7 种挥发性物质的测定值如表 2 所示。可以看到，在所有商用大豆分 离蛋白中，己 醛是主要的异味成分之一。比较 6 种蛋白中相关物质含量， SPI.1 和 SPI.6 中的己醛和 1-octen-3-ol 含量较高。己醛具有典型的豆腥味和青草味道，阈值大概为 4.5 ppb。Ang[19]用160 静态顶空方法测定出商用大豆分离蛋白中 hexanal 的含量为 content 0.9 ppm，而 2-pentyl furan 含量为 11.4 ppb。Ang[19] 和 Boatright[8] 都发现己醛对 SPI 的 整体风味贡献程度较大。 2-Pentyl furan 是由于单线态氧分子作用于亚油酸，发生特定的氧化反应而产生的。它具有 豆香或青香味，Belitz[20] 报道 2-Pentyl furan 在油中的阈值大概为 2 ppm。1-Octen-3-one 有 蘑菇味或鱼腥味，阈值极低，为 0.05 ppb[21]。 1-Hexanol 也是由脂肪氧合酶参与产生的氧165 化产物，可作为豆制品中挥发性物质产生的一个较好指标。与其它物质相比，1-hexanol 由 于较高的阈值(2.5 ppm) [22]，对大豆制品的豆腥味贡献程度并不大。 1-Octen-3-ol 也具有类 似蘑菇的风味，阈值低至 0.005 ppb。 Lee[23]发现在大豆粉中，见光保存条件下比避光保存 条件下1-octen-3-ol含量显著增加(从 60% 至300%) 。苯甲醛具有杏仁风味，阈值为350 ppb。 (E,E)-2,4-decadienal 具有强烈的油味，在水中阈值为 180 ppb，油中为 0.07 ppb，随加热时间170 增加，(E,E)-2,4-decadienal 的含量也会增高。结合各风味物质阈值，风味特征及检测到风味 物质的含量，可推测 SPI.1 的风味品质较差。 3 结论 挥发性物质的定量有助于我们更全面地认识大豆分离蛋白的风味。本文采用 HS-SPME-GC-MS 的方法，选择大豆分离蛋白中具有代表性的 7 种风味物质，在优化了固相175 种商微萃取的条件后，建立相关的标准曲线，并测定了市场上较常见的 6 用大豆分离蛋白中 相关挥发性物质的含量，结合其阈值，对风味品质品质有了初步的评价。 [参考文献] (References) //.paper.edu.cn - 8 - 中国科技论文在线 [1] Hughes, G. 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