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TSS方法制备感受态细胞

TSS方法制备感受态细胞TSS方法（又称一步法）制备感受态细菌程序一、准备工作 1、配置1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁（一般含6个水分子）或硫酸镁（二者效果一样）母液，不用灭菌，用时根据需要取出滤膜过滤除菌，4℃保存氯化镁用量（g） 2.0 4.1 10.2 20.3 体积（ml） 10 20 50 100 2、配制1×TSS溶液（20ml） tryptone(1%) 0.2g Yeast extract(0.5%) 0.1g NaCl(1%) ...

TSS方法（又称一步法）制备感受态细菌程序一、准备工作 1、配置1M 氯化镁或硫酸镁氯化镁（一般含6个水分子）或硫酸镁（二者效果一样）母液，不用灭菌，用时根据需要取出滤膜过滤除菌，4℃保存氯化镁用量（g） 2.0 4.1 10.2 20.3 体积（ml） 10 20 50 100 2、配制1×TSS溶液（20ml） tryptone(1%) 0.2g Yeast extract(0.5%) 0.1g NaCl(1%) 0.2g PEG(MW= 3350-8000) (10%) 2g DMSO（5%） 1ml MgCl2(20-50mM) 1M MgCl2 400ul-1ml，或0.081~0.203 g六水氯化镁加14ml水（最好是超纯水）溶于三角瓶或烧杯中，搅拌使溶解，用量筒定容至20ml，用稀盐酸或氢氧化钠调ph至6.5(6.4-6.8均可)，过滤除菌（0.22或0.45um滤膜），4℃保存备用（可保存6月左右）。注：如配制2×TSS溶液，试剂加倍即可，其它操作不变。 3、准备器具注射器，过滤器及滤膜——自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，保证器具不含干扰物质，然后装至一干净烧杯（去离子水冲洗过）中高温高压灭菌，注射器可不灭试剂瓶，1个，自来水洗净，去离子水冲洗数次，最后用超纯水浸泡并洗数次，灭菌，用于过滤除菌时接收过滤液 50ml管子（管底注意圆或尖，4℃离心时与配备的冷冻离心机转头相配）2个（可多准备几个），自来水洗净，去离子水冲洗数次，用超纯水涮洗一次，然后装2/3管超纯水高温高压灭菌，用时把水倒掉0 1.5ml离心管（新开包装的，保证干净），200个（用来分装感受态），用干净的铝盒装好，铝盒外用报纸包住，橡皮条扎紧，灭菌，用前20小时整个置于-20℃冰箱预冷。镊子1个，灭菌干净，锡箔纸包好灭菌，用来夹取1.5ml离心管。液氮或预冷到-70℃的工业酒精（提前20h用500ml玻璃瓶装好置于-70℃冰箱中预冷），用于后面速冻分装好的感受态细胞不含抗生素的平板数个，含抗生素的平板数个 250ml三角瓶（棉塞或锡箔纸封住）3-4个，全部自来水洗净，去离子水冲洗数次，一个装10-30mlLB，另一个装50ml，灭菌，用来培养细菌灭菌一次性吸头，全部新鲜灭菌，且用前未开过吸头盒盖 4℃离心机（最好能装50ml离心管），超净工作台，酒精灯等二、制作感受态 1、划线平板取-20℃或-70℃保存甘油菌划线于无抗生素平板，不要用4℃或常温保存菌，过夜培养（12-18h） 2、扩大培养和培养指数初期细胞挑单菌落至10-30 m lLB（三角瓶或50ml管）中过夜培养（12-16h）。分别按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到两个盛有50 ml新鲜LB培养液的三角瓶（容积250ml）中，于37 ℃振荡（225rpm）培养至OD600约为0.3-0.4（前指数期）(培养时间2h-2.5h)，培养超过这个值也没有关系，只是效率略有下降。注意测OD值用LB作空白。 3、离心沉淀，1×TSS溶液重悬细胞，分装保存各转移至1个50ml洁净离心管（若有盛不下的培养液可丢弃）中，冰浴15-30分钟使培养物降至0℃，4℃、1000g（离心力大些也无妨）离心10min，弃上清，收获细菌。加入离心前菌液体积1/10（这里为5 ml）的1× TSS 液(冰预冷30min)悬浮细胞，冰上继续放置5-15min，此时感受态细胞即制成。（继续放冰上6h之内效力不会降低。）然后按100 ul/份分装至预冷的1.5离心管中，盖紧，此时即可用于转化，其余暂时不用者立即扔进液氮（盛于保温杯，没有液氮可用-70℃的工业酒精）中速冻（不用液氮直接放入-70℃也可以）。装好，标好菌种、制作日期、制作人，－70℃保存，可以保存1年。（不用额外添加甘油，多此一举）附：2×TSS等体积混合法——更简捷，但效果远差于上面的方法冰预冷2×TSS等体积混合培养至OD600约为0.3-0.4的菌液（菌液冰上预冷30min），轻轻混匀，冰上继续放置10min，即可用于转化，冰上分装为100 ul/份，其余方法一样，储存及转化也相同。三、转化取一管（100 ul）感受态细菌，置于冰上缓慢融化，加入3-5ul 质粒DNA（0.01～100ng纯质粒，不能超过菌液体积的5%，浓度过高会抑制转化）或全部连接产物，轻轻混匀。冰浴30min（5min即可用，但要达到最佳需30min，以后增加时间对转化效率也无多大影响）。（可选步骤：42℃热激90s，然后冰浴2min，但这种热激处理有没有用尚未知，原文献结果显示热激效率小于不热激的）加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖（单独配置母液0.2M，灭菌，按1/10体积加入，提高菌代谢效率，没有也可以）的LB培养液(或TSS液)，37度150rpm温和振荡（225rpm快速振荡也可以）培养60min，使表达抗抗生素基因。涂布，室温放置约20min-1h晾干后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。检查转化效率。注： 1、试剂必须是分析纯以上纯度，且尽可能新鲜 2、制作感受态和转化必须冰上操作，且必须保证避免感染杂菌，因此一些步骤必须超净工作台酒精灯下操作，移液器和台面必须用酒精擦拭，并且紫外线灭菌，遵守无菌操作规则。 3、检测转化效率时用稀释到1-10ng/ul的纯质粒3-5nl，同时设置阴性对照，即不加DNA，其余同，涂于相同抗生素平板 4、转化效率与DNA浓度有很大关系，当浓度太浓时转化效率急速下降，所以DNA浓度不宜太浓，最多不要超过1ug，一般0.1～100ng即可。 5、本法适用于多种常用菌的转化，如DH1 、DH5a 、HB101 、JM109、LE392 、MM294、RR1 、SCS-1、XL-1等。参考文献本文在参考网络程序和原文文献基础上完成，并经过自己多次实验验证原文文献：One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution，Proc. Natl. Acad. Sci. USA ，Vol. 86, pp. 2172-2175, Apri1989

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