海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌DA5对细菌的生物控制

海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌DA5对细菌的生物控制 海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌DA5对细 菌的生物控制 中山大学 博士学位论文 海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌DA5对细菌的生物 控制 姓名:温崇庆 申请学位级别:博士 专业:海洋生物学 指导教师:周世宁 20090529温崇庆 中山大学届博士学位论文 海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性 及噬菌弧茵对细菌的生物控制 专业:海洋生物学 博士生:温崇庆 指导教师:周世宁教授 摘要 蛭弧菌类生物?. ,,是一类以裂解其 它革兰氏阴性菌为生的小型寄生性细菌,普遍存在于自然和人工生境中,对 环境 细菌的群体结构和动力学可能具有重要影响,在有害细菌的生物控制上具有潜在 应用价值。 本论文首先通过分离培养结合分子分型和系统鉴定,对广东省湛江市海水养 殖较集中的东海岛和南三岛虾池及其近岸海水进行了较系统调查。结果 显示以溶藻弧菌 为宿主菌,双层平板计数虾池及 其近岸表层海水含量为. /,且含量与异养细菌含量 呈正相关。本研究首次将一变性梯度凝胶电泳,用于二元培养状态下的直接分型,并通过靶向 扩增 区.和噬菌弧菌科特异的,认将株 核糖体限制性分析 分离物分别区分为五种和四种种系型。系统分析表明本研究所 有分离物均属于噬菌弧菌科噬菌弧菌属,但包含在四个不 同的类群、、、,且两种分型方法给出的结果在类群水平上 完全一致。类群?菌株在所有水样中都有分离到,并且是株分离物中的最 优势类型.%;类群菌株除在虾池样品中未检测到外,也普遍存在于 各水样中;类群?菌株则从所有盐度相对较低‰的水样中被优势分离;而 类群?的两个分离物仅从一个赫度最低.%的虾池中获得。中山大学届博士学位论文 温崇庆 对上述四个类群株代表性菌株的生长温度和盐度以及对六种常见 对虾病原弧菌的裂解能力进行了研究,并通过透射电子显微镜分析了其中四 个代 表菌株的形态特征。结果表明,同一类群或亚群内菌株的生长温度或盐度范 围相 .、 同,即类群?、、丈、菌株的生长温度范围分别为.?、 ?。、?.。,最适生长温度都约为或?;生长盐度范围分别 为‰一%、.%./、%.‰和%.%,最适生长盐度分别约为%、 %、%和%。被测的六种弧菌中有三种可被全部株裂解,而其 它弧菌仅被部分裂解,但即使同一类群菌株,对某些弧菌也表现不同的 裂解能力。形态上,四株不同类群均呈典型的弧状细胞,具极生单鞭毛。 首次通过不依赖培养的分子生态学技术对海水养殖环境多样性进行 了研究。采用特异 基因引物分别构建了湛江市邻近东海堤四个虾池表 基因文库,并结合 层水样噬菌弧菌和吞菌弧菌 分型和测序,分析了两大类型的系统发育。结果表明海水虾池中普遍存 在高度多样的噬菌弧菌和吞菌弧菌。以 基因序列相似性%作为界定 类群或潜在“种”的标准,本研究四个噬菌弧菌总文库共包括个类群, 其中个为首次报道的新类群;仅有四个类群、、、属于已知可培 养噬菌弧菌类群,但它们的克隆数则占总文库的一半,且类群?和克隆分别 为最优势占.%和第二优势占.%类群。除了一个含有可培养吞菌弧菌的 类群..,本研究吞菌弧菌总文库个类群中的个为首次报道 的新类群。系统分析显示噬菌弧菌和吞菌弧菌彼此互为最紧邻的分支,并作 为一 个整体与蛭弧菌科亲缘关系最近,而与.变形细菌 中其它科相距较远,但两者间的序列差异也大于%。同一水 样噬菌弧菌和吞菌弧菌间种群多样性可能表现一定程度的竞争或排斥,但四 个水 样间总的多样性大小较一致。 为了解海洋对海水养殖环境细菌的生物控制效果及其影响因素,选 择噬菌弧菌菌株为代表分别研究了对海水中单一宿主菌的裂解 作用,对添加营养的自然海水中细菌含量和几种水体理化指标的影响,以及 幼体的试验性治疗效果。结果表 对感染凡纳滨对虾 明,对海水中的最适裂解温度和盐度范围分别为?.?和 中山大学届博士学位论文 温崇庆 %.%,提高通气或初始感染复数有利于快速裂解。适宜条件下, 内可降低海水中含量两个数量级,但较长时间 在较短时间 也不能完全清除宿主细胞;对自然海水中异养细菌和弧菌均有一定的清除 作用,且对弧菌的消减效果更明显,但对水体、化学需氧量、氨氮 和亚硝酸氮一?含量均无显著影响;以不同浓度攻击期细胞处理时,较 高含量的可减少或显著减少对虾幼体感染的死亡率。 为评估在无明显病害出现情况下对对虾育苗水体细菌群落结构的影响 和对细菌性病害可能的预防作用,研究了以两种不同浓度初始水体含量 和 舢,加入凡纳滨对虾育苗水体后,对潘状幼体期间水体细菌含量 和种群结构的影响,对幼体存活率的影响以及对水体理化指标的影响。平板 计数 对育苗水体异养细菌和弧菌含量均具有较 结果显示高浓度较短时间勺 明显消减作用,但分析表明本研究条件下对水体优势细菌种群结构 影响不明显,可能仅对极少数非优势细菌种群结构具有调控作用;高含量 一定程度上具有促进幼体存活的作用,而低浓度则无明显作用。试验期间 处理组和对照组间水体、、溶解氧、和含量均无显 著差异。 本研究最后采用经典培养法结合基础的分子检测,首次系统报道了商 品化制剂的质量。结果表明被检测的八个水产养殖用制剂中有 六个质量明显不合格,仅两个样品被蛭弧菌科特异引物检测为阳性,被双层 平板 证实有噬斑出现。其中一个样品中存在两种形态和宿主范围不同的噬斑分离 物, 且不同宿主菌计数结果存在明显差异。 基因序列分析表明这两种噬斑 分离物分别属于蛭弧菌科类群即噬菌蛭弧菌慨和未定种的类群 。但另一样品的噬斑分离物则被证实为非。 关键词:蛭弧菌类生物,多样性,海水养殖环境,细菌,生物控制 中山大学届博士学位论文 温崇庆 :: :.?? ?,? .., ,, .,? / , .? . . ,. .,,,,均温崇庆 中山大学届博士学位论文 .,.%. .%. , .%.. ., ?一?,??,??,??,. , %?%,.%%, %?% %?%, %,%,% %,. , .. . ? . .. ? %. , “”温崇庆 中山大学届博士学位论文, 、、、 . . . .? .?, 。 . .. “”. , %. ,, . , .,? .。.? %?% , ., .., . , , ? . 中山大学届博士学位论文 温崇庆 , , / .. ? , .,.,, ? .. , ? , ., . ,?.. . :? , , 温崇庆 中山大学届博士学位论文 缩略词 氨苄青霉素 扩增核糖体限制性分析 噬菌弧菌特异的 ? 蛭弧菌类生物 噬菌蛭弧菌 蛭弧菌科特异的 碱基对覆盖度菌落形成单位化学需氧量 十六烷基三甲基溴化铵 天蒸馏水 双蒸水 变性梯度凝胶电泳 稀释营养肉汤 田 脱氧核糖核苷三磷酸 溶解氧 乙二胺四乙酸 荧光原位杂交 疆淡水的或陆生的 克 ? 革兰氏阴性小时 多样性指数 宿主依赖型 . 非宿主依赖型?? 异丙基硫代一..半乳糖苷千碱基对分钟 / 海洋的或嗜盐的 温崇庆 中山大学届博士学位论文毫升 感染复数 营养肉汤 氨氮 未测定 亚硝酸氮光密度 操作分类单元 聚合酶链反应 盯 吞菌弧菌属特异的 龟噬斑形成单位 /辕会铵秒十二烷基硫酸钠 / /乙酸电泳缓冲液./ 盐酸厄. 透射电子显微镜 ,’,’ ,,’,。.四甲基二乙胺 三.羟甲基氧基甲烷微克 “ 微升基因区 一一??? .溴.氯.吲哚..半乳糖苷 琼脂培养基 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:诬袭屯 日期:年月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版,有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅,有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索,可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名:动亟经东。 导师签名: 日期: 年月日中山大学届博士学位论文 温崇庆 第一章前言 本章综述了蛭弧菌类生物.. ,的研究进展。 . 的发现和概念 捕食和被捕食是生物间最常见的相互作用方式之一,也是影响群体结构和驱 动生命进化及多样性的主要生态力量。在原核生物之间也普遍存在捕食行为, 即 一种生物能以被捕食细胞为唯一营养源进行生长,包括专性和兼性捕食方 式。具 体的捕食策略上可分为体表型、狼群型、周质型 ; ; 和胞质型, 等方式 。其中研究最多的是周质型专性捕食性的,这 类小型细菌通过直接侵入并定居在其它敏感细菌的周质空间中,以其细胞成 分为 营养进行生长发育,最后裂解宿主细胞得以增殖。 在 是在研究噬菌体时被偶然发现的。年等 德国柏林用双层平板法分离丁香假单胞菌 噬菌体时,因缺 少.岬孔径的细菌滤器,而用孔径.岬玻璃烧结滤器过滤土壤悬液。第二天 观察时,双层平板上并没有出现通常 内肉眼可见的噬菌体噬斑,但 两天后再观察时,他们发现平板上出现了噬斑。在进一步检查这种噬斑推迟出现 的原因时,他们首先发现了这种能以裂解其它细菌丁香假单胞菌为生的独特细 菌且。一年后在美国加利福尼亚州,等系统研究了这类细菌的 分离方法、形态特征、裂解宿主菌特点、捕食动力和非宿主依赖型突变株等,并 将当时所有已知菌株都归为一个新属一蛭弧菌属及其唯一的种一 。“”源自 噬菌蛭弧菌 ,中,模式菌株为 希腊语,意为水蛭,表示这类细菌侵染宿主细胞时的方式与水蛭吸血时相似, ‘”则表示它们的细胞形态呈弧状的,‘”即吃细菌的意思。最初 等认为蛭弧菌是通过胞外接触方式裂解宿主菌的外寄生物 ,等后来通过电镜等实验证实蛭弧菌是完全侵入宿主菌细 胞的内寄生物。 此后,许多研究者陆续从不同环境中分离并研究了这类捕食性细菌,并多以温崇庆 中山大学届博士学位论文 “蛭弧菌”这个属名来称呼它们。英文文献中,等最早以 ‘. /”描述非宿主依赖型.,.蛭弧菌 菌株在宿主菌液中培养时,也表现像宿主依赖型.,?菌株样的细 ”表示具有与蛭弧菌相 胞形态。等最早以‘? 似寄生性和形态的生物。但此后很少有人使用以上两个名词。直到最近几年, 的多样性被越来越多的发现和认识后,等最先使用 ‘.. ”描述与蛭弧菌类似的捕食性细菌,目前 已广为接受和采用,但多缩写为“。中文可将其翻译为“蛭弧菌及其类似 生物”,为简便起见作者个人认为以“蛭弧菌类生物”作为中文名称较合适。 专性 捕食性的不仅以被猎食细菌为营养进行生长,而且直接依赖后者进行增 殖,使得难以确切界定是捕食者丕是寄生物,因此通 也可称宿主菌或寄主 常这两个概念都可使用。同样,被捕食的细菌 菌 。 . 分类和系统多样性 如前所述,等最早将归为蛭弧菌属,并以为唯一种名。 尽管所有目前已知都具有十分相似的形态和生活方式见.,但在 早期研究中就发现某些菌株间生理生化特征上存在明显差异。由于所有分 离到的野生型最初都是.型的,必须与适合的宿主菌共培养才能存活, 因此需要获得.突变株或完全去除宿主细胞后才能进一步通过某些生理生化 或 分子等特征比较菌株间的异同。等根据.突变株的含量 将土壤来源的分为两个组,含量分别为.%和%.%,并进一步结 合/杂交、同源性、酶的电泳迁移模式等特征,将它们分为三个种 .,且和另外两个新种?嘶塔蛭弧菌旧正和斯托普蛭弧 菌磁,模式菌株分别为.和。譬分离到株共五 种血清型的噬菌体,并以此将株区分为六组。等根 据宿主裂解范围将夏威夷海岸水中分离的株分为三组,其中一个组三个 菌株的含量为.%或.%,远低于陆生的,另一组一个菌株的则为 .%,其它菌株未见报道。等根据宿主范围将以色列地中海海岸 中山大学届博士学位论文 温崇庆 水中分离的分为十组,含量为.%.%。由于宿主范围可能因测试 条件等原因而获得不一致结果,因此难以作为有效的分类标准。但等 和等对海洋的含量、生长温度和盐度的研究表明,海洋 明显有别于陆生菌株,且可能包含多个种。等通过免疫荧 的血清学分型结果表明,. 光方法对陆生株.及其衍生的株. 的抗原性不同,且都不同与其它属于的菌株,而 .和. 后者至少又可分为九个不同的血清型。等通过免疫扩散技术对 株从美国海湾分离的嗜盐研究表明,至少可将它们区分为七 个不同的血清型。尽管上述研究都证实陆生或海洋均存在高度异质的类 型,但限于当时技术条件等原因都没有从系统进化角度揭示的系统发育地 位,也没有确定新的分类单元。因此,《伯杰氏系统细菌学手册》第一版第一 卷 仍然以等的分类为依据,将其包括在含三个 种的蛭弧菌属中。 根据 寡核苷酸编目特征,等的研究表明属于. 变形细菌.成员,并包含和.两个主要的组。 基因序列分析了株的系统进化关系, 等通过部分 表明所有菌株间的亲缘关系比它们与任何其它被分析细菌间的更为密切, 与最相近的两种细菌为同属于一变形细菌的黄色粘球菌 和脱硫脱硫弧菌 。他们的研究进一步证实了 等对两组的划分,并认为不同是由共同祖先进化来 序列和?杂交分析, 的。等根据以往研究证据,结合 将.和.豇从蛭弧菌属转移到一个新设立的噬菌弧菌属 中,分别称作斯塔噬菌弧菌.和斯托普噬菌弧菌佃口. ,模式菌株仍然分别为.和,只是属名被改变了。接着, 等和等对土壤、植物根际、人和动物肠道以及污水 的系统发育分析也支持等对分类的修改。等对株淡水或陆生 ,/和株海洋或嗜盐 , 序列系统分析表明存在着广泛多样性,且厂. /的 肋细初阳聪噬菌弧菌及后面阳硪韶铲吞菌弧菌的中文译名是本研究第六章内容投稿水产学报》 后作者分别参考和直接根据审稿专家建议的中文名称翻译的,特此说明并致谢。温崇庆 中山大学届博士学位论文 和/ 分别构成了两个序列差异%的系统组,因此他们建议进 一步修改特别是 的分类。 在上述系统分析的基础上,等结合分子和表型特征,将/ 也包括在中,并命名了海洋噬菌弧菌?口.和海岸噬 菌弧菌?口.两个新种,模式菌株分别为和。等通过扩增核糖体限制性分析 ,对株不 同环境厂 分离物进行分型和测序, 结合 ://..../数据库中已知的个包括个环境来源克隆的相 关序列构建了基于 序列的系统进化树,结果表明和 口幼哼阳,.缎分支内均存在高度的多样性,序列差异分别可达到%和%以上, 而两者间的序列差异又超过%。根据%以上的序列差异,他们将 和乡支分别划分为八个和九个系统类群,并将 分支菌株从原来的蛭弧菌科移出,设立一个新科一噬菌弧菌 科,另将其中的.眦属转移到新设立的 吞菌弧菌属,模式种为斯塔吞菌弧菌僻.,另外三个已 知种,即肋.、.和.以及其余未指定种名的类群仍然包 括在中;而包含九个类群的蛭弧菌科,只有一个已定名的属?蛭弧 菌属,和一个确定的种?。接着,等通过培养和不依赖培养方 法研究了一个土壤样品的多样性,并将蛭弧菌科的类群数从九个延伸至 株/ 的 序列, 个。等分析了源自不同咸水环境 将噬菌弧菌科类群数从八个扩展到个,另外还包括三个单一分离物 ?。紧接着,等又通过对其中大多数菌株聚合酶肛 亚基一 ,基因序列分析发现,基因序列与 序列得出的系统类群高度一致,只是前者可给出较多的亚群信息,同时他 们将属于厂 的.叭中移入一个“新属一“裂菌弧 菌属,模式种和菌株为“斯托普裂菌弧菌 ”,并将其与同样属于/ 的吞菌弧菌属一起从 科转移至一个“新科一‘吞菌弧菌科”,而 所有/ 仍包含在。然而由于他 . 中山大学届博士学位论文 温崇庆 对相关菌株的命名并不符合有关细菌分类命名规则,有关分类和命名结果被 视为 无效的’ ,尽管其系统划分上可能是比较合理的,因此本论文对有 关学名描述时暂不采用他们的结果。 对 基因等序列的系统学研究使得最近几年对系统 多样性有了更深的认识,并对其分类产生了深刻的影响。年以前, .的分类,即只有一个科一个属和三 分类单元和名称主要依据年 个种。而目前,如上所述,共包含两个科三个属和五个已命名的种,更重 要的是,两个科中已知的不同系统类群代表着许多潜在的“新种”甚至“新 属”。当 然细菌分类特别是对于这类捕食性细菌需要多相分类方法才能给出可靠 和稳定的分类 .。显然,多位点序列分析 因具有更可靠且操作上相对更简便等优势 .,可能在不 久的将来给分类提供强有力的依据。 由于编写和出版时间等原因,最新的《伯杰氏系统细菌学手册》中,即第二版 第二卷,变形细菌部分 ,没有将年以后出现的 新分类单元和名称正式列入。该手册将包括在.变形细菌中的蛭弧菌目 ,蛭弧菌科。其中除了以周质寄生生活的属仅含 一个种和属包括舶.和.两个种外,蛭弧菌科中还 包含两个形态上和相似,但以胞外寄生方式生活且鞭毛没有外鞘的 属和属,它们对宿主菌的要求也明显不同于。其 中 .近来被证实为【.变形细菌,且等,认为它们 也属于,并建议将其称为?,而其它属于.变形细菌中的贝 称.,以表示两者的系统差异 ;而和 ://.../中目前还未见有关的系 统序列信息。考虑至和的捕食方式、鞭毛结构、系统地 位及对宿主菌的要求等特性与本研究讨论的均有明显差别,作者个人认为 它们不属于,至少不属于典型的,因此也不在本论文讨论范畴中。 . 形态和生活史 目前所有卧均为革兰氏阴性.,细菌,攻击期细胞 温崇庆 中山大学属博士学位论文 呈弧状或杆状,大小通常为... ..哪,具有极生带鞘的单根鞭毛。鞭 毛直径约 弯曲 ,表现为典型的衰减波浪型枷砌 &;/? 通常以捕食其它一菌为生,具有独特的二态生活周期图.中部, 细胞侵入宿主菌周质空间中, 野生型或菌株即游离的攻击期 与后者形成一个称作蛭质体的球状结构井进入周质生长期 ,利用宿主细胞成分为营养进行丝状生长,发育成 熟后分裂成几个子代细胞井裂解宿主细胞壁得以释放,以开始新一轮的生活 周 期。这种特殊的生活方式是与其它捕食性细菌最显著的差异& ,其中涉及的机制也是研究者们~直关注和研究的热点。 图生活周期示意图修改自“锄 卷绝大多数有关特别是生长发育有关的研究都是以为研究对象的, 包括第一个基因组被测序的盯 ,因此在此以为对象结 合已有研究特别是基因组学和分子生物学内容并参考等的综述介 绍其捕食性生活周期及其可能机制。 根据已有形态和生理实验证据结合基因组序列分析等将的 捕食性生活史模式化为八个阶段。第一阶段,宿主定位 。游离的攻 击期细胞在无适合宿主存在条件下将很快丧失活性 吐,因此必 须尽快发现和侵染宿主细胞以进行增殖。通过由六种不同鞭毛丝蛋白组成的 极生 单鞭毛,蛭弧菌可以高达/翘速运动.,以增加其碰撞 中山大学届博士学位论文 温崇庆 和接触宿主细胞机会。在基因组四个不同位点上共发现六个负责运动和鞭毛 合成有关的基因簇及六个鞭毛蛋白合成基因 .。等 通过插入失活突变对六个鞭毛蛋白合成基因的功能研究证实它们在基因 组中都高度保守,分别失活其中五个基因并不影响鞭毛的形成及其运动和捕 食功能;而另一基因突变后则不能正常合成鞭毛并导致运动丧失且不能裂解 液体中的宿主菌,但仍然能低效率的裂解与其直接接触的宿主菌苔,表明鞭 毛运 动是液体环境下接触宿主细胞的关键因素,但不是进入宿主的必要条件。 目前还不清楚什么因素吸引定位到宿主细胞数量丰富的区域,早期研究 ; 建议可能与对氧气及氨基酸之类化合物的趋化作用有关; .。等的研究表明, 突变一个甲基受 体趋化蛋白 基因导致捕食效率有所下降, 证实利用趋化系统感应环境包括宿主的变化。基因组中共发现个甲基受 .,进一步 体趋化蛋白基因和一个趋氧基因及两个氧感应基因 表明趋化和或趋氧很可能在宿主定位过程中扮演重要作用。基因组中缺少经 典的群体感应 基因 .,表明不太可能由此感应 来自宿主的密度依赖的高丝氨酸内酯信号。 一旦攻击期细胞与宿主细胞发生碰撞,即开始粘附宿主细胞进入 第二阶段。早期研究表明 ,多种因素如培养基成分和、氧 气、温度等都可影响粘附。粘附过程可分两个阶段,最初几分钟粘附是非特 异的 和可逆的,仍可游离掉;第二阶段则是特异的和不可逆的,涉及到与鞭毛相 反极的细胞和宿主外膜的相互作用,这种识别过程也可能是决定或其它 宿主裂解范围差异的基础 .。对同一宿主菌不同外膜 成分突变株表现出不同的粘附效率 。此外,坌荨 将与两种宿主菌在液体条件下共培养时,发现优先裂解其中的一种宿主菌, 且这种差异性捕食作用与对不同宿主菌的粘附效率有关。这些研究表明并 非随机粘附和感染宿主菌,而是通过某种目前还不清楚的识别机制。早期电镜研 究显示在粘附宿主菌的细胞部位出现了菌毛样的纤丝结构并建议该结构涉及 ; 到宿主粘附和随后的穿入过程 。基于基因组中发现了 多个粘附候选基因,至少包括四基因簇以及许多分散的编码类型?菌毛的, 中山大学届博士学位论文 温崇庆 基因,其数量在目前报道过的细菌基因组中居第四位,等认为除 了与宿主外膜成分之间的蛋白质.蛋白质、脂多糖.脂多糖被动地相互作用外, 菌毛有关的主动粘附也会发生。等对菌毛相关基因转录水平的研 究表明,攻击期细胞相关基因的表达量增加,而周质生长期则显著下降,表明菌 毛在捕食过程中具有重要作用。等进一步通过插入失活证实了类 型?菌毛在捕食中起到关键作用。 在主动和不可逆粘附宿主细胞的同时,就开始了捕食周期的第三阶段一 矗的过程中,聚 侵入。早期研究发现在侵入大肠杆菌 糖酶和肽酶丑速将%?%的宿主肽聚糖降解 。在成功侵入前,可能通过多种水解酶以局部靶向方式在 宿主细胞外膜和肽聚糖层上产生一个小孔,这一开口最终被重新愈合,以避免对 宿主细胞过度损伤和造成其内含物的渗出。基因组中执行上述功能的候选基 因包括个蛋白酶或肽酶和个聚糖酶基因 .。等 认为一整套抽搐型菌毛通过先前产生的一个小孔把拖向 宿主外膜中,同时粘附到宿主肽聚糖内层,但这一过程涉及的物理特性尚不清楚。 在入侵的同时,宿主细胞壁可能由于水解作用去交联使得周质空间迅速扩大,以 产生足够的体积容纳入侵的。早期研究认为在粘附宿主后和进入其周质前 脱去鞭毛 ,但最近等研究表明大约%的在侵入宿 主周质后还保留鞭毛。在上述酶学的和机械学的共同作用下完成侵入过程,与此 同时宿主细胞迅速死亡& 。 无论是否脱去鞭毛,定居在宿主周质空间中即第四阶段的 丧失其运动性,并很快开始其周质生长期的细胞学进程,如复制及生物大 分子合成。紧接着,先前杆状的宿主细胞转变成球形的渗透上稳定的.宿主联 合结构,即形成蛭质体和进入第五阶段,此时细胞开始生长。蛭质体的转变 过程被认为是脱乙酰酶俏.和酰基转移酶协同修饰肽聚糖的 作用结果 ,,同时侵入过程中靶向肽聚糖多 糖链的聚糖酶活性立即被中止 .。基因组中也发现了几个编码 聚糖修饰酶的基因,如可溶性的和膜结合的溶解胞壁质的转糖基酶基因及一 个膜 结合的胞壁质水解酶效应物基因 .。可能由于宿主细胞外膜的温崇庆 中山大学届博士学位论文 .。在此阶 更改使得蛭质体对其它细胞的侵入具有“免疫性” 段通过一系列转运体系从宿主胞质溶胶中摄取营养开始其生长发育。这些转 运体系反应在基因组中包括个腺苷三磷酸结合盒 和. 个主要促进物超家族 转运物类群 .。 ,从中预测到由个转运蛋白组成的个转运系统 ;& 早期研究认为可将宿主细胞脂多糖& . ; .和外膜蛋白 .; 直接掺入到自身的相应结构中,然而等、等和 等通过质谱、二维电泳等技术的分析否定了可直接摄入完整宿主脂 表明是直接从宿主 多糖或外膜蛋白。以前的生化实验 胞质溶胶中获取的,然而基因组中并没有发现已知的转运蛋白同系物, 的转运机制仍不清楚。基因组分析表明具有通过糖酵解、三羧酸循环、脂 肪酸降解以及进行氧化呼吸产生所需的全部完整代谢酶的基因 .。这一发现及基因组中预测的诸多水解酶表明通过降解宿主成分并利 用其产生的组成性碱基、糖或者酸重新合成其自身的分子和,而不是直接转 运和利用来自宿主的复杂中间代谢物 .。 通过降解宿主细胞成分为营养和能量,在蛭质体周质中生长成一个螺旋 形的丝状体,丝状体发育成熟后开始分隔,即开始第六阶段。基因 组中与染色体分配和分隔所需基因与已知的相关基因女、、.加和 等编码产物相同源,但由一个长丝状细胞复分裂成多个相同大小的子代细胞, 因此其中涉及的具体机制很可能不同与一般细菌的二分裂方式 。 当蛭质体中的宿主胞质成分被吸收耗尽后,分裂而成的发育成带鞭毛 的攻击期细胞第七阶段。分裂产生的子代个体数量决定于宿主细胞大小,如 以 .为宿主每个细胞平均可产生个子代细胞,而每个蔓延水螺菌 ; 细胞则可产生一个子代 。最后产生水解酶裂解宿主残余的肽聚糖层和外膜,释放攻击 期子代细胞第八阶段,以开始新一轮的进攻。液体培养条件下,根据菌龄的 差异最初一轮生活周期的完成需要 .。等对 中山大学届博士学位论文 温崇庆 编码鞭毛马达复合物有关的基因研究显示,通过反义负调基因 导致从蛭质体释放出的时间显著推迟,且释放的子代表现出缓慢翻腾 运动,而不是正常情况下的迅速直冲 运动,表明功能完整 的鞭毛马达是正常捕食性生活周期所必须的。 以菌株为代表的极少数侵入宿主菌周质后在一定条件下并不立即 开始周质生长期,而是形成肾形的称作蛭孢囊的休眠结构图左 部,与营养细胞相比蛭孢囊对干燥、高温和饥饿等逆境具有较强的抗性 ,; 。某些海洋贝可形成稳定的蛭质体并以 此在营养相对缺乏的环境中较长期存活 。除了明显的抗饥 饿特性外,海洋形成的这种稳定蛭质体并不具有蛭孢囊那样的抗热、抗干 燥等能力。 从自然环境中最初分离到的通常都是.的专性捕食者,但可通过不 ; 同方法获得不依赖宿主菌可纯培养生长的.突变株 ;& ; ; 。早期 研究表明野生型菌株可以一.。频率自发突变为.株,并由此认为.至. ; 菌株的转变涉及到一个或多个基因突变 ,而最近等通过滤膜浓缩培养法从大约个野生型 细胞中就可获得.株,表明.株并非完全依靠突变途径产生,也可能是适合条 件下的表型转变。.株可以是专性非宿主依赖型的,即丧失了裂解宿主菌的捕 食性特征,也可能是仍具有裂解宿主能力的兼性.株 .。无论 哪种方法获得的专性还是兼性.菌株,在纯培养条件下都具有类似.菌株在 宿主周质中无鞭毛的丝状生长阶段,最终也会分裂成多个具极生鞭毛的子代 细胞 图.右部。 尽管上述对捕食性生长发育周期的讨论仅以为对象,鉴于与其 它或/ 在形态和生活史上极其相似,在系统进化关系上也最接近, 且可能由共同祖先进化而来 .;& ,因此 有理由推测不同很可能以相同或相似的机制完成其捕食性生长周期。最近 ,. 第一株/ 的全基因组序列已公布 ://...// /,蛭弧菌 .哪部分基因 中山大学届博士学位论文 温崇庆 / ., 组序列的也已公布://.../ 通过基因组学和蛋白质组学的比较和分析将有助于我们更清楚的了解这类 奇特 细菌的捕食性发育机制。 . 的生态学及其研究方法 特殊的捕食性生活方式和普遍存在于自然环境中表明,它们很可能对 细菌生态系统直接产生重要影响,并由此影响生态环境,因此其生态学有关 的内 容一直是研究中最主要的方向之一。 ..生态分布 从多种自然环境和人工生境中都分离培养到,理论上只要有一定数量 一细菌存在的自然环境中都有可能存在,表.列出了部分代表性环境中 分离到的报道。 表.代表性分离环境 分离来源 参考文献 土壤 ; ; 植物根际 . . 河水及其沉积物 &污水处理系统 ; 海湾水 /.; .; 海湾沉积物 . 海水 ; ;& ; 海水养殖池 盐湖水 盐池水蟹鳃 & 人粪便 呼兰刘秉阳 ; . 动物鸡、马粪便 李楠;曹海鹏等 动物鸡、鱼肠道 生物膜 . ;中山大学届博士学位论文 温崇庆 不依赖培养的分子生态学方法也从各种环境中检测到越来越多的克 隆子, 中目前包括多个 基因的环境克隆 序列,这些克隆来源环境除了与以往分离的环境相同或相似外,许多还来 自一些较极端或较特殊环境如热泉、深海热液、人血浆和皮肤等,表.列出了 还没有从中分离培养到的部分环境中检测到的相关克隆序列。 表部分 基因环境克隆子来源 尽管目前对生态分布规律及其机制了解的还不够全面和深入,但现有 研究已发现和证实一些有关生态分布及其与环境因子相关性的特点。早期 研究就已发现从淡水或陆地土壤中分离的厂 对盐度的要求明显低于来 自海水或其它咸水环境/ 就会 研究表明 的。等 抑制的捕食过程,而等分离到的海洋至少需要. 的钠离才能形成噬斑。等报道的海洋生长盐度范围为 .%?.%,同时他们研究表明包括菌株 和.西在内的一些 /菌株在盐度.%时均不能生长。等从盐池中分离的在盐 度%的双层平板上都可形成噬斑,除一个菌株外,其它菌株在盐度‰的液 中山大学届博士学位论文 温崇庆 体培养条件下仍可裂解宿主菌。等对不同盐度位点河 的分离发现,从盐度大于%的咸水位点分离的都是/ ,而在盐 度小于的淡水位点得到的都是肌。环境中盐度大小不仅决定是否存 在厂或/ ,也可能影响特别是/ 的种群分布。如 等对海湾水体研究初步表明,从盐度%.%的 中、北部海湾区与盐度%.%邻近大洋的南部海湾区分离的类群明显 不同,前者局限于能在较低盐度下生长的“海湾型”,后者则属于需要较高 盐度的“海洋型”。 季节或温度变化是影响分布的另一重要因素。等, 较系统研究了季节波动对数量的影响,他们发现较暖季节时计数的 河水体或沉积物海湾的一个支流含量比较冷季节时 的更高,数量与季节温度变化呈正相关。等对大堡礁海域海 水含量的季节波动关系研究也证实了季节温度与含量呈相关性。 等分离的生长温度情况与等从以色列地中海海 岸水分离的菌株相似,在?时都可生长,而等从气候相对较冷 的海湾环境中分离的菌株在?时均不能生长,表明的生长温度要求可能 与其最初分离的环境温度相适应,但是温度是否以及怎样影响种群结构的 分布还不太清楚。 对于以捕食其它细菌为生的而言,宿主菌是决定其生存与否的最关键 因素之一。大多数生态学调查或研究发现在自然环境中的含量与相应环境 中异养细菌即潜在宿主菌含量呈下相关 ; ; ; ,,即较高含量宿主菌将维持 较高数量的存活机会 。因此,从环境生物膜中更容 . .; 易分离至 ; 。当然由于研究环境的不同及其中敏感宿主菌占总细菌比例的差异等原因, 环境数量和细菌数量间并不总是表现出相关性 。另 一个相关性不明显的环境是动物肠道,尽管其中存在高数量的细菌,但可能 由于 氧气含量等条件的限制,很难或只能较少分离至 ;呼兰刘秉阳。 中山大学届博士学位论文 温崇庆 异养细菌特别是其中潜在宿主菌不仅从数量上影响在环境中的丰度, 更重要的是,特定生态系统中细菌的种群结构很可能对种群分布产生重要 影响。同样,如何影响环境特别是怎样调控细菌种群结构等,目前仍不清 楚,都有待通过适合方法进行研究 ; .。 ..研究方法 生态学有关研究方法主要包括依赖培养的.经典 方法和不依赖培养的或免培养的.分子生态学方法。双层平板 法一直是分离培养最常用方法,其主要过程与分离噬菌体时相似,只是减 少培养基营养成份和增加培养时间,因为较低的营养不仅可减小其它细菌过 度生 长和噬菌体噬斑等对噬斑观测时的干扰,也有利于形成更大更清 ; 晰的噬斑 。目前最广泛使用的培养基主要是 用于厂 的稀释营养肉汤 和用于 / 的多聚蛋白 ,培养基?和 。的成分含.%营养肉汤, ?, ,多聚蛋白 ..。而国内研究厂和/ .;配方为过滤海水 , 应用较多的双层琼脂培养基分别为不加营养的自来水琼脂司樨东等 或/营养肉汤琼脂王秀茹等和海水琼脂杨淑专黄庆辉, 的报道宋志 ;谢群英等,也有研究者用培养基分离/ 萍等; 。双层平板中上层琼脂含量一般为.%..%,底层 约为%..%,根据琼脂的质量有所变动。 不像噬菌体那样对宿主菌专一性要求极高,能够选择性裂解多种一 细菌,但不同菌株间差异明显,即使同一株对不同敏感宿主菌也表现出差 异性捕食现象& 。因此,在分离培养和计数时选择 哪种细菌为宿主时非常关键 ; 。宿主裂解范围 测试是区分分离物表型差异和了解这些捕食者对特定细菌类群可能影响 的最常用和较有效方法,具有重要的生态学意义 。许多有关宿主裂 解范围的研究都表明相对其它细菌,弧菌更容易被/ 裂解 优先捕 ,而等和等研究都表明/ 食与其分离自相同或相似环境的细菌。等比较了包括种弧菌 中山大学届博士学位论文 温崇庆 在内的种一细菌分离计数的效果,发现其中的副溶血弧菌 .不仅计数到的数量最多,而且测试其它宿主菌形成 的噬斑对.裂解能力时发现,其中的%邕够裂解.。因此等’ 建议在分离计数/ 时,优先使用副溶血弧菌为宿主。而对厂 研究时发现不同种细菌为宿主时的情况则与上述数/ 的有所差异。如 为宿主时产生的噬斑高于其它八 等对活性污泥细菌学调查发现, 在内的种细菌对污水或河水 种细菌;而等贝试了包括 计数情况表明,一种无色杆菌 .为宿主时计数的 含量最高。又如等分别以恶臭假单胞菌 、 胡萝卜软腐欧文氏菌 和根癌农杆菌 “为宿主分离土壤和根际时,前两种细菌计数到的土壤 结果均是根癌农杆菌的倍以上,而且其中的五株分离物对包括 在 内的种共株细菌绝大多数是植物病原或有益细菌的裂解能力表明,没有一 种细菌可被测试的五株都裂解。因此在分离厂 时建议采用多种细 菌为宿主& 。 虽然宿主茵的种类对的分离或计数具有重要影响,但某种宿主细胞所 在的生长期通常并不影响的培养效果,一般多采用对数期或稳定期的宿主 细胞培养。上层琼脂中宿主细胞含量一般为.菌落形成单位 ,每毫升 ,以获得一定浑浊度的宿主背景以便观测。 在适合温度培养下,在双层平板上通常需要. 形成肉眼可见的噬斑, ;& 当然某些形成噬斑的时间可能稍短或更长些 。根据研究目的及样品性质的不同可采用直接或富集后再用双层平 板法分离。富集法主要通过添加一定营养促进样品中细菌生长继而增殖 以提高其数量,或者直接将某种宿主菌加入样品中以富集能裂解特定细菌的 。另外,环境样品分离培养前通常需要过滤和或离心处理, 以去除较大的颗粒性杂质和某些可能在双层平板上形成噬斑的小型原生动 物、其 它非细菌和噬菌体等 ; ,虽然这种预处 理可能会一定程度上减少某些的检出机会,但可有效减小其它生物和非生 物因素对分离培养时的干扰。除了最常用的双层平板法外,少数研究者利 温崇庆 中山大学届博士学位论文 用最大可能数法 计数,即将宿主细胞分别接种到不 同稀释度的样品中,根据培养后宿主浊度是否下降判断存在与否及其可能 数量& ; 。 显微技术特别是相差显微镜和电子显微镜是形态鉴定分离物时最常 用方法。根据相差显微镜下细胞形态大小、运动性等特征可快速初步判断某种分 离物是否是,有时还可直接观察到粘附在宿主细胞上的以及球状 的蛭质体结构等。透射电子显微镜 ,或扫描 电子显微镜则是研究形态和结构特征的必要工具 ,早期对 特殊的捕食性生活周期的认识主要依赖证据获得的 。而原子力显微镜 .,和冷冻电镜技术 等则能获得更接近真实情况下的形态特征。 培养为基础的经典方法是获取分离物和认识其生物学特性必不可少 的途径,也是开发分子的特别是不依赖培养方法的基础。然而,很多情况下,依 赖培养方法难以准确反映微生物在生态环境中的真实存在及其功能。特别是以捕 食其它细菌为生的,需要和敏感宿主菌共培养时才能生存,而目前还没有 哪一种或哪些种细菌能保证培养出所有。实际上,现有研究中采用的宿主 菌仅局限于较常见的几十种细菌,而且很可能绝大多数潜在宿主菌目前仍然没有 被培养出来。因此,对于生态学方面的研究更需要引入和开拓不依赖培养 为主的分子方法 ; 。 基因的特异引物, 等设计了针对不同类群 并结合五种宿主菌分离培养和应用不依赖培养的变性梯度凝胶电泳,技术研究了一个土壤样品的多样性。他 们的结果显示仅用不到分离培养方法二十五分之一的样品,不依赖培养的方法就 获得相当于前者两倍的序列多样性。等最先通过荧光原位杂交 ,技术检测了土壤 .的 丰度,证实自然环境中蛭弧菌的数量并不太丰富。等最近开发了一 个技术更敏感的针对咸水环境 .的实时荧光定量技 术,并以此检测了一个海水样品 .的含量,结果表明该方法计数 的结果比双层平板法培养获得的数量高两个数量级,表明海水中存在大量的经典 中山大学届博士学位论文 温崇庆 双层平板法难以检测到的。等利用一种琼脂玻片以三种生 物刺激物在其上富集海湾水样以形成生物膜,并通过最大可能数法 和克隆文库测序等方法分析了生物膜中与异养细菌间的可能影响,结果显 示生物膜中数量与其中的异养菌呈正相关。这些研究表明环境中存在大量 以前未见报道的,同时建议利用和发展其它分子基础的特别是不依赖于培 养的技术研究有关的生态学。 . 应用研究 独特的噬菌特性使其在生物控制有害细菌上具有潜在应用价值,这也 是吸引人们对其研究兴趣的重要原因之一。对一菌特别是许多病原菌具 有较广的裂解谱,而且很少发现敏感宿主菌突变为抗性菌株 。生物膜不仅不能阻挡对其中细菌的捕食 .; ’. .; ,反而是易于生存的环境 ; 。研究发现对测试的多种哺乳 动物细胞都不能有效侵染。等对脂多糖中的脂质结构的分析 表明,其结构不同于一般一菌的,脂多糖诱导人类单核细胞时释放的肿瘤坏 死因子不到 旨多糖的百分之一,且释放的白介素.较少,表明不太可能 诱导哺乳动物的细胞毒性。林茂等通过一株蛭弧菌.与不同鱼类细 胞共培养时对后者毒性的研究表明该蛭弧菌对鱼类细胞没有毒性。这些研究 表明 在生物防治动物病原菌上具有其优越性。 国外对实际应用方面的研究报道并不多见。几个较典型的报道是, 最早报道利用防治病原菌感染动物的试验,他利用成功 治疗了由福氏志贺菌 感染兔眼引起的角结膜炎。等 报道了应用蛭弧菌减少了不锈钢表面上污染 :的试验。 等报道利用成功防治水稻黄单胞菌 弓起的水稻白 枯病试验。 而国内在应用方面的研究报道相对较多,且主要集中于家禽和水产养 殖病原菌的防治上。薛恒平和秦生巨用每朝.噬斑形成单位 .. 饲喂.日龄仔鸡,结果表明试验组仔鸡比对照组 ,的 中山大学届博士学位论文 温崇庆 的平均提高体重.%,鸡白痢发病率降;.%,差异均极显著。侯军和冯晓 英应用生态制剂防治鸡大肠杆菌病,将万只雏鸡均分为两组试验组与 对照组,结果发现饮服生态制剂的试验组患病死亡率.%显低于未饮的对 照组.%,但认为该制剂只有预防作用,而无治疗作用。冯晓英和张海鹰 用对致病性最攻击小鼠的保护性试验发现,与对照组相比,试验组对防 治致病菌的攻击,减少小鼠死亡率有明显差异,且较高浓度的腹腔注射后对 小鼠无毒性反应。何义进等首先报道了应用防治水产动物细菌性病 害的试验,他们的研究显示邑有效减少嗜水气单胞菌 感 染鲫鱼的死亡率。杨莉等研究表对预防嗜水气单胞菌感染引起的鲤暴 发性出血病具有明显的预防作用。曾地刚等的研究则显示,在浸浴试验时 水体含量在鼬以上时对防治嗜水气单胞菌引起的斑点叉尾鲴败血病具 有显著效果,但对注射感染嗜水气单胞菌则无治疗效果。李永文等对一株 从鱼塘淤泥中分离的防治大口鲶某种病原菌引起的感染显示,浸浴试验中 试验组鱼的存活率.%明显高于对照组的.%,张吕平等的研究显 示蛭弧菌对凡纳滨对虾稚虾无明显致病性且可有效减少虾池水体弧菌和对 虾血 用于对虾人工感染副溶血弧菌 淋巴弧菌数量。储卫华等将一株/ 的保护性实验显示,较高浓度的可有效减少对虾的死亡率。这些研究表明 在防治家禽和水产动物细菌性病害上具有明显的效果和应用价值。 当然利用生物防治有害细菌时也可能存在一些问题。杨吉霞等 和杨先乐等将在水产病害防治中的主要问题 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 为:生 长速度相对较慢,可能难解细菌性病害暴发时的燃眉之急杨淑专黄庆辉 ,如何进一步增强其噬菌活性,提高其应用效果;对不同一菌 的裂解范围是有限的,某些病原菌对其不敏感,难以被裂解,养殖环境中的某 些 有益细菌也可能被作为宿主菌裂解掉,如何筛选高效、专一的菌株; 对养殖环境的适应性问题,如水体盐度变化、养殖环境中可能存在的抗生素 和其 它污染物对活性的影响;作为制剂的长期保存问题等。这些问 题的解决都有赖于对更深入的研究。 中山大学届博士学位论文 温崇庆 .本论文研究目的和意义 海水养殖特别是对虾养殖是我国沿海重要产业之一。对虾病害尤其是细菌性 和病毒性病害一直是困扰对虾养殖业的最主要因素 。近 年来随着高密度对虾养殖业的发展和近岸海水污染等原因,进一步加剧了暴 发性 虾病的发生。多样性和普遍性以及独特的捕食性生活方式表明,不仅在生 态系统中可能发挥重要作用,在生物防治细菌性病害上也具有潜在应用价 值。 本研究旨在了解海水对虾养殖环境中的多样性及其特点,以丰富和深 化生态学内容,为资源的开发和利用特别是在海水养殖中的应用 提供理论依据和菌种基础;通过研究一株/ 对海水细菌的生物控制效 果、在对虾育苗水体应用时对水体细菌数量和结构的影响等,探讨/ 在海水养殖特别是对虾育苗中应用的可能性和问题,为/ 在海水养殖 中的应用提供依据和参考。此外,本研究还对一批商业化制剂进行了较系 统的检测和评价,为相关制剂的研究和应用提供参考。 中山大学届博士学位论文 温崇庆 第二章海水养殖环境的分离、鉴定和特征 / 普遍存在于各种咸水环境中,从海洋、海湾、近岸海水、盐湖、 盐池、海水养殖池、蟹鳃和牡蛎壳上形成的生物膜等环境中都有分离到菌株 的报 ; 道 ; .。最近 几年对/ 分离物系统多样性的研究表明它们具有较高的多样性 .; .; .,,;彭宗辉等。 的普遍性和多样性表明,它们可能对环境微生物的群体结构和动力产 生重要影响& 。弧菌是近海特别是海水养殖环境中最常 见的细菌类群之一,由其引起的弧菌病是海水养殖中最普遍的细菌性疾病, 经常.; .。以往对 导致鱼、虾、贝类的大量死亡 / 宿主范围的研究表明它们优先裂解弧菌 。而 且等、等和等的研究都表明细菌更容易被 与其分离自相同或相似环境的/ 裂解。因此,对海水养殖环境 的研究,不仅有助于了解这类捕食性细菌在养殖环境中的生态学特点和功能, 也 可能利用其独特的捕食特性生物控制有害弧菌及其引起的弧菌病。 由于野生型必须依赖宿主菌才能被分离培养,因此适用于纯培养物的 分型和鉴定方法很难应用于这种二元培养物,通常需要过滤或离心去除宿主 细胞或获得能纯培养生长的.菌株才能进行相关研究 .; .; ,而这些操作又比较费时费力,特别不方便 对大量分离物的分型和鉴定。因此需要探索更简便且有效的方法,以便于 生态和分类有关的调查研究。 技术广泛用于分子微生物生态学研究,理论上可以区分只有一个碱基 差异的小片段,通常只有数量上占%以上的优势细菌种群才能被 ?检 ,这种特性使其有可能直接用于二元培 养物状态下的分子分型。 本章主要报道通过培养分离方法结合分子分型和鉴定技术对两个海岛对虾 养殖区虾池及其近岸海水/ 的生态学调查,并对相关分离物的生长特 性进行了研究和比较。 温崇庆 中山人学屑博:学位论文 .材料与方法 ..实验材料 ...水样来源 水样采样地点位于广东省湛江市东海岛和南三岛以凡纳滨对虾怛加 为主要养殖品种的海水养殖区图,每个岛各选择四个虾池东海岛 和南三岛虾池编号分别为、、、和、、、和两个相邻 的海岸点陈海岛和南三岛海岸点编号分别为、和、进行样品采集。 。分别从各位点用无菌 采样时间是年月下旬,两个岛采样时间间隔为 聚乙烯瓶从离岸约的地点采集表层水样保存于冰盒中,样品转移至 广东海洋大学实验室存放并尽快处理。采样的同时测定各位点的温度、盐度 和口值。 性水样采样地点 、、、和,、、、、、、分别表示本章的《岸?虾池采样点 、、?袁示第三章的虾池采样点 日 中山大学届博士学位论文 温崇庆 ...菌株 对虾病原弧菌中的溶藻弧菌矿和副溶血弧菌形 为 崇庆等从患病对虾幼体中分离并鉴定的;溶藻