体外抑菌实验
方案
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4.26
菌种名称 培养基选择 菌液的制备条件
革兰阳性球菌 菌悬液的制备
金黄色葡萄球菌 1.营养琼脂培养基 将贮藏菌各取少许分别接种于固
2.营养肉汤培养基 体斜面培养基上,37?培养24 h,使菌
表
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皮葡萄球菌
3.牛肉膏蛋白质琼脂培养基 种活化。(细菌) 白色葡萄球菌 4.牛肉膏蛋白质肉汤 将活化菌种各取少许用相应的肉
汤液体培养基制成菌液,37?培养 甲型溶血性链球菌 1.血液琼脂培养基
18h，用生理盐水将菌落洗下，用比乙型溶血性链球菌 2.血清肉汤培养基 8浊管将制备的菌液稀释至 1.5×103.葡萄糖肉浸液肉汤 肺炎链球菌
个菌 /ml。浓度相当于0.5麦氏比浊革兰阴性杆菌
管，4?保存备用，稀释1000倍。(真肺炎克雷伯菌 1..营养琼脂培养基
菌温度为28?，72h) 2..营养肉汤培养基 大肠埃希菌
3.牛肉膏蛋白质琼脂培养基 铜绿假单胞菌 4.牛肉膏蛋白质肉汤
流感嗜血杆菌 1.HTM琼脂培养基
2.HTM肉汤培养基 副流感嗜血杆菌
真菌
1.改良马丁琼脂培养基
2.改良马丁培养基
白色念珠菌 3.牛肉膏蛋白质琼脂培养基
4.牛肉膏蛋白质肉汤
前期准备工作:
一.相应培养基准备
1.牛肉膏肉汤培养基的制备
将牛肉膏2.5g、蛋白胨 5g、氯化钠 2.5g 和蒸馏水 500ml 加入三角烧瓶中，混合，再加入蒸馏水500 ml，混合加热溶解，调pH=7.5，煮沸 4min，冷却后用滤纸过滤，分装于烧瓶内，高压灭菌后置阴凉处备用。
2.牛肉膏琼脂培养基的制备
将牛肉膏5g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g 和琼脂 25g 加入大烧杯中，加蒸馏水 1000ml，混匀，加热至沸腾使其溶解，并补充由于蒸发而
失掉的水分，调 pH,7.5 以纱布过滤，装于烧瓶中，塞上棉塞，高压灭菌后冷却至 50?左右。
3.血琼脂培养基配置
在血平板基础培养基基础上高压消毒后，冷却至56?时加入5%,10%无菌脱纤维兔血，混匀，备用。
4.混合培养基制备即在蛋白胨水培养基中加入1.0%葡萄糖和1.6%溴甲酚紫指示剂, 8MPa高压灭菌20min后冷藏备用。
二.比浊管的配制:
取0.5m浓度为0.048mol/L的BaCl加到99.5mL 0.18mol/LHSO224
8中配置成0.5个麦氏浊度的比浊管(相当于细菌数为1.5×10个/ml),用试管密闭封装备用。
三.药液:(过滤器过滤)
阳性药:广谱抗菌类药物:如青霉素类。
暂定中药单体化合物:穿心莲提取物。
扁咽口服液
复方草珊瑚含片(处方组成:肿节风浸膏，薄荷脑，薄荷素油)
四(试剂:
除上表中的培养基外，0.9%灭菌生理盐水(分装)，溴甲酚紫指示剂，葡萄糖，脱纤维兔血，BaClHSO 2，24
五.仪器:
高压蒸汽灭菌锅，微生物比浊仪，电热鼓风干燥箱，超洁净工作台，
细菌比浊仪，生化培养箱(细菌，真菌)，CO2生化培养箱，灭菌试管12 mm × 100 mm(具塞)，移液枪或灭菌刻度吸管，三角瓶，接种环，具塞试管，纱布等。
实验方法:
试管倍比稀释法:
取12支无菌试管，每管加2.00 mL灭菌肉汤(注意肉汤的选择)培养基，于第1支试管中加入药液2.00 mL，混匀后吸取2.00mL至第2管，混匀后吸取2.00 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，混匀后弃去2.00mL;第11管为不加药液作为对照(阳性对照)，观察细菌生长情况，第12管加入药液2.00 mL，混匀弃去2.00 mL，不加细菌(阴性对照)，观察受试药液是否有污染。另外单设一试管加2.00 mL灭菌肉汤，不加药液也不加菌液(培养基对照管)向编号1 ,11的试管中加入用制备好的混合培养基将菌液稀释1000倍至浓度为
51.5×10个/ml，菌液0.1 mL,混匀，放置于37 ?恒温培养箱培养20,24 h后(白色念珠菌28?培养3天)观察结果。以肉眼观察，通过与第11管、第12管对比，在阳性对照管细菌正常生长，阴性对照管无细菌生长的条件下，不发生混浊变化的最高药物稀释倍数该药物的MIC值。实验重复3次。将所有清晰无菌生长的试管培养液接种于相应的培养基平板培养24 h，以菌落数不超过5个的最低药物浓度为该药物的MBC值。
如果采用加指示剂的方法:与对照组比较,紫色退去或颜色变浅的管为有细菌生长,颜色不变的管为细菌生长受抑制管,以肉眼观察紫
色不退试管的最低药物浓度作为该药的最小抑菌浓度(MIC)。
缺陷:本次实验采用改进的试管法,用溴钾酚紫作指示剂,避免了单纯试管法中中药颜色对结果判定的影响,其原理是细菌利用培养基中的葡萄糖发酵产酸遇溴钾酚紫使培养基的紫色褪去。与固体培养基稀释法和碟管法相比具有可以测定高MIC值和操作简便的优点。但此法必须调节药液的pH近中性,加入的碱液可能会不同程度的影响药液的抑菌活性,对实验结果会产生一定的影响。
浙公网安备 33021202002483