病毒宏基因组学在医学领域的应用_范胜涛

中国生物制品学杂志2014年2月第27卷第2期ChinJBiologicalsFebruary2014，Vol.27No.2近年来，新发、突发传染病不断出现，由于其不可预知性和突发性，同时具有病死率高、危害性大等特点，因而引起社会恐慌。然而，现有的常规检测只能针对我们已知的病原微生物，对于未知病原体仍然缺乏相应的鉴别手段。传统的诊断技术已不能满足或很难适应提前预警或快速诊断新发传染性疾病的需求。挖掘潜在的新病毒或未知病原体将是人类预防、诊断和治疗新发传染病的最有效的途径。现有的病毒检测技术受多方面的限制。病毒宏基因组学（viralmretagenomics）是在宏基因组学（metagenomics）理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科的分支，近年来，其在医学及公共卫生领域显示了巨大的优越性。本文主要对近10年来病毒宏基因组的兴起、优势及策略、在临床检测及公共卫生领域的应用进展作一综述。1病毒宏基因组的兴起宏基因组学是由Schmidt等［1］和Handelsman等［2］于20世纪90年代提出的一门应用学科，迄今为止，其研究对象已从最初的土壤微生物发展到水体浮游微生物、海水及海底沉积物、空气悬浮物以及动植物体附生微生物等。目前99%以上微生物在现有实验室条件下都无法进行培养，所以利用宏基因组技术来研究那些大量未知的微生物序列信息，可以跨越微生物研究的初始瓶颈，在很大程度上改变人们对微生物世界的传统认识。而病毒宏基因组学是以微生物中的病毒为研究对象，近年来随着高通量测序技术的不断发展，尤其是新二代测序仪的出现，使病毒宏基因组学发展尤为迅速。从2002年至今，许多研究成果及重大成就的取得都离不开该技术的运用，见图1。近年来，该技术的应用的范围也不断扩大，涵盖了农业、林业、环保、医药、公共卫生安全等多个领基金项目：863 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 （2012AA022006）.通讯作者：夏咸柱，E-mail：xiaxzh@cae.cn病毒宏基因组学在医学领域的应用范胜涛1，2，高玉伟2，夏咸柱1，21.中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，北京100021；2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130122摘要：新发、再发病毒性传染病不断出现，如何快速鉴别致病病原显得尤其重要。近年来，不依赖传统培养技术的病毒宏基因组学在临床医学的运用越来越广泛。大量成功诊断的临床病例和新病毒的发现为病毒宏基因组在传染病的预防和公共卫生防控方面开拓了新的领域。本文主要对近10年来病毒宏基因组的兴起、优势及策略、在临床检测及公共卫生领域的应用进展作一综述。关键词：病毒宏基因组学；传染病；诊断中图分类号：Q939.4文献标识码：A文章编号：1004-5503（2014）02-0285-04ApplicationofviralmetagenomicsinmedicalfieldFANSheng-tao*，GAOYu-wei，XIAXian-zhu*InstituteofLaboratoryAnimalSciences，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100021，ChinaCorrespondingauthor：XIAXian-zhu，E-mail：xiaxzh@cae.cnAbstract：Emergingandre-emergingviralinfectiousdiseasescontinuetosurfaceallovertheworld.Identifyingthecausativeagentofanewepidemicisoneofthemostimportantstepsforeffectiveresponsetodiseaseoutbreaks.Inrecentyears，asaculture-independentapproach，viralmetagenomicshasbeenwidelyappliedtoclinicalmedicine.Thesuccessofmetagenomicsinidentifyingnovelvirusesinawidevarietyofsamplesopensdoorstonewapplicationareasparticularlyinpublichealthandthepreventionofinfectiousdiseases.Thispaperreviewstheorigin，advantage，strategyofviralmetagenoumicsduringthelastdecadeaswellastheadvanceoftheirapplicationinclinicaltestandpublichealthfield.Keywords：Viralmetagenomics；Infectiousdisease；Diagnosis·综述·285··中国生物制品学杂志2014年2月第27卷第2期ChinJBiologicalsFebruary2014，Vol.27No.2图1通过PubMed数据库检索到的有关“viralmetageno-mic”的文献数Fig1.Numbersofdocumentson“viralmetagenomic”inPubMeddatabanksince20002病毒宏基因组的优势及策略基于深度测序的病毒宏基因组学方法，直接以未知样本中的病毒核酸为研究对象，该方法不仅可以避开传统的培养法、血清法和PCR法，还可以迅速鉴定出存在的已知病毒，有效地发现各种未知病毒，并可以直观地描绘出各种样本中的病毒谱和丰度，有助于了解病毒的分布动态，实时监测一些致病性病毒和潜在致病性病毒的变化情况，有助于诊断一些新发或尚不明病原体引发的疾病。病毒宏基因组学的过程主要包括以下3个步骤：样品制备、高通量测序和数据分析与处理。2.1样品制备理论上，任何类型的样品均可运用该方法。相比原核和真核生物，病毒基因组较短，且所占比重也小，特别是临床病毒丰度低且混杂的样本，特别适合采用该方法，但如何去除非病毒核酸的干扰尤其重要［15-16］。一般来说，匀浆、过滤和超速离心均为必不可少的步骤。此外，可以运用SYBR金染色法实时监测处理样品中病毒颗粒的数量［16］。传统的分子诊断方法主要依赖病毒基因序列的特异性引物进行PCR扩增，由于病毒之间缺少保守的基因标记，无法对未知病毒进行检测。特异性PCR检测难以系统研究样品中的所有病毒，但随机PCR技术结合高通量测序技术可以全面研究某一生态群落的病毒宏基因组。随机PCR关键在于其特殊的引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ，在反转录用的6～9个碱基的随机引物的5′端加上一段含有一个限制性酶切位点的通用序列（Barcode）［17］，合成第一链（ssDNA），然后在KlenowDNAPolymerase的作用下进行第二链（dsDNA）的合成，再用通用Barcode序列引物进行PCR扩增。2.2高通量测序首先对DNA样品进行检测，检测合格的样品用于构建文库。电泳回收主要的DNA片段，并经气雾法打断大片段，然后用T4DNAPolymerase、KlenowDNAPolymerase和T4PNK将打断形成的黏性末端修复成平末端，再经3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接；最后，用合格的文库进行cluster制备和测序。双脱氧核苷酸链终止法（Sanger测序法）自1977年应用于第一代测序以来，新的测序技术和平台不断出现，高通量测序经历了几次大的变革。454测序、Solexa测序、SOLiD测序等高通量测序平台的诞生是基因组学研究领域具有里程碑意义的事件，见表2。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降，有利于我们实施更多基因组计划，从而解密更年份20022003200420052006200720082009201020112012论文数量10020030040050006007002000表12002～2013年病毒宏基因组学在病毒发现及疾病诊断中的重要事件Tab1.Importanteventsofviralmetagenomicsindiscoveryofvirusesanddiagnosisofdiseasesin2002~2013研究人员年代测序方法样品类型主要内容参考文献BreitbartM2002Sanger测序海水病毒宏基因组第一次用于海洋中病毒粒子研究［3］BreitbartM2003Sanger测序人粪便病毒宏基因组第一次用于人粪便中病毒信息研究［4］BreitbartM2004Sanger测序海水沉淀物海水沉淀物中75%的序列都是未知的［5］JonesMS2005SISPA，RACE血浆一种新的DNA病毒在急性病毒性感染病人的血清中发现［6］CulleyAI2006Sanger测序海水海水中存在大量的未知的RNA病毒［7］AllanderT2007454测序人鼻咽分泌物，发现并阐述了人第三种多瘤病毒的结构［8］粪便、尿、血液BreitbartM2008Sanger测序人粪便已知病毒在3个月婴儿肠道种类低，多样性随着年龄的［9］增长而增加BrieseT2009454测序血浆发现Lujo病毒：一种与出血热相关的沙粒病毒［10］BlomstromAL2010454测序脑组织一种的新型星状病毒在患水貂摇摆综合征的水貂脑中［11］首次发现LauckM2011454测序血浆新的猿猴出血热病毒发现［12］2012焦磷酸测序生活污水在污水中存在很多中已知和未知的RNA和DNA病毒［13］Minot，S2013454测序人肠道分析了人肠道病毒颗粒的起源和进化［14］域，尤其在新发疾病病原体的检测和未知病原体鉴别中发挥越来越重要的作用，见表1。286··中国生物制品学杂志2014年2月第27卷第2期ChinJBiologicalsFebruary2014，Vol.27No.2多致病基因的遗传信息。2.3数据分析与处理数据分析是高通量应用于生物医学研究最关键的步骤。测序平台上产生的原始数据（rawdata）存在一定比例低质量数据，为了使后续分析结果更加准确可靠，对原始的测序数据进行预处理，获取用于分析的高质量数据（cleandata）。数据组装前可以通过K-mer分析评估各个样品的测序深度，通过对SOAPdenovo设置不同K值［18］，筛选最优组装结果，对最优组装结果进行校正，并统计reads利用率。基因预测一般用于预测DNA序列中编码氨基酸序列的部分，即结构基因。目前的方法主要有两类：一类是基于序列相似性的预测方法，即以mRNA或蛋白质序列为线索，在DNA序列中搜寻所对应的片段进行基因预测（GeneMark软件）；另一类是基于统计学模型的预测方法，即利用数学统计模型进行基因预测，这种方法不依赖于已知的蛋白质编码DNA序列［19］。目前尚无可以非常灵活地处理所有数据的软件，即使是将来，也很难开发这样的软件，因为这些软件和操作均与实际数据相关，无统一的规律。表23种测序仪优缺点比较Tab2.Advantagesanddisadvantagesofthreesequencers测序类型优点缺点454焦磷酸读取长度可达400bp，当遇到polymer时，如AA测序可以对未知基因组进AAAA等，荧光强度和碱行从头测序基个数不呈线性关系，判定重复碱基个数有困难Solexa测序高度自动化的系统，读基于可逆反应，随反应轮取片段多，适合进行数增加，效率降低，信号衰大量小片段的测序，如减，读取序列较短，给从头microRNAprofiling拼接带来困难SOLiD测序每个碱基读取两次，准读取长度受连接反应的轮确性较高，特别是对于数限制，给从头拼接带来SNP的检测；灵活的系困难统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域3病毒宏基因组学在临床检测中的应用现在仍存在许多未明原因的疾病，依靠常规的实验室检测技术均无法确诊，这类疾病往往具有很高的发病率和死亡率。例如，据报道，每年有高达40%，总数约1800000的婴儿发生腹泻，但具体病因不明［20］。Svraka等［21］对临床上不明病因的临床标本进行了细胞培养，利用病毒宏基因组对1834份细胞培养上清液进行了病原筛查，发现了BK多瘤病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒及新型Saffold病毒，为临床诊断提供了重要参考。Law等［22］利用病毒宏基因组对慢性乙肝、丙肝、自身免疫性肝炎、非酒精脂肪肝等病人的血浆进行了研究，结果表明该方法不但快速、可靠，而且检测范围还能扩大到病人的尿液、胆汁、唾液及其他体液。此外，许多临床上的肠胃炎、腹泻、呼吸组织感染及肿瘤等疾病的确诊及新病毒的发现都得益于病毒宏基因组学［23-24］。4病毒宏基因组学在公共卫生领域的应用病毒宏基因组不依赖传统培养方式，便可对病毒起源、遗传进化进行分析，还能快速地侦检突发病毒性公共卫生事件。病毒宏基因组学在分析新病原的进化和起源方面具有巨大的潜力，如2002～2003年，由SARS样冠状病毒导致的严重急性呼吸疾病的暴发［25-26］，进而席卷全球，最终导致大约8000人感染，通过序列分析表明感染人的毒株在特定位点发生变异，进一步研究表明这一变化是由于在冠状病毒复制过程中nsp14-ExoN的突变造成的［27］。Palacios等［28］在经细胞培养、PCR、血清学检测为阴性的临床标本中发现了沙粒病毒。Towner等［29］在一场暴发于乌干达本迪布焦区的出血热中发现了埃博拉病毒。此外，人、动物和植物病毒的发现在很大程度上得益于宏基因组学的发展。5展望病毒宏基因组学技术不依赖于传统的病毒分离、培养，丰富了人们对人和动物微生物群落的认识，并提供了有效、快速的疾病诊断和未知病原体的鉴定途径。理论上讲，任何已知和未知的、能培养的和不能培养的病毒均能通过病毒宏基因组的方法进行鉴别。在医学研究领域中的应用除了新感染性疾病的发现，还有正常人及某些疾病患者的肠道环境中微生物群体多样性分析以及与疾病的可能关系，不可培养微生物耐药情况、机制分析及其在耐药传播机制中的作用。病毒宏基因组学在发达国家已经广泛应用于临床标本检测和新病毒的发现。我国在病毒宏基因组学的研究领域起步较晚，发展不够迅速，随着高通量测序技术成本的不断降低及我国对新发传染性疾病的重视度不断提高，该技术的应用将越来越广泛。287··中国生物制品学杂志2014年2月第27卷第2期ChinJBiologicalsFebruary2014，Vol.27No.2参考文献［1］SchmidtTM，DeLongEF，PaceNR.Analysisofamarinepicoplanktoncommunityby16SrRNAgenecloningandse－quencing［J］.JBacteriol，1991，173（14）：4371-4378.［2］HandelsmanJ，RondonMR，BradySF，etal.Molecularbio－logicalaccesstothechemistryofunknownsoilmicrobes：anewfrontierfornaturalproducts［J］.ChemBiol，1998，5（10）：R245-R249.［3］BreitbartM，SalamonP，AndresenB，etal.Genomicanalysisofunculturedmarineviralcommunities［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2002，99（22）：14250-14255.［4］BreitbartM，HewsonI，FeltsB，etal.Metagenomicanalysesofanunculturedviralcommunityfromhumanfeces［J］.JBacteriol，2003，185（20）：6220-6223.［5］BreitbartM，FeltsB，KelleyS，etal.Diversityandpopulationstructureofanear-shoremarine-sedimentviralcommunity［J］.ProcBiolSci，2004，271（1539）：565-574.［6］JonesMS，KapoorA，LukashovVV，etal.NewDNAvirusesidentifiedinpatientswithacuteviralinfectionsyndrome［J］.JVirol，2005，79（13）：8230-8236.［7］CulleyAI，LangAS，SuttleCA.MetagenomicanalysisofcoastalRNAviruscommunities［J］.Science，2006，312（5781）：1795-1798.［8］AllanderT，AndreassonK，GuptaS，etal.Identificationofathirdhumanpolyomavirus［J］.JVirol，2007，81（8）：4130-4136.［9］BreitbartM，HaynesM，KelleyS，etal.Viraldiversityanddy－namicsinaninfantgut［J］.ResMicrobiol，2008，159（5）：367-373.［10］BrieseT，PaweskaJT，McMullanLK，etal.GeneticdetectionandcharacterizationofLujovirus，anewhemorrhagicfever-associatedarenavirusfromsouthernAfrica［J］.PLoSPathog，2009，5（5）：e1000455.［11］Blomstr觟mAL，WidénF，HammerAS，etal.Detectionofanovelastrovirusinbraintissueofminksufferingfromshakingminksyndromebyuseofviralmetagenomics［J］.JClinMicro－biol，2010，48（12）：4392-4396.［12］LauckM，HyerobaD，TumukundeA，etal.Novel，divergentsimianhemorrhagicfevervirusesinawildUgandanredcolobusmonkeydiscoveredusingdirectpyrosequencing［J］.PLoSOne，2011，6（4）：e19056.［13］NgTF，MarineR，WangC，etal.HighvarietyofknownandnewRNAandDNAvirusesofdiverseoriginsinuntreatedsewage［J］.JVirol，2012，86（22）：12161-12175.［14］MinotS，BrysonA，ChehoudC，etal.Rapidevolutionofthehumangutvirome［J］.ProcNatlAcadSciUSA，2013，110（30）：12450-12455.［15］EdwardsRA，Rodriguez-BritoB，WegleyL，etal.Usingpyrosequencingtoshedlightondeepminemicrobialecology［J］.BMCGenomics，2006，7（1）：57-69.［16］ThurberRV，HaynesM，BreitbartM，etal.Laboratoryproce－durestogenerateviralmetagenomes［J］.NatProtoc，2009，4（4）：470-483.［17］PhanTG，KapusinszkyB，WangC，etal.Thefecalviralfloraofwildrodents［J］.PLoSPathog，2011，7（9）：e1002218.［18］LiR，YuC，LiY，etal.SOAP2：animprovedultrafasttoolforshortreadalignment［J］.Bioinformatics，2009，25（15）：1966-1967.［19］ZhangEM，HaiR，YuDZ.Researchprogressofgenepredictionmethodst［J］.ChinJVectorBioControl，2009，20（3）：271-273.（inChinese）张恩民，海荣，俞东征.基因预测方法的研究进展［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2009，20（3）：271-273.［20］FinkbeinerSR，AllredAF，TarrPI，etal.Metagenomicanalysisofhumandiarrhea：viraldetectionanddiscovery［J］.PLoSPathog，2008，4（2）：e1000011.［21］SvrakaS，RosarioK，DuizerE，etal.Metagenomicsequencingforvirusidentificationinapublic-healthsetting［J］.JGenVirol，2010，91（Pt11）：2846-2856.［22］LawJ，JovelJ，PattersonJ，etal.Identificationofhepatotropicvirusesfromplasmausingdeepsequencing：anextgenerationdiagnostictool［J］.PLoSOne，2013，8（4）：e60595.［23］BlinkovaO，KapoorA，VictoriaJ，etal.CardiovirusesaregeneticallydiverseandcausecommonentericinfectionsinSouthAsianchildren［J］.JVirol，2009，83（9）：4631-4641.［24］GaynorAM，NissenMD，WhileyDM，etal.Identificationofanovelpolyomavirusfrompatientswithacuterespiratorytractinfections［J］.PLoSPathog，2007，3（5）：e64.［25］DrostenC，GüntherS，PreiserW，etal.Identificationofanovelcoronavirusinpatientswithsevereacuterespiratorysyndrome［J］.NEngJMed，2003，348（20）：1967-1976.［26］PeirisJS，LaiST，PoonLL，etal.Coronavirusasapossiblecauseofsevereacuterespiratorysyndrome［J］.Lancet，2003，361（9366）：1319-1325.［27］EckerleLD，BeckerMM，HalpinRA，etal.InfidelityofSARS-CoVNsp14-exonucleasemutantvirusreplicationisrevealedbycompletegenomesequencing［J］.PLoSPathog，2010，6（5）：e1000896.［28］PalaciosG，DruceJ，DuL，etal.Anewarenavirusinaclusteroffataltransplant-associateddiseases［J］.NEngJMed，2008，358（10）：991-998.［29］TownerJS，SealyTK，KhristovaML，etal.NewlydiscoveredebolavirusassociatedwithhemorrhagicfeveroutbreakinUganda［J］.PLoSPathogens，2008，4（11）：e1000212.收稿日期：2013-09-16编辑：何巍288··