土壤真菌分离和计数方法的探讨

沈阳农业大学学报,2000-10,31(5):515-518JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2000-10,31(5):515-518土壤真菌分离和计数方法的探讨梁晨,吕国忠(沈阳农业大学植保系,辽宁沈阳110161)摘要:综述了分离土壤真菌的方法以及测定土壤真菌的间接计数法和直接计数法;介绍了常见的分离和计数培养基;评价了各种方法和培养基的优缺点;并着重讨论了各种分离和计数方法的应用。关键词:土壤真菌;分离;计数;培养基中图分类号:S432.4+4文献标识码:A文章编号:1000-1700(2000)05-0515-04ApproachonIsolationandEnumerationMethodsofSoilFungiLIANGChen,LUGuo-zhong(DepartmentofPlantProtection,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China)Abstract:Thatofisolationmethodsforsoilfungiandtheindirectanddirectenumerationmethodsformeasuringsoilfungi;wasre-viewed.Authorslistedcommonmediaforenumerationandisolation;valuedtheadvantagesanddisadvantagesoftheoffungiofmeth-odsandmedia;andfocusedondiscussingtheapplicationofthesemethodsforisolationandenumeration.Keywords:soilfungi;isolation;enumeration;medium60年代以来,微生物生态学研究发展较快,推动了土壤微生物学的研究,人们的兴趣转向了解土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用。80年代后,由于逐渐采用新研究技术和手段,使土壤微生物的发展进入了一个新时期,土壤微生物生态学的发展在很大程度上依赖于研究方法的改进和更新。土壤真菌作为土壤微生物区系的重要组成部分,虽然与其它组分(细菌、放线菌)有着共性,但也具有其特殊性,因此对土壤真菌研究方法的探讨尤具意义[1～3]。土壤真菌包括分布广泛的土壤习居菌和分布局限的土壤寄居菌,土壤真菌区系的研究对于衡量和维持生物多样性以及研究和防治土传性病害都具有重要意义。由于真菌在土壤中的存在状态的多样性和分布的不均匀性以及土壤本身理化性质的影响,对于如何反映土壤真菌区系全貌的分离和计数方法需要做进一步的评价[4,5]。1土壤真菌的分离方法1.1分离方法土壤真菌的分离可采用稀释平板法、土壤淋洗法、孢子悬浮法、土壤平板法、钟形撒粉器法、平板插入筛选法、插入管法、菌丝分离法、植物残渣法、直接分离法、捕捉法、湿筛法、漂浮法和蒸气法[6～14]。其中稀释平板法用于分离产孢能力较高的半知菌、子囊菌和接合菌,例如青霉属、曲霉属、拟青霉属、粘帚霉属、镰孢属、枝顶孢属和枝孢属,很少分离到担子菌和无孢子真菌。土壤平板法适用于分离在土壤中以菌丝状态存在的真菌,具有简便易行的特点。植物残渣法适用于稀释平板法或土壤平板法不能分离的真菌,例如立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)。湿筛法和漂浮法用于分离产生孢子囊的真菌。捕捉法可用于分离腐霉属、疫霉属和丝核菌属。冲洗土粒法[15]适用于分离腐霉属、疫霉属、木霉属、枝顶孢属、镰孢属和毛壳菌属。钟形撒粉器法可用来分离镰孢属。平板插入筛选法或插入管法适用于分离丝核菌属和葡萄孢属。蒸气法用于分离土壤中的子囊菌。此外,也可采用菌丝分离法和直接分离法来分离不易产孢的真菌。收稿日期:2000-08-26基金项目:辽宁省科委博士起动基金资助项目(961046)作者简介:梁晨(1971-),女,莱阳农学院讲师,沈阳农业大学植保系硕士研究生,从事植物病理学与土壤真菌学的教学和科研工作。○研究报告RESEARCHREPORT·516·沈阳农业大学学报第31卷1.2培养基土壤内真菌种类繁多,它们的营养需要不同,因此常采用多种不同的培养基作营养物质过筛培养。一般采用的培养基有无碳培养基、无碳培养基加氨基酸、维生素、棉花纤维或植物组织、洋麻培养基以及孟加拉红培养基等十几种培养基。其中孟加拉红琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)和牛胆汁琼脂培养基可兼用于土壤真菌的分离和计数[16]。孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基,成分准确,其上发育的真菌数量及种类较多,放线菌及大部分细菌易被孟加拉红和链霉素所抑制,但真菌菌落较小,是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。然而由于孟加拉红琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制,以及染料影响在原始平皿上正常识别某些真菌,与酸性培养基相比,必须转移更多的菌落到其它的培养基上。PDA和MEA均为酸化的天然培养基,能抑制全部细菌和放线菌。但由于酸度过高。有些耐酸性较弱的真菌,在其上不能发育,因此出现的数量及种类都比孟加拉红琼脂培养基上低。牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大,放线菌和细菌也全部被抑制,数量准确,但由于结晶紫的影响,不易在培养基上直接鉴定。作者在1998至2000年分离土壤真菌的工作中发现,松膏培养基和土壤浸汁琼脂培养基(SEA)也适用于土壤真菌的分离和鉴定,其中松膏培养基具有强烈抑制放线菌和细菌的作用,促进菌丝生长和孢子的形成,并且制备相对简便[17,18]。利用以下4种培养基对采自辽宁昌图县春播前玉米根际土进行分析,发现孟加拉红琼脂培养基比其它3种培养基分离的真菌数量明显多,其它3种差异不显著。在分离的真菌种类方面,孟加拉红琼脂培养基和松膏培养基明显比马铃薯琼脂培养基和土壤浸汁培养基多,其中松膏培养基上的菌落相对于孟加拉红琼脂培养基上的菌落较大,且产生大量孢子而易于鉴定[19]。分离土壤中植物病原真菌常采用特殊的选择性培养基。例如没食子酸琼胶培养基和HMI培养基可用于分离腐霉属和疫霉属真菌。五氯硝基苯培养基可用于分离镰孢属真菌。土壤浸出液选择性培养基和酒精琼胶培养基可用于分离轮枝孢霉属真菌。2土壤真菌的计数方法土壤真菌的计数方法有间接计数法和直接计数法,分别测定活菌数和总菌数。前者是在培养基上培养,测定菌落数和根据真菌的活性反应而计数的方法,后者是将土壤真菌染色,在显微镜下计数的方法。[16,20,21]2.1间接计数法2.1.1稀释平板法[6]根据土壤中真菌的数量,一般采用的稀释度为10-1～10-3,同时称取待测土样10g左右,经105℃烘干8h,置于干燥器中,待冷却后称重,计算土壤含水量的百分数。用混菌法和刮刀法将土壤悬液接种在培养皿中,重复4次,于28～30℃恒温箱中培养5～7d,选取菌落数在10～100的培养皿进行计数(剔除扩散性真菌菌落占据琼脂 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面15%的培养皿)。2.1.2最大概率数值法以烟草黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsisbasicola)为例,取烘箱干燥土样10g。用每毫升含60μg金霉素的灭菌蒸镏水配制每级10倍的稀释液至10-5或10-6。在铺有滤纸的培养皿内放3片10mm厚的胡萝卜片,用直径23mm的打孔器在上面打出一凹穴,加入稀释液1mL,重复3次。接种6～7d,记录发病胡萝卜饼数目。若2～6次稀释度中获得阳性结果(5,4,2,0,0)。以p1为5,p2为4,p3为2的值,查表得近似值2.2。2.1.3土粒法[20]对于不产孢子的真菌,采用将土粒接种在选择性培养基上的方法来分离计数。取少量土样加无菌水调成糊状,用圆头玻璃棒在平板上点样,适温下培养一定时间后,观察生长情况,结果以百分数表示。此方法只能得到不同土壤之间同类真菌数量的比较粗略的数据。以上3种方法中,稀释平板法是测定土壤中活菌数的一种最常用的方法,操作简便,而且可以同时从土壤中分离到较多的真菌,但由于人工培养基不能满足土壤所有真菌的 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ,因此,稀释平板法还不能反映土壤中真菌生态分布的实际情况,所得结果一般低于土壤中的实际数量,并且在测定产生分生孢子的真菌时,则往往得出过份夸大的数目。此外,土壤的分散、稀释操作、培养基成分和培养条件等原因也影响稀释平板○研究报告RESEARCHREPORT法和最大概率数值法的准确性。2.2直接计数法直接计数法在近似土壤的条件下或以各种方法固定土壤后,再计数土壤样本中的真菌。2.2.1Rossi-Cholodny埋片法将载玻片埋在土壤中,经过一定时间后镜检测定载玻片表面生长的微生物的半定量方法。真菌一般放大400～600倍,每枚标本片观察100～400个视野,以检出真菌的视野数与总视野数之比表示生育量(检出频率%)。此方法适用于测定不同时期不同土壤中真菌菌丝体丰度,然而不能测定每单位重量土壤的菌数(生育量)。2.2.2毛细管法[20]根据微生物利用土壤本身的毛细管系统输送的空气和养分而生存的原理。将灭菌的毛细管插入融化的0.2%琼脂中,然后安装在支架上,插入土壤中,一定时间后取出,用5%碳酸赤藓红染色,在显微镜下观察。此方法能显示出天然生境下的微生物区系,并分离出许多未能为平板法所揭示的微生物种,但得不出单位重量土壤中所含真菌数量。不过,反映出的数量仍可作为不同土壤之间的相对比较。2.2.3Jones-Mollison法依据Thornton(1934)等人的观点将土壤悬浮液与溶化的琼脂充分混合,再制成薄片,使土壤粒子与菌体均匀分散,提高测定总菌数的精确度。本方法适用于土壤中的真菌的菌丝量的检出频率的测定。上述3种方法由于菌体和有机物质同样被染色,要求操作熟练,但制成的标本保存时间较长。2.2.4荧光显微观察法[16]上述3种显微镜直接计数法用酸性染料染色可将菌体和土壤颗粒分开,但无法区分活菌和死菌。Strugger(1948)利用吖啶橙荧光显微镜技术解决了这一问题。一般情况下,活菌比死菌吸收染料少,在荧光镜下分别显示亮绿色和暗红色。此法可进行土壤真菌的定量测定。克拉西里尼科夫提出在土壤样品表面,直接滴加吖啶橙溶液,在落射光照明的显微镜下观察,可以在不破坏土壤结构的情况下研究真菌在土壤中空间分布的状况。还可利用添加熄灭剂来减弱土体的自体发光。Hasebe用荧光增亮剂测量真菌菌丝长度。Fradkin等观察小麦根腐病菌禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)和其它植物病原菌的分生孢子与菌丝繁殖时,用吖啶橙或铕螯合物染色,在荧光显微镜下可以明显区分真菌的各种结构。常用的荧光染料还有异硫氰酸、1-苯胺、8-萘酚磺酸镁盐、二醋酸盐和萘啶酮酸,其中后两者只染活的微生物。2.2.5荧光抗体法[16,21]用抗体和荧光素结合制成的荧光抗体试剂处理土壤样品,荧光抗体和存在于样品中的相应抗原产生特异性反应,在荧光显微镜下产生特定的荧光。如果事先制备多种模式的荧光抗体。就可对土壤样品中的相应抗原进行检验。并且荧光抗体可长期保存。本方法由荧光抗体的制备和荧光抗体标本的染色两部分组成,适用于涂抹标本、印片标本、土壤本身、埋片和土壤切片。真菌多使用菌丝的匀浆作为抗原来制备抗体[9]。荧光抗体的染色方法有直接法、间接法及补体法等。本方法可进行土壤真菌的定量测定,并且能够了解土壤真菌的组成情况。2.2.6电子显微镜直接观察法[18,20]利用电子显微镜观察土壤悬液,用热吸附法制片,可观察到少见的真菌。此方法比稀释平板法的测定结果高几百倍。但改变了土壤的自然状态,且不能得到纯培养,不能直接作菌种的鉴定。2.2.7土壤切片法[20,21]利用各种固定剂在不破坏土壤结构的条件下将土壤样本固定,制成观察微生物的剖面或薄片,再进行镜检。自从Kubiena(1938)用塑性物质固定土壤,做了直接观察土壤微生物的试验以来,其后Haarlov＆Weis-Fogh(1953,1955)等人试验以琼脂固定制作土壤薄片。Mindermpn(1956)用明胶固定土壤,再以氟化氢处理,除去砂质,可制成7.5～10μm的薄片,再用Johansen(1940)的四重染色法,可将线虫、真菌、细菌、变形虫、土粒等区分清楚。Alexander和Jackson(1954,1958)等人发明了用合成树脂固定土壤的方法,包括土样的采集、染色和洗涤、干燥、固定、切断、薄片的制作及向玻片上埋片。Heppele和Burges(1956)及Burges和Nicholas(1960)等人使用Bukelite聚合树脂S.R.17497,设计出更简便的方法,测定土壤真菌菌丝量,并用于研究土壤层次与菌量的关系。Jones和Griffiths(1969)根据Alexander等人的方法做成土壤薄片样本,进行了土壤团粒中微生物存在状态的研究。第5期梁晨等:土壤真菌分离和计数方法的探讨·517·○研究报告RESEARCHREPORT3讨论测量活菌数的间接测数法由于使用的培养基的成分组成及物理性状和土壤大不相同,不能使土壤中所有的真菌全部生长发育,虽然可获得纯培养,但是所得结果不论在数量还是类群等方面,并不能反映自然状态下土壤真菌的全部真实情况。为了克服间接测数法的局限性,避免人工培养基选择作用所造成的不足,提出了采用显微镜直接观察土壤样品中的真菌的直接计数法。随着显微镜技术和其它研究技术的发展,从普通的光学显微镜到电子显微镜;从普通染色法到免疫荧光技术,从破坏了土壤结构情况下的土壤悬液观察,发展到不打乱土壤原有结构情况下的自然生境直接观察。直接计数法虽能比较真实地显示土壤中真菌的数量和分布状况的图景,但难于鉴别真菌的种类和细胞的死活,而且不能得到纯培养。间接测数法和直接测数法都存在着不同程度的局限性,然而不论采用任何一种方法,都能在一定程度上了解土壤真菌的数量和组成,总菌数和活菌数测定结果同时获得对确切掌握土壤真菌区系的全貌必将有所裨益。由于真菌在土壤中除以菌丝状态存在外,还产生各种孢子和菌核等结构,同时真菌既可存在于土壤团粒的内部或外部,又可存在于土壤中的植物残渣上,针对不同分离目的,可采用不同分离方法。同时对分离过程中所使用的培养基,也可根据不同的研究目的有选择地加以使用。孟加拉红琼脂培养基对于计数来说最常用,松膏培养基可兼顾计数、分离和鉴定,适用于大多数土壤真菌和植物病原真菌的分离,尤其适宜于木生真菌的分离,并且孢子与菌落同步形成,菌落不扩展,可获得较好的测数结果,是一种用途广泛的培养基。参考文献:[1]章家恩,徐琪.论土壤生物的多样性保护[J].土壤,1995,27(4):169-172.[2]N.沃尔克著,中国科学院南京土壤研究所微生物译.土壤微生物学[M].北京:科学出版社,1981.189-208.[3]李阜棣.当代土壤微生物学的活跃研究领域[J].土壤学报,1993,30(3):229-236.[4]GarrettSD.Soilfungiandsoilfertility[M].Anintroductiontosoilmycology.ed.2,Exeter:Pergarnonpress,1981.1-150.[5]HydeKD.Canwerapidlymeasurefungaldiversity?[J].Mycologist.1997,11(4):176-178.[6]JohnsonLF,CurlEA.Methodsforresearchontheecologyofsoil-borneplantpathogens[M].Minncapolis:MinnBurgessPublishingCompany,1972.1-274.[7]ParkinsonD,WaidJS.Theecologyofsoilfungi[M].Liverpool:LiverpoolUniversityPress,1960.22-27.[8]BuxtonEW,KendrickJBJr.AmethodofisolatingPythiumspp.andFusariumoxysporumfromsoil[J].Ann.Appl.Biol.,1963,51(2):215-221.[9]BoosalisMG,ScharenAL.MethodformicroscopicdetectionofAphanomyceseuteichesandRhizoctoniaSolaniandforisolationofRhizoctoniasolaniassociatedwithPlantdebris[J].Phytopathology,1959,49(4):192-198.[10]方中达.植病研究方法[M].北京:农业出版社,1977.112-126.[11]DurbinRD.TechniquesfortheobservationandisolationofsoilmicroorganismsBot[J].Rev.1961,27(4):522-560.[12]MenziesJD.Thedirectassayofplantpathogenpopulationsinsoil[J].AnnualReviewofPhytopathology,1963,1:127-142.[13]MosseB.Advancesinthestudyofvesicular-arbuscularmycorrhiza[J].AnnualReviewofPhytopathology,1973,11:171-196.[14]俞大绂.植物病理学和真菌学技术汇编(卷二)[M].北京:人民教育出版社,1977.327-357.[15]SchmitthennerAF.SignificanceofpopulationsofPythiumandphytophthorainsoils[A].In:ToussounTA,etal.RootdiseasesandSoil-borne.PathogensBerkely[C]:UniversityCaliforniaPress.25-27.[16]许光辉,郑洪元.土壤微生物分析方法手册[M].北京:农业出版社,1986.92-108.[17]武觐文.氧化松针煮汁培养基———一种选择性真菌培养基[J].微生物学报,1975,15(1):37-41.[18]武觐文,高宗庆,姚俊梅.培养真菌的试剂松膏和松膏培养基[J].真菌学报,1985,4(3):185-192.[19]MartinJP.Useofacid,roseBengal,andstreptomycinintheplatemethodforestimatingsoilfungi[J].SoilSci.1950,69(3):215-232.[20]中国科学院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京:科学出版社,1985.54-58.[21]叶维青,张维谦,周鹏里等.土壤微生物实验法[M].北京:科学出版社,1983.30-62.·518·沈阳农业大学学报第31卷○研究报告RESEARCHREPORT