OECD遗传毒性最新修订指导原则的解析_周长慧

ChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2052中国新药杂志2015年第24卷第18期［作者简介］周长慧，女，硕士，主要从事遗传毒理研究。联系电话:(021)50800333－116，E-mail:chzhou@ncdser．com。［通讯作者］常艳，女，药理学博士，研究员，主要从事新药非临床安全性评价研究。联系电话:(021)50800333－208，E-mail:ychang@ncdser．com。·新药申报与审评技术·OECD遗传毒性最新修订指导原则的解析周长慧1，王征1，涂宏刚1，黄芳华2，王庆利2，常艳1(1国家上海新药安全评价研究中心，上海201203;2国家食品药品监督管理局药品审评中心，北京100038)［摘要］基于新技术方法的呈出、管理需求的变化和动物福利的考虑，世界经济合作与发展组织(Or-ganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)化学品检测的指导原则定期得到回顾修订。2014年9月26日，OECD正式生效了几项遗传毒性试验指导原则的最新修订版，包括体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、体外哺乳动物细胞微核试验、哺乳动物红细胞微核试验和哺乳动物骨髓染色体畸变试验，同时新增了体内啮齿类碱性彗星试验的指导原则。本文对最新修订版的指导原则与旧版本的指导原则进行对比分析，阐述主要差异点，为国内遗传毒性评价工作的深入开展和遗传毒性指导原则的修订完善提供指导线索。［关键词］世界经济合作与发展组织(OECD);遗传毒性;指导原则［中图分类号］Ｒ99［文献标志码］A［文章编号］1003－3734(2015)18－2052－08AnalysisoftheupdatedOECDtestguidelinesongenotoxicityZHOUChang-hui1，WANGZheng1，TUHong-gang1，HUANGFang-hua2，WANGQing-li2，CHANGYan1(1NationalShanghaiCenterforNewDrugSafetyEvaluation＆Ｒesearch，Shanghai201203，China;2CenterforDrugEvaluation，StateFoodandDrugAdministration，Beijing100038，China)［Abstract］GuidelinesoftheOrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment(OECD)forthetestingofchemicalsareperiodicallyreviewedinthelightofscientificprogress，changingregulatoryneedsandani-malwelfareconsiderations．ThemodifiedversionsofsomeOECDtestguidelinesongenetictoxicologywereadoptedon26September，2014，includingtheinvitromammalianchromosomeaberrationtest，invitromammaliancellmi-cronucleustest，mammalianerythrocytemicronucleustestandmammalianbonemarrowchromosomeaberrationtest．Anewtestguidelineoninvivoalkalinecomet(singlecellgelelectrophoresis)assaywasadded．Thecontrastivea-nalysisoftheupdatedtestguidelineswiththeoldoneswasreviewedandthemaindifferenceswerepresented．ThesemayprovidesomekeycluesforthedevelopmentofgenotoxicityworkandtherevisionofthegenotoxicityguidelineinChina．［Keywords］OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment;genotoxicity;testguidelines遗传学损伤的诱导和蓄积可导致基因组不稳定，这是恶性肿瘤形成的关键步骤［1］。采用遗传毒性试验评价化合物的遗传毒性，对预测化合物的致癌性有重要的参考意义。目前中国对药物的遗传毒性评价主要遵循的指导原则(testguidelines，TGs)有国家食品药品监督管理总局(ChinaFoodandDrugAdministration，CFDA)于2007年颁布的药物遗传毒性研究技术指导原则［2］、人用药品注册技术要求国际协调会议(InternationalConferenceonHarmoniza-tionofTechnicalＲequirementsforＲegistrationofPhar-maceuticalsforHumanUse，ICH)于2011年颁布的S2(Ｒ1)［3］，世界经济合作与发展组织(OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)ChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2053中国新药杂志2015年第24卷第18期陆续颁布的TGs［4］则提供了实验方法学的重要参考。当前被OECD正式批准并现行的化学品遗传毒性评价指导原则TGs主要有细菌回复突变试验(TG471)［5］、体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)［6］、哺乳动物红细胞微核试验(TG474)［7］、哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)［8］、体外哺乳动物细胞基因突变试验(TG476)［9］、体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验(TG486)［10］、体外哺乳动物细胞微核试验(TG487)［11］、转基因啮齿类体细胞和生殖细胞基因突变试验(TG488)［12］等。34个OECD成员国和其他合作国家相互承认数据(mutualacceptanceofdata，MAD)，这就要求在TGs和GLP条件下获得的数据被监管机构相互接受。OECDTGs由成员国和其他相关机构的专家达成一致意见，OECDTGs有普遍的科学性和接受度。因此，OECD遗传毒性TGs被认为是实施常规遗传毒性试验的金标准。大部分现行的OECD遗传毒性TGs的最终修订是在20世纪90年代中期，随着对遗传毒性认识的不断提高，遗传毒性新技术和新方法得到完善与发展，尤其是一些体内外遗传毒性试验方法的国际联合验证，积累了丰富的数据，如流式细胞术检测体内微核试验［13－14］和体内彗星试验［15］等。同时体外哺乳动物细胞试验阳性率过高的情况引起了广泛的关注［16］。自2010年起，OECD陆续启动了TGs的修订工作，并在OECD网站公示修订草案，搜集公众公开评论意见。除修订外，一些很少用的或者有更好替代方法的指导原则被确定为删除/废除的候选。此外，还发展和新增一些新的遗传毒性试验方法的TG。2014年9月26日，OECD正式生效了几项遗传毒性试验指导原则的最新修订版，包括TG473，TG474，TG475和TG487，此外新增了体内啮齿类碱性彗星试验的指导原则(TG489)［17］。本文主要对最新修订版的指导原则与旧版本的指导原则(TG473-1997，TG474-1997，TG475-1997和TG487-2010)进行对比分析［18－21］，使用图 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 形式比较直观地阐述主要差异点，为国内遗传毒性指导原则的修订完善和遗传毒性评价工作的深入开展提供指导线索。1体外试验1．1体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473)最初于1983年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订，TG473-2014反映了这30年里体外哺乳动物染色体畸变试验各项操作、技术要点和数据解释方面累积的经验。表1反映了TG473-2014与TG473-1997的主要差异点。表1TG473-2014与TG473-1997的主要差异点序号TG473-2014TG473-19971．1．1染色体畸变试验最好考虑所用细胞的p53状态、核型稳定性、DNA修复能力及来源(啮齿类/人源性)等。无1．1．2该试验方法用来检测因断裂剂造成的染色体损伤。染色体畸变分析必须使用中期相细胞，因此细胞在供试品处理和未处理的培养体系中都必须达到有丝分裂。对于纳米材料该指导原则可能需要特别改动，但是未列在该指导原则中。该试验用来筛选可能的哺乳动物诱变剂和致癌物。许多在该试验中阳性的化合物都是哺乳动物致癌物，但是该试验与致癌试验也无很好的相关性。这种相关性取决于化合物类型，且更多证据表明有一些致癌物不能通过该试验方法检出，因为它们的作用机制不是与DNA直接损伤有关。1．1．3可用CHO，V79，CHL/IU，TK6或原代培养细胞，包括人及其他哺乳动物外周血淋巴细胞。人外周血淋巴细胞应来自年轻(约18～35岁)、无吸烟史、无已知疾病且最近未接触遗传毒性物质(如，化学试剂、电离辐射)的献血者，因为以上因素将会引起染色体畸变背景值的升高。这将有助于保证染色体畸变的背景值。随着年龄的增加，染色体畸变率亦随之增加，这一点女性比男性明显。若细胞来自不同的献血者，献血者的数目需详细说明。由于不同细胞周期对供试品的敏感程度不一样，故应将处于不同细胞周期的细胞暴露于供试品。不推荐使用同步细胞进行试验，但只要证据合理也可以接受。该试验可使用多种细胞系、细胞株或原培养细胞(如中国仓鼠成纤维细胞、人或其他哺乳类动物外周血淋巴细胞)。ChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2054中国新药杂志2015年第24卷第18期续表1序号TG473-2014TG473-19971．1．4明确培养条件(培养瓶/皿，5%CO2，37℃加湿培养等);所用细胞株必须定期确认型稳定且无支原体污染;试验室建立的细胞周期时间应与公开发表的细胞特征一致。培养条件包括合适的细胞培养基、培养条件(培养瓶/皿、CO2浓度、温湿度);所用细胞株必须定期确认型稳定且无支原体污染;必须已知正常的细胞周期的细胞培养条件。1．1．5在供试品处理之前，固体供试品必须溶解于合适的溶媒中，并根据需要进行稀释。在供试品处理之前，固体供试品必须溶解或重悬在合适的溶媒中，并根据需要进行稀释。1．1．6新增对所选溶剂的详细描述:如有机溶剂不应超过总体积的1%，水溶剂不应超过总体积的10%等;若所用溶剂(如乙醇、丙酮)无背景数据，试验应再设置未经任何处理的阴性对照组来证实所选溶剂无毒或无断裂性。NA1．1．7一般平行处理2皿，若能获得足够细胞数，可用单皿，尤其当供试品超过3个检测浓度;一般供试品的浓度间距为2～3倍，在一些情况下，如供试品具有较陡峭的浓度反应关系，则可适当缩小间距或将检测的浓度加至3个以上;最高浓度的细胞毒性应在(55±5)%(计算指标为ＲICC，ＲPD)，而对于原代培养的淋巴细胞MI的减少为同步阴性对照的(45±5)%。供试品的浓度间距在槡2～10;最高浓度的细胞毒性表现为细胞融合率、细胞数和有丝分裂指数均大于50%。1．1．83种处理条件均应进行(+S9短时处理、－S9短时处理及－S9长时处理)。先进行+S9短时处理、－S9短时处理，若2种条件均为阴性结果，则再进行－S9长时处理。1．1．9即使细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上，也只需检测1个沉淀浓度。当细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上时，建议检测多个沉淀浓度。1．1．10对于易溶无毒物质，最高浓度应为10mmol·L－1，2mg·mL－1或2μL·mL－1(选用较低者)，但若供试品组分不明确(如组分未知或多种组分、复合反应的产物或生物材料、环境提取物等)，最高浓度可选5mg·mL－1。对于相对无毒物质的最高浓度设为5mL·mL－1，5mg·mL－1或0．01mol·L－1(选用较低者)。1．1．11无代谢活化系统的阳性物包括甲基磺酸甲酯、丝裂霉素C、4-硝基喹啉-N-氧化物、阿糖胞苷无代谢活化系统的阳性物包括甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯、乙基亚硝基脲、丝裂霉素C、4-硝基喹啉-N-氧化物1．1．12收获细胞时若有证据表明与阴性对照相比，供试品组有丝分裂细胞显著增加，则在去除含供试品的培养基时，通过离心收集培养基中的细胞，避免中期相细胞损失而影响染色体畸变的评价。NA1．1．13每个浓度应分析300个分散良好的中期相细胞，增加统计能力，且很少观察到零值(预期仅有5%)。染色单体与染色体型畸变应分开记录，同时应区分亚型(断裂、交换)。染色体阅片过程必须由经良好 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的阅片人员来进行，且必要时进行同行评议。每个浓度应分析200个分散良好的中期相细胞。1．1．14新增对试验室的资质/熟练程度的要求:对于新开展该试验的试验室，应选用不同作用机制的阴性及阳性对照品进行试验，且结果应与文献报道一致;已经有经验/背景数据的试验室，该条不做要求。NA1．1．15详述历史背景对照数据库的建立:应具有历史阴性及阳性对照数据库;历史对照数据库至少包含10个试验的数据，最好为20个试验;建立的历史对照数据库应可控;试验方案的任何大改变都将导致需要建立新的历史对照数据库;超出历史对照范围95%的数据并非不可接受。NA1．1．16新增试验成立条件:阴性畸变率在历史阴性对照范围内;阳性畸变率在历史阳性对照范围内，且较阴性显著增加;细胞毒性数据;3个处理条件;有足够的浓度及细胞用于分析;最高浓度的设计符合要求。NAChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2055中国新药杂志2015年第24卷第18期续表1序号TG473-2014TG473-19971．1．17新增阴性及阳性的判断标准:在任一处理条件下，同时满足以下三条可判断为阳性:任一浓度的畸变率显著增高，且有浓度反应关系，且畸变率在历史阴性对照范围外;阴性判断标准:任一浓度的畸变率均未显著增高，且无浓度反应关系，且畸变率在历史阴性对照范围内;可疑结果可通过改变试验条件进行评价，如增加镜检细胞数、改变试验浓度、改变代谢活化系统等。NANA，不适用;ＲICC，细胞相对增加率;ＲPD，相对细胞倍增数1．2体外哺乳动物细胞微核试验(TG487)体外哺乳动物细胞微核试验(TG487)最初于2010年生效，TG487-2014反映了这几年里体外哺乳动物染色体畸变试验各项操作、技术要点和数据解释方面积累的经验。TG487-2014与体外哺乳动物染色体畸变试验(TG473-2014)有一些共性的更新点，如1．1．3～1.1．5，1．1．9～1．1．10，1．1．14～1．1．17，除此之外TG473-2014与TG473-1997主要差异点见表2。表2TG473-2014与TG487-2010的主要差异点序号TG487-2014TG487-20101．2．1详述细胞株的要求:培养的人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞、啮齿类细胞系(CHO，V79，CHL/IU和L5178Y)或人源细胞系TK6;此外，HT2，Caco-2，HepaＲG，HepG2，A549和原代叙利亚仓鼠胚胎细胞虽未被广泛验证，但也已用于微核试验。由于有报道CytoB会影响L5178Y生长，故不推荐用于微核试验。常用细胞株为培养的人外周血淋巴细胞、啮齿类细胞系(CHO，V79，CHL/IU和L5178Y)。1．2．2用流式细胞仪检测微核时一般不使用CytoB。NA1．2．3一般平行处理2皿，若能获得足够细胞数，可用单皿，尤其当供试品超过3个检测浓度;一般供试品的浓度间距为2～3倍，在一些情况下，如供试品具有较陡峭的浓度反应关系，则可适当缩小间距或将检测的浓度加至3个以上。至少3个可分析浓度，有时需要在一个实验里设置多个小间距的浓度以合适范围的细胞毒性。此外替代方法是开展一个浓度范围确定试验来缩小正式试验的浓度范围。1．2．4明确细胞毒性指标:无CytoB时最高浓度的细胞毒性推荐的指标ＲICC，ＲPD的减少应在50%～60%;有CytoB时最高浓度的细胞毒性推荐的指标CBPI或ＲI的减少应为40%～50%。最高浓度的细胞毒性应在50%～60%。1．2．5增加的表1为参考阳性对照品。－S9断裂剂:甲基磺酸甲酯、丝裂霉素C、4-硝基喹啉-N-氧化物、阿糖胞苷+S9断裂剂:苯并芘、环磷酰胺非整倍体诱导剂:秋水仙素、长春碱NANA，不适用;ＲICC，细胞相对增加率;ＲPD，相对细胞倍增数;CytoB，细胞松弛素B2体内试验2014年OECD更新的体内试验有2个，即哺乳动物红细胞微核试验(TG474)和哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)，TG474-2014和TG475-2014均强调了实验室熟练度确认的要求，即在进行常规试验之前，实验室必须具备足够的经验开展此项试验。实验室必须有能力复制出至少2个阳性对照品和平行的赋形剂对照品预期的结果，能重现出剂量依赖性增加，并能证实采用骨髓或外周血的试验系统的灵敏度和动态范围。建立历史对照阴性和阳性对照范围和分布，文献建议历史对照数据库包含相同试验条件下的至少10个、最好20个试验的数据。若有充分的历史对照数据的实验室则无需开展熟练度确认试验。此外，体内试验可以不设置阳性对照给药组，但是每个实验必须有阳性对照的计数样本(如固定但尚未染色的玻片或血样)。可通过定期(如6～18个月)独立开展阳性对照试验获得合数数量的参考样本。2．1哺乳动物红细胞微核试验(TG474)哺乳动物红细胞微核试验(TG474)最初于1983年生效，ChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2056中国新药杂志2015年第24卷第18期30年来分别在1997年和2014年经历2次修订。TG474-2014适应了新技术方法的更新成熟，并重视试验的科学性和动物福利。TG474-2014对镜检或自动化检测成熟红细胞中的微核都认可，并建议将体内微核试验与其他一般毒性试验或遗传毒性试验进行整合。但是用自动化方法检测骨髓或外周血微核更便利，对比研究表明有合适的校准标准的自动化检测方法，较镜检有更好的实验室间和实验室内重复性和灵敏度［22－23］。自动化检测方法包括且不限于流式细胞仪、图像分析系统以及激光扫描仪。表3 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 了TG474-2014与TG474-1997主要差异点。表3TG474-2014与TG474-1997的主要差异点序号TG474-2014TG474-19972．1．1检测外周血中的微核，必须证实脾脏清除循环血中含微核的细胞，不会折中微核的检测。小鼠和大鼠的外周血已经明确证实。若使用除大鼠和小鼠以外的动物外周血， 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 中必须提供足够的科学理由。使用啮齿类以外的动物，推荐可将微核检测整合入其他毒性试验中。推荐小鼠外周血用于微核的检测。然而，只要脾脏无代谢清除含微核的红细胞或对染色体结构或数目畸变有充分的灵敏度的物种的外周血都可用于微核的检测。2．1．2啮齿类动物同一性别必须成群饲养(每笼不超过5只)，最好用有一定环境丰富的有底笼。若动物单只饲养必须有充分的科学理由。此外，避免阳性对照和供试品之间交叉污染。动物单只饲养，或者同一性别动物成群饲养。2．1．3给药前，固体供试品必须溶解或重悬于适当的溶媒中，或与食物或饮水进行混合。液体供试品可直接给药或给药前进行稀释。对于吸入给药，根据供试品的理化性质，供试品可以气体、蒸汽或固液气雾的形式给药。通常可以使用的溶剂/赋形剂包括水、生理盐水、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、橄榄油和玉米油。如果没有历史对照或发表的数据显示某种非典型的溶媒无微核诱导作用或其他有毒害的作用，则需要开展预试验证实该赋形剂是否可以采用。给药前，固体供试品必须溶解或重悬于适当的溶媒中，并稀释。液体供试品可直接给药或给药前进行稀释。2．1．4每个试验通常包含阳性对照组，但如果实验室能熟练开展微核试验，且建立一套历史对照阳性数据，则无需每次试验设置阳性对照。若不设置阳性对照，计数的对照样本(固定未染色的片子或细胞液样品)必须包括在每个试验中。可以定期(如每6～18个月)开展独立的阳性对照试验制备这些对照样本。若需要可在熟练度试验中获得对照样本或之后定期开展试验获得。每个试验必须包含同步的阳性和阴性(赋形剂)对照给药组。2．1．5阳性对照品举例:甲基磺酸乙酯、甲基磺酸甲酯、乙基亚硝基脲、丝裂霉素C、环磷酰胺(一水合物)、曲他胺、秋水仙素或长春新碱(作为非整倍体诱导剂)阳性对照品举例:甲基磺酸乙酯、乙基亚硝基脲、丝裂霉素C、环磷酰胺(一水合物)、曲他胺2．1．6一般来说，雄性和雌性动物中微核反应是相似的，因此大多数试验可以在任一性别动物中开展。若有数据证明雌雄动物微核差异很大(系统毒性、代谢、生物利用度、骨髓毒性等差异明显)，提倡采用两种性别动物开展试验。这种情况下，采用2种性别动物，且可以作为重复毒性试验的一部分，此时可采用析因设计。若有数据证实使用同一种属同样给药途径，毒性无性别差异，则可以使用单性别动物。此外，如果人体用药是性别特异性的，则动物实验也选择该性别动物。2．1．7高剂量也可以定义为骨髓毒性的剂量(如未成熟红细胞占整个红细胞的比值减少超过50%但不少于阴性对照的20%)。但是，当分析外周血中CD71-阳性细胞(如用FCM)时，这部分未成熟红细胞对毒性的反应比ＲNA-阳性未成熟红细胞更大。因此，若试验给药5d(或5d以下)，高剂量可定义为产生未成熟红细胞/整个红细胞的比值显著减少的剂量，但是不低于对照组的5%。若供试品有动态毒性饱和的特征或长期给药有解毒的特性，则不适用上述剂量设置的标准，必须具体问题具体分析。NA2．1．8给药14d及以上最高剂量为1000mg·kg－1bw·d－1，给药14d以下最高剂量为2000mg·kg－1bw·d－1给药14d以上最高剂量为1000mg·kg－1bw·d－1，给药14d及以下最高剂量为2000mg·kg－1bw·d－1。2．1．9给药途径包括饮食、饮水、局部皮下、静脉、口服(灌胃)、吸入、气管内或移植等。一般不推荐腹腔注射，因为这不是人体暴露方式，除非有特别的科学理由。给药容量除水溶液最大可达到2mL·100g－1bw，其他一般不超过1mL·100g－1bw。供试品通常用灌胃针或插管灌胃给药或腹腔注射，给药容量不超过2mL·100g－1bw。ChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2057中国新药杂志2015年第24卷第18期续表3序号TG474-2014TG474-19972．1．10若给药2次(每24h给药1次)，在末次给药后18～24h采集骨髓，在36～48h采集外周血。给药3次及3次以上(约每24h给药1次)，末次给药后不晚于24h采集骨髓，不晚于40h采集血样。此给药方案也便于微核试验与彗星试验整合(需末次给药后2～6h采样)，以及微核试验与重复给药毒性试验整合。若给药2次或2次以上(每24h给药1次或多次)，则在末次给药后18～24h采集骨髓，在36～48h采集外周血。2．1．11一般临床观察每天至少1次，最好每天同一时间(段)，同时考虑给药后预期的高峰期。给药期每天至少2次观察濒死和死亡。所有试验开始时和安乐死时必须称体重，重复给药至少每周1次。若给药1周以上，则至少每周称量1次摄食量。NA2．1．12必须在合适的时间点采血，允许考察供试品的血浆浓度，证实在骨髓中有暴露。NA2．1．13供试品骨髓暴露的证明包括未成熟红细胞与成熟红细胞的比值降低或检测供试品血浆或血液浓度。但是静脉给药，不需要暴露证据。此外，也可以开展一个独立的试验(相同的给药方式和种属)获得ADME数据证实给药暴露量。阴性结果表明在本实验条件下，供试品不会诱导该种属动物未成熟红细胞的微核。NA2．1．14人工和自动化分析:计算未成熟红细胞占所有红细胞比例时，骨髓细胞至少计数500个红细胞，外周血必须计数2000个红细胞;计算未成熟红细胞中微核率时，每只动物至少计数4000个未成熟红细胞。若阴性历史对照数据库的背景低于0．1%时，需要计数更多的未成熟红细胞。当采用流式细胞术计数CD71+的未成熟细胞时，给药组未成熟细胞占全部红细胞的比例不得低于阴性/赋形剂对照组的5%。计算未成熟红细胞占所有红细胞比例时，骨髓细胞至少计数200个红细胞，外周血必须计数1000个红细胞;计算未成熟红细胞中微核率时，每只动物至少计数2000个未成熟红细胞。2．1．15接受标准:①平行的阴性对照数据可以添加至本实验室的历史对照数据库中;②平行的阳性对照在历史阳性对照范围内，且与平行的阴性对照相比有统计学显著增加;③足够的剂量组和细胞可用于分析;④高剂量的选择标准符合要求。NA2．1．16对结果的评价和解释:阳性判定标准:①至少1个剂量组诱导微核率显著增加;②微核率的增加在某个采样点有剂量反应关系;③结果在历史阴性对照数据分布以外(如泊松分析95%控制限)。阴性判定标准:①无一剂量组诱导微核率显著增加;②在任一采样点均无剂量反应关系;③所有结果均在历史阴性对照数据分布内(如泊松分析95%控制限)。有时结果不是明确阴性或阳性，为了帮助确定结果的生物相关性，结果必须经过专家评判和/或进一步检查现已完成的试验。有时候需要分析更多的细胞数或改变实验条件重复试验。有多个标准判定结果为阳性，如微核率有剂量依赖性增加，或单个剂量在某个采样点微核率明显增加。不符合阳性判定标准的结果则认为是阴性结果。有时即使重复试验，结果也是模棱两可或可疑的。2．1．17试验报告要求中增加项:如供试品中增加对单组份和多组分的描述说明;试验动物中增加唯一标识的方法，试验末期的动物体重，多次给药的摄食量;试验条件增加安乐死方法、镇痛方法(如有)、确定微核是染色体片段还是整条染色体的方法(如可行);结果中增加历史阴性和阳性对照范围、平均数、标准差、95%分布控制限;有数据证实骨髓暴露;确定微核是染色体片段还是整条染色体(如可行);符合阴性还是阳性标准。NA2．1．18附录中增加采用析因设计确认性别差异。NANA，不适用;FCM:流式细胞术ChineseJournalofNewDrugs2015,24(18)2058中国新药杂志2015年第24卷第18期2．2哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)哺乳动物骨髓染色体畸变试验(TG475)最初于1984年生效，30年来分别在1997年和2014年经历2次修订。TG475-2014与TG474-2014有一些共性的更新点，如2．1．11～2．1．12，2．1．15～2．1．18，除此之外主要差异点见表4。表4TG475-2014与TG475-1997的主要差异点序号TG475-2014TG475-19972．2．1如果使用除大小鼠外的种属，在报告中需说明选择依据，同时推荐将该实验整合在其他毒性试验中。其他种属动物和组织不适用于该指导原则2．2．2若将该试验整合入重复给药毒性试验中，则必须慎重，避免毒性剂量组中染色体受损的中期相细胞的丢失。此外，只有重复给药毒性试验的最高剂量高于或等同于本试验最高浓度要求时才能整合。NA2．2．3阳性对照品列表中增加曲他胺。NA2．2．4每只动物至少分析200个中期相细胞。若阴性历史对照数据库的背景低于0．1%时，需要计数更多的细胞。每只动物至少分析100个中期相细胞。NA，不适用3讨论2014年9月，OECD最新更新的4篇指导原则整体上存在修订的共性，如要求做实验室资质确认试验(即实验室熟练度要求);要求建立阴性和阳性历史对照数据库，并对建库方法进行了建议说明;细化了试验结果的判定标准;不管是染色体畸变试验还是微核试验，对样本量要求都加大甚至翻倍等。这在一定程度上均能提高遗传毒性试验数据的科学性和可靠性。此外，最新体外试验指导原则对体外细胞株的选择、沉淀浓度的使用和细胞毒性检测方法等提出更多建议;体外试验最高浓度的降低也反映了ICHS2(Ｒ1)的修订变化［3，24］，但是OECDTG的最高浓度高于ICHS2(Ｒ1)的要求，OECDTG适用于所有化学品的检测，人用药物遵循ICHS2(Ｒ1)的要求，因为ICHS2(Ｒ1)界定的1mmol·L－1的浓度限值远远高于目前药物的临床暴露量(包括组织蓄积)，也高于目前临床前体内试验的暴露量。OECDTG743和TG487中界定的10mmol·L－1或2mg·mL－1也并未降低体外试验预测啮齿类致癌物的灵敏度和特异性［25］，但是对降低体外试验的假阳性作用也很有限，建议更多从细胞系的选择、细胞毒性检测方法、非生理条件和代谢活化系统等角度降低体外试验的假阳性率。OECD对于体内遗传毒性试验TG的修订，更多考虑了动物实验的3Ｒ(替代、减少和优化)原则，除建议使用经过充分验证的自动化检测方法外，还要求在可行的条件下进行将遗传毒性试验方法整合入重复毒性试验中，获得暴露水平，细化了阴性和阳性结果的接受标准。此外，OECD新增了TG489(体内啮齿类碱性彗星试验)，以此替代了体内UDS试验方法。建议将体内彗星试验与重复给药毒性试验、体外微核试验等进行整合，暴露和所研究组织的选择应基于受试物可获得的所用信息，如人体拟用途径、代谢和分布、潜在作用接触部位、结构警惕及其他毒性资料。总之，OECD最新TG反映了十多年来几个常规遗传毒性试验方法的最新进展，也对遗传毒性实验室开展遗传毒性试验提出了更多技术要求，这有助于提高对化学品(尤其是药物)安全评价的准确性，也对国内遗传毒性指导原则的修订提供指导和参考。［参考文献］［1］STＲATTONMＲ，CAMPBELLPJ，FUTＲEALPA．Thecanc-ergenome［J］．Nature，2009，458(7239):719－724．［2］国家食品药品监督管理总局．药物遗传毒性研究技术指导原则:ZHGPT2-1(2007)［EB/OL］．［2015－07－28］．http://www．sda．gov．cn/WS01/CL1616/90936．html．［3］InternationalConferenceonHarmonization．Guidanceongenotox-icitytestinganddatainterpretationforpharmaceuticalsintendedforhumanuseS2(Ｒ1)［EB/OL］．(2011－11－30)［2014－11－06］．http://www．ich．org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_Ｒ1/Step4/S2Ｒ1_Step4．pdf．［4］OECD．IntroductiondocumenttotheOECDTestGuidelines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